技术领域
本发明属于药物筛选领域，具体涉及DNA编码化合物库筛选的方法，尤其涉及一种将细胞膜分离以便对跨膜蛋白进行DNA编码化合物库筛选的方法。
背景技术：
DNA编码化合物库作为一种新型的小分子药物筛选方法，能极大地提高药物筛选的通量和速度，减少人力和物力成本，提高筛选效率。已知跨膜蛋白难以被纯化并保持原有结构，因此使用DNA编码的化合物针对跨膜蛋白的筛选方法非常少，现有技术没有能将跨膜蛋白保持结构进行全面的DNA编码化合物库的筛选的办法。现仅有一种以活细胞为载体亲和筛选方法。这个方法的局限性在于DNA编码的化合物因为分子大小以及带电荷的原因，仅能针对细胞表面部分，不能有效地穿过细胞膜进入细胞内部，因此无法对跨膜蛋白的细胞内区域进行筛选。此外，这种方法对蛋白的表达量要求很高，结果的signal-to-noise ratio（信号干扰比）也比较低，难以得到有效的数据。另一种办法是将跨膜蛋白纯化再进行筛选，这种方法会导致蛋白难以保持原有结构和生物活性，得到有效化合物的成功率会很低。
中国发明专利申请CN1646917A公开了鉴定与跨膜蛋白相互作用的化合物的方法，此方法通过分离细胞膜成分，来确定在该细胞膜上的含有核定位序列的跨膜蛋白水平，并由此跨膜蛋白的水平变化来确认候选化合物与跨膜蛋白有相互作用。该方法是针对传统的高筛选的形式，作为鉴定筛选过后的化合物是否产生了效果的一种验证方式，并不能提高筛选的通量，降低筛选成本。
因此，亟需研发一种对跨膜蛋白进行DNA编码化合物库筛选的方法，以克服上述缺陷。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种将细胞膜分离以便对跨膜蛋白进行DNA编码化合物库筛选的方法，为解决现有技术存在的问题，该方法利用物理方法将细胞打碎并分离出细胞膜部分，以尽量保持蛋白原有结构，并用来进行DNA编码化合物库的筛选，以有效的针对跨膜蛋白细胞外及细胞内区域的药物筛选。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种将细胞膜分离以便对跨膜蛋白进行DNA编码化合物库筛选的方法，包括如下步骤：
（1）用物理方法打碎细胞；
（2）进行第一轮离心，分离出可溶性的物质和细胞膜，沉淀不可溶的细胞结构；
（3）进行第二轮高速离心，将细胞膜从可溶性的细胞物质中沉淀出来；
（4）在显微镜下验证分离出来的细胞膜的状态；
（5）以细胞膜为载体，对跨膜蛋白进行DNA编码化合物库的筛选。
作为本发明优选的技术方案，在步骤（1）中，所述的物理方法包括homogenizer（均化器，均质器，高速搅拌器）, bead beater（珠打浆机）, sonication（声波降解法）。
作为本发明优选的技术方案，在步骤（1）之前增加如下步骤：将细胞种在培养板上，使其长成一层均匀的单层细胞；将细胞用刮刀刮入缓冲液中。
作为本发明优选的技术方案，所述缓冲液成分为20mM HEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸）, 250mM Sucrose（蔗糖）, 10mM KCl, 2mM MgCl2, 1mM EDTA（乙二胺四乙酸）, 1mM EGTA（乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸）, 在使用前加入1mM DTT（二巯基苏糖醇）和protease inhibitor cocktail（蛋白酶抑制剂鸡尾酒）, pH为 7.4。
作为本发明优选的技术方案，在步骤（2）中，所述的第一轮离心，其速度为10,000g的离心力，时间为10分钟，温度为4摄氏度。
作为本发明优选的技术方案，在步骤（3）中，所述的第二轮高速离心，其速度为100,000g的离心力，时间为1小时，温度为4摄氏度。
作为本发明优选的技术方案，在步骤（5）中，筛选过程具体依次包括：清洗、加热、高速离心；筛选过程中，用高速离心来分离可溶和细胞膜的成份，以便分离没有与蛋白结合的化合物；通过加热使蛋白质变性，使得结合的化合物从蛋白质上脱落，进入溶液，并进入下一轮筛选；总共进行一至三轮筛选，直到提取出的DNA编码化合物的总量在1X107至1X109范围内。
作为本发明优选的技术方案，在步骤（5）中，所述高速离心，其速度为100,000g的离心力，时间为45分钟，温度为4摄氏度；所述加热温度为80摄氏度，加热时间为10分钟。
作为本发明优选的技术方案，在步骤（5）中，所述清洗具体为：将DNA编码化合物库加入含细胞膜的筛选液中，反应、离心，用筛选液冲洗；所述筛选液的成分为50mM Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）, 150mM NaCl, 0.1% v/v Tween20（吐温20）, 250mM Sucrose（蔗糖）， 0.5mM EDTA, 1mM DTT（二巯基苏糖醇）, 1mg/mL fish sperm DNA（鱼精DNA），1mg/mL BSA（牛血清白蛋白），pH 为7.5。
作为本发明优选的技术方案，在步骤（5）之后增加如下步骤：
（6）经过总共1-3轮步骤（5）的筛选后，将结果进行二代测序，以解码化合物结构；
（7）进行功能试验验证化合物功能。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种有效的针对跨膜蛋白的筛选办法，避免了跨膜蛋白在纯化过程中失去原有结构的问题，同时避免了活细胞筛选DNA编码化合物库不能进入细胞内的问题。这种方法能使得DNA编码化合物库筛选有效的应用在跨膜蛋白靶点上，本发明分离的细胞膜是作为筛选前的靶点蛋白的制备工作，细胞膜在本方法中是作为固定靶点蛋白的载体而起作用，相对于传统的高通量筛选，提高了对跨膜蛋白药物筛选的通量，从<1000万种化合物增加到>100亿种化合物，并能覆盖更大的结构空间。同时可以提高筛选效率，从9-18个月，减少到3-6个月。降低筛选成本，包括人力和物料的成本。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明方法的流程示意图。
图2是本发明实施例1的qPCR结果示意图。
图3是本发明实施例2的测序结果的数据分析结果示意图。
图4是本发明实施例2的化合物A的IC50结果示意图。
具体实施方式
现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。
实施例1：对ETa受体进行阳性化合物的筛选以确认方法的可行性
一、背景：ETa(受体）属于GPCR，是一种有多个跨膜区域的蛋白，难以在被纯化的同时保持生物活性和结构
二、实施方法：
如图1所示，该方法具体包括如下步骤：
1.将表达ETa 受体的细胞种在T75的培养瓶内，使其长成一层均匀的单层细胞；
2.将细胞用刮刀刮入3毫升的缓冲液中；
3.缓冲液成分为20mM HEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸）, 250mM Sucrose（蔗糖）, 10mM KCl, 2mM MgCl2, 1mM EDTA（乙二胺四乙酸）, 1mM EGTA（乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸）, 在使用前加入1mM DTT（二巯基苏糖醇）和protease inhibitor cocktail（蛋白酶抑制剂鸡尾酒）, pH 7.4；
4.用5mL 27gauge直径的针管（Gauge为针头直径的单位）来回抽取10次，将细胞打碎；
5.将打碎后的细胞放置在冰上20分钟；
6.进行第一轮离心，分离出可溶性的物质和细胞膜，沉淀不可溶的细胞结构：用10，000g的离心力在4℃离心10分钟，去除沉淀 (包含细胞核，线粒体)，保留上清液（包含细胞浆和细胞膜）；
7.将上清液转移到新的管子里，用高速离心机进行第二轮高速离心1个小时（100，000g的离心力，4℃），因细胞膜较重，可以将细胞膜从可溶性的细胞物质中沉淀出来；
8.去除上清液，用2毫升的缓冲液，通过25 gauge直径的针管冲洗沉淀；
9.在显微镜下验证分离出来的细胞膜的状态；之后再次离心45分钟（100，000g, 4℃），冲洗过程中沉淀的细胞膜被打散，需要重新离心才能再次沉淀出来；
10.去除上清液，加入3毫升的筛选液 ；
11.筛选液的成分为50mM Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）, 150mM NaCl, 0.1% v/v Tween20（吐温20）, 250mM Sucrose（蔗糖）， 0.5mM EDTA，1mM DTT（二巯基苏糖醇）, 1mg/mL fish sperm DNA（鱼精DNA;）, 1mg/mL BSA（牛血清白蛋白）, pH 7.5；
12.将约1nmol的DNA编码化合物库（含50,000种化合物结构）以及2pmol的接有DNA序列的阳性化合物BQ-123（100：1的富集程度）加入含细胞膜的筛选液中；
13.在4℃摇床上反应过夜；
14.离心45分钟（100000g的离心力, 4℃）；
15.去除上清液，用5毫升的筛选液冲洗沉淀；
16.共清洗三遍，每次10分钟，其间离心45分钟（100，000g, 4℃）；
17.将剩余的细胞膜与3毫升筛选液一起在80℃加热10分钟；
18.离心45分钟（100000g, 4℃）；
19.保留上清液；
20.在每一轮筛选后，保留约20μL上清液，用来做qPCR以确定阳性化合物BQ-123的富集程度；
21.共进行一到三轮筛选，直到阳性化合物BQ-123的富集程度达到2000：1以上；
22.每轮筛选过后的产物用qPCR来确定阳性化合物BQ-123的富集程度。qPCR结果示意图见图2。图2表示了两轮筛选后BQ-123相对于其他DNA编码化合物库内的化合物的富集程度，筛选前为100:1，筛选一轮候提升到1000：1，筛选两轮后提升到2500:1，达到了大于2000:1的标准，因此认为至此此次筛选已经成功。
实施例2：对V1a 受体进行DNA编码化合物库的筛选
一、背景：V1a receptor（受体）属于GPCR，是一种有多个跨膜区域的蛋白，难以在被纯化的同时保持生物活性和结构
二、实施方法：
如图1所示，该方法具体包括如下步骤：
1.将表达V1a 受体的细胞种在100mm的培养板上，使其长成一层均匀的单层细胞；
2.刮入2毫升的缓冲液中；
3.缓冲液成分为20mM HEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸）, 250mM Sucrose（蔗糖）, 10mM KCl, 2mM MgCl2, 1mM EDTA（乙二胺四乙酸）, 1mM EGTA（乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸）, 在使用前加入1mM DTT（二巯基苏糖醇）和protease inhibitor cocktail（蛋白酶抑制剂鸡尾酒）, pH 7.4；
4.用5mL 27gauge直径的的针管来回抽取10次，将细胞打碎；
5.将打碎后的细胞放置在冰上20分钟；
6.进行第一轮离心，分离出可溶性的物质和细胞膜，沉淀不可溶的细胞结构：用10000g的离心力在4℃离心10分钟，去除沉淀 (包含细胞核，线粒体)，保留上清液（包含细胞浆和细胞膜）；
7.将上清液转移到新的管子里，用高速离心机进行第二轮高速离心1个小时（100000g, 4℃），因细胞膜较重，可以将细胞膜从可溶性的细胞物质中沉淀出来；
8.去除上清液，用2毫升的缓冲液，通过25 gauge的针管冲洗沉淀；
9.在显微镜下验证分离出来的细胞膜的状态；之后再次离心45分钟（100000g, 4℃），冲洗过程中沉淀的细胞膜被打散，需要重新离心才能再次沉淀出来；
10.去除上清液，加入2毫升的筛选液 ；
11.筛选液的成分为50mM Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）, 150mM NaCl, 0.1% v/v Tween20（吐温20）, 250mM Sucrose（蔗糖）， 0.5mM EDTA，1mM DTT（二巯基苏糖醇）, 1mg/mL fish sperm DNA（鱼精DNA;）, 1mg/mL BSA（牛血清白蛋白）, pH 7.5；
12.将约2.5nmol的DNA编码化合物库加入含细胞膜的筛选液中；
13.在4℃摇床上反应过夜；
14.离心45分钟（100000g, 4℃）；
15.去除上清液，用5毫升的筛选液冲洗沉淀；
16.共清洗三遍，每次10分钟，其间离心45分钟（100000g, 4℃）；
17.将剩余的细胞膜与2毫升筛选液一起在80℃加热10分钟；
18.离心45分钟（100000g, 4℃）；
19.保留上清液，并进行下一轮筛选；
20.共进行一到三轮筛选，直到提取出的DNA编码化合物的总量在1X107至1X109范围内；
21.最后的产物通过PCR扩增并用二代测序解码，获得有效化合物结构A；测序结果的数据分析结果示意图见图3。图3的每一条坐标轴均代表一个DNA的标记，每个化合物上有三种不同的DNA标记。图中每个点表示筛选出来的一个化合物，点的大小表示产物中化合物的富集程度。从图3中挑选最为富集的化合物结构（举例为化合物A），并进行单独合成。
22.对化合物A进行生物功能验证。因为V1a是一种GPCR，因此可以使用FLIPR assay来测试化合物对V1a活性的抑制效果。化合物A的IC50结果示意图见图4。此图表示化合物针对V1a受体的抑制活性在0.59nmol。
以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制；对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以列举说明。凡采用等同变换或者等效替换而形成的类似此种的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。