环-L-谷氨酸-L-亮氨酸及其应用的制作方法

本发明属于植物生长调节剂和生物农药领域，涉及环-L-谷氨酸-L-亮氨酸及其应用。

背景技术：

环二肽(2,5-diketopiperazines,DKPs)及其衍生物具有抗细菌、真菌、病毒的功能，有些环二肽还能促进植物生长。如铜绿假单胞菌PAO1菌株产生的3种环二肽就具有促生活性。有一些种类的环二肽及其衍生物还能作为一种群体感应的新的信号分子，能与LuxR类蛋白互作，从而参与细菌种间甚至不同种生物间的信号传导，调控相关基因表达。Lactobacillus reuteri RC-14产生的2种环二肽能作用于金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)MN8菌株的QS系统，从而抑制其致病性。假单胞菌株PAO1产生3种环二肽也具有QS信号分子的功能。环二肽及其衍生物由于具有多种生物学活性，并且其环状结构的稳定性，这类物质已经成为了新药创制的重要研究对象。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新的环二肽。

本发明的另一目的是提供该环二肽的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种新的环二肽，为环-L-谷氨酸-L-亮氨酸，结构如图3所示。

所述的环二肽，分子量为242。

本发明所述的环二肽在促进植物生长中的应用。

本发明所述的环二肽优选在促进植物根系生长中的应用。

本发明所述的环二肽在制备植物生长调节剂中的应用。

本发明所述的环二肽优选在制备促进植物根系生长的生长调节剂中的应用。

所述的植物根系生长调节剂中本发明所述的环二肽的浓度优选75-100nmol/L，进一步优选100nmol/L。

有益效果：

本发明提供了一种新的环二肽——环-L-谷氨酸-L-亮氨酸(cyclo-L-Glu-L-Lue)，分子量为242，该物质能显著促进植物生长，当使用浓度为100nmol/L时，约0.024ppm，能显著促进植物根系生长，促生率达到37％。

附图说明

图1大肠杆菌表达环-L-谷氨酸-L-亮氨酸合成酶表达载体的构建以及重组蛋白的纯化.

A:表达载体的结构图；B：SDS-PAGE检测纯化的重组蛋白.

图2HPLC-MS检测大肠杆菌工程菌产生的环-L-谷氨酸-L-亮氨酸

A:HPLC-MS检测大肠杆菌工程菌合成产物(黑色：空载体pET28a；红色：pET28a+PFL_1389)；B:差异峰处的物质的M/Z值.

图3MS²鉴定产物的结构

A:MS²分析纯化产物的裂解谱带；B:环-L-谷氨酸-L-亮氨酸的结构式(cyclo-L-Glu-L-Lue,cEL)以及裂解部位.

图4环-L-谷氨酸-L-亮氨酸促进烟草根系生长的效果检测.

具体实施方式

实施例1大肠杆菌表达环-L-谷氨酸-L-亮氨酸合成酶表达载体的构建以及重组蛋白的纯化.

以生防假单胞菌Pf-5菌株(购自ATCC，编号为ATCC BAA-477)的基因组为模板，扩增环二肽合成酶编码基因(SEQ ID NO:1)，表达环二肽合成酶(SEQ ID NO:2)，扩增引物为CDPS-FP(SEQ ID NO:3)和CDPS-RP(SEQ ID NO:4)，引物的两端分别引入Nde I和Hind III酶切位点，回收PCR产物，再将PCR产物用Nde I和Hind III双酶切后，克隆到pET28a(+)的相同的酶切位点，再转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，测序正确后，得到含有重组载体pET28/PFL_1389(图1A)的BL21(DE3)工程菌株。

将上步构建的工程菌株接种到终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养，当OD600达到0.5左右时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导剂，在18℃条件下继续培养12小时后，离心收集菌体。得到的菌体用结合缓冲液(20mmol/L K2PO4,500mmol/LNaCl,and 20mmol/L imidazole,5％甘油，pH7.4)悬浮之后，用超声波进行破碎。然后，离心后的上清过HisTrapHP柱，然后用含有10-500mM咪唑的洗脱液(20mmol/L K2PO4,500mmol/LNaCl,and 10-500mmol/L imidazole,5％甘油，pH7.4)进行浓度梯度洗脱，收集不同咪唑浓度洗脱液组份，利用SDS-PAGE进行检测。最后，利用分子筛柱子Hiload 16/60 superdex 200进一步纯化，将得到洗脱组份用SDS-PAGE进行检测(图1B)。

实施例2 HPLC-MS检测大肠杆菌工程菌产生的环-L-谷氨酸-L-亮氨酸

用终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB培养基活化含有pET28/PFL_1389重组载体的BL21(DE3)工程菌株，以转pET28空载体的大肠杆菌BL21(DE3)(pET28)为对照。按照1％的接种量，转接到终浓度为50μg/ml卡那霉素的M9培养基中，37℃，200rpm培养，当OD600达到0.5左右时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导剂，在18℃条件下继续培养36h，培养液在10000rpm下离心30min，上清用0.22μm水系滤膜过滤，滤液进行HPLC-MS检测，检测波长为214nm。如图2A所示，红色的线为BL21(DE3)(pET28/PFL_1389)，黑色的线为对照BL21(DE3)(pET28)，由图可知差异峰值出现在26.5min时(图2A)，表明在工程菌株中出现了不同的物质。在该差异峰值下存在五种物质，其中m/z为243.1的物质是主要成份(图2B)。

实施例3 MS²鉴定产物的结构

采用上述同样的方法用M9培养基发酵BL21(DE3)(pET28/PFL_1389)工程菌株。利用乙酸乙酯对发酵上清进行萃取，用旋转蒸发仪蒸发掉溶剂，用80％的甲醇溶液溶解，再过0.22μm的滤膜，在利用制备级HPLC进行纯化，使用的纯化柱为Macherey-Nagel公司的VP 250/21 Nucleodur C18 Htec 5μm，流动相A含0.1％三氟乙酸的去离子水，流动相B为含0.1％三氟乙酸的乙腈。纯化过程如下：0-2分钟，5％的流动相B；2-25分钟，50％的流动相B；25-35分钟，95％的流动相B；35-39分钟，5％的流动相B；39-45分钟，5％的流动相B.流速为16ml/min。收集各组分，并进行MS检测，将检测m/z为243.1的洗脱组份，先冷冻抽干，再称重，取少量样品，溶解到甲醇中，进行MS²检测。图3A物质的m/z为243.1的MS²图谱。根据环二肽的分子量数据库，结合MS²谱带推测该物质的结构式为环-L-谷氨酸-L-亮氨酸(cyclo-L-Glu-L-Lue,cEL)。

实施例4环-L-谷氨酸-L-亮氨酸促进烟草根系生长的效果检测

采用平板促生发法检测纯化的环-L-谷氨酸-L-亮氨酸的促生活性，将该环二肽配置成不同浓度，浸种处理烟草种子，避光处理12个小时，用30％NaClO消毒20分钟，再用灭菌水冲洗3遍，用灭菌的牙签将种子挑到方形培养皿(含有MS固体培养基)中，每个培养皿放11颗种子，然后置于光照培养箱中培养，光照培养箱白天25℃，16h；黑夜，22℃，8h。两周后测量并记录根长。结果(图4)表明，环-L-谷氨酸-L-亮氨酸(cyclo-L-Glu-L-Lue)，能显著促进植物生长，当使用浓度为100nmol/L时，约0.024ppm，效果最佳，促生率达到37％。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 环-L-谷氨酸-L-亮氨酸及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 750

<212> DNA

<213> 假单胞菌Pf-5(Pseudomonadaceae sp.Pf-5)

<400> 1

atgagcaagg tgcaggaaat caacctcaag gcctacttca acaagggcgg cgaggagcac 60

gaattcgacg gcaagcgcgt ggtactggcg gtcagcgtcg gccaggaata tcacgaggac 120

cagaagctgc ggtccaccat tcacttgatc aaccagtccg gcttcagcca cgtcaaggtg 180

gtggtggccg ataccctgca acgccacaac aagcacggca agtcccccgg ggaggcgctg 240

tcggcggcga tccgcgatgg cgatgcctgg ctggcgcgca accagagcat cctcgacggc 300

ctgcgggtgc cgtaccacat cacccgctgg aaccaggaac tggccagcga ccgctatgcc 360

gagctgcgcc agcaactgaa ccaggtctac cagcagcgcg aggaactgcg cgacgccatc 420

gacagcacca tcggcgtatt caccgagcgc ctgcgcctgc gtgacgaaca cgcggacatc 480

gagcgggcgg cggcccagtg ccgggagtac atcctggaag agatcccgat catcctgccg 540

ctgtgggccg acgagggtta ccactacgtg ctctacccgc agcagatgac cacggccatg 600

gccaccagcc gcgagttgct gatcgaaccc cacagcccgg accgggtgcg ctggctgccc 660

ctgaagttca agaagcgggg gatcccgatt cccttcacct tgcccggcgc cattcacccc 720

aactggacca gcggcgccat cgccatctga 750

<210> 2

<211> 249

<212> PRT

<213> 假单胞菌Pf-5(Pseudomonadaceae sp.Pf-5)

<400> 2

Met Ser Lys Val Gln Glu Ile Asn Leu Lys Ala Tyr Phe Asn Lys Gly

1 5 10 15

Gly Glu Glu His Glu Phe Asp Gly Lys Arg Val Val Leu Ala Val Ser

20 25 30

Val Gly Gln Glu Tyr His Glu Asp Gln Lys Leu Arg Ser Thr Ile His

35 40 45

Leu Ile Asn Gln Ser Gly Phe Ser His Val Lys Val Val Val Ala Asp

50 55 60

Thr Leu Gln Arg His Asn Lys His Gly Lys Ser Pro Gly Glu Ala Leu

65 70 75 80

Ser Ala Ala Ile Arg Asp Gly Asp Ala Trp Leu Ala Arg Asn Gln Ser

85 90 95

Ile Leu Asp Gly Leu Arg Val Pro Tyr His Ile Thr Arg Trp Asn Gln

100 105 110

Glu Leu Ala Ser Asp Arg Tyr Ala Glu Leu Arg Gln Gln Leu Asn Gln

115 120 125

Val Tyr Gln Gln Arg Glu Glu Leu Arg Asp Ala Ile Asp Ser Thr Ile

130 135 140

Gly Val Phe Thr Glu Arg Leu Arg Leu Arg Asp Glu His Ala Asp Ile

145 150 155 160

Glu Arg Ala Ala Ala Gln Cys Arg Glu Tyr Ile Leu Glu Glu Ile Pro

165 170 175

Ile Ile Leu Pro Leu Trp Ala Asp Glu Gly Tyr His Tyr Val Leu Tyr

180 185 190

Pro Gln Gln Met Thr Thr Ala Met Ala Thr Ser Arg Glu Leu Leu Ile

195 200 205

Glu Pro His Ser Pro Asp Arg Val Arg Trp Leu Pro Leu Lys Phe Lys

210 215 220

Lys Arg Gly Ile Pro Ile Pro Phe Thr Leu Pro Gly Ala Ile His Pro

225 230 235 240

Asn Trp Thr Ser Gly Ala Ile Ala Ile

245

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaattccat atgagcaagg tgcaggaaat caacct 36

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acccaagctt tcagatggcg atggcgccgc tggtcca 37