本发明涉及一种peg修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，属于临床体外检测技术领域。
背景技术：
peg修饰酶法检测血清高密度脂蛋白胆固醇，由1995年sugiuchi首先提出，属于均相法检测血高密度脂蛋白胆固醇的一种重要的方法，其方法的反应原理为试剂1中硫酸α-环糊精、硫酸葡聚糖与标本中的ldl、vldl及cm形成水溶性复合物。试剂2中peg修饰酶系对hdl发生反应，从而达到检测目的。本法原理着重点在于:①硫酸α-环糊精对富含apob的ldl组分产生一种屏蔽作用；②peg修饰酶中的peg分子产生空间位阻,不利于大分子底物与酶接触,而又不影响小分子的hdl与酶发生酶促反应；③试剂2中的表面活性剂在不影响硫酸α-环糊精-ldl复合物的基础上能使hdl快速充分溶解。上述三点充分保证hdl测定的特异性和准确性。本法试剂非常优良，与cdc指定的比较方法具有非常好的相关性，本法能够实现对hdl充分、快速反应,对ldl的非特异性反应极少，抗干扰能力较强，结果较准确。
但因技术难度较大,国内尚无产品问世，技术问题主要存在于修饰酶的合成与表面活性剂的筛选，其中最难以控制的就是peg修饰酶的制备，sugiuchi建立的方法为首先将peg6000使用n-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺（dcci）进行活化，将胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶，加入到0.1mol/l的hepesph=8.5的缓冲液，溶解完全后，将活化的peg6000加入到酶溶液中，令peg6000与酶通过共价键结合在一起，至少需要30分钟的时间，然后将peg6000使用滤网将其过滤掉，然后使用hplc方法进行检测结合后的酶的活性，作者通过大量的实验发现，本方法存在以下几个问题：①在peg6000与酶结合的过程中，即使是peg6000非常过量，但是也有少量的酶类没有被结合，这就在使用的时候为修饰酶的特异性增加了难度；②所激活peg6000的两种物质，如果清理不当，会对后面hdl-c的检测造成影响，③如果没有结合酶的peg过滤不够彻底，则会造成结果hdl-c的检测不准确，④修饰酶的过程过于繁杂，需要很高的技术和实验水平，修饰酶的获取成本高。
因此基于以上的条件制约，影响了peg-修饰酶法这种非常优良的检测方法的普及和推广，因此根据这些问题，发明了一种peg修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法。
技术实现要素：
本发明涉及一种peg修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法。
本发明是通过以下步骤得到的：
1）基本原理：以peg20000为载体，在激活剂以及离子物质存在的情况下，使胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶与peg20000之间形成离子键，以获取具有对脂蛋白具有选择性的peg修饰酶；
2)基本步骤：
首先配置缓冲液，然后加入对氨基苯磺酸和aeo-9两种物质作为激活剂，然后加入载体peg20000（sigma），再加入保护剂以及乳化剂和离子物质搅拌均匀后，依次加入胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶，慢中速搅拌10分钟，然后使用低转速离心机离心后，取出上清液即可得到同等效果的peg修饰酶；
3)配方组成成分：
piepes100mmol/lph=7.0
对氨基苯磺酸5mmol/l
aeo-91.2g/l
peg20000（sigma）5g/l
保护剂2ml/l-3ml/l
乳化剂1ml/l-3ml/l
离子物质3g/l-5g/l
胆固醇氧化酶3ku/l
胆固醇脂酶1ku/l
防腐剂0.5g/l-1g/l。
所述的一种peg修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，试剂中所述保护剂为磷脂血清；
所述的一种peg修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，试剂所述乳化剂为曲拉通-100；
所述的一种peg修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，试剂所述离子物质为氯化钠；
所述的一种peg修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，试剂所述防腐剂为mit。
本发明的创新之处如下：
1）本发明建立其一种操作简单的获取peg修饰胆固醇氧化酶和peg修饰胆固醇脂酶的制备方法，由原来的共价结合，改为离子结合；
2）在试剂中选取了分子量较大的peg20000作为载体，即使是有未被活化的peg20000加入到试剂中也不会造成影响试剂的反应；
3）在试剂中加入对氨基苯磺酸和aeo-9能够较好激活peg20000，且不会对酶活性以及高密度脂蛋白胆固醇的检测造成影响；
4）乳化剂曲拉通100和氯化钠则能增加酶与激活后的peg20000的结合；
5）磷脂血清则能够提高产品peg-修饰酶的稳定性，而mit防腐剂的选择则能够较好的抑制细菌的生长。
附图说明
图1为实施例3试剂检测方法；
图2为实施例1与和实施例2分别与对照组peg修饰酶检测结果比较；
图3为实施例1与对照组peg修饰酶相关性；
图4为实施例2与对照组peg修饰酶相关性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明：
实施列1
一种peg修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法。
1)基本步骤：
首先配置缓冲液，然后加入对氨基苯磺酸和aeo-9两种物质作为激活剂，然后加入载体peg20000（sigma），再加入保护剂以及乳化剂和离子物质搅拌均匀后，依次加入胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶，慢中速搅拌10分钟，然后使用低转速离心机离心后，取出上清液即可得到同等效果的peg修饰酶。
2)配方组成成分：
piepes100mmol/lph=7.0
对氨基苯磺酸5mmol/l
aeo-91.2g/l
peg20000（sigma）5g/l
磷脂血清2ml/l
曲拉通-1001ml/l
氯化钠3g/l
胆固醇氧化酶3ku/l
胆固醇脂酶1ku/l
mit0.5g/l。
实施例2
本实施例描述的是一种原料增加后的新型的peg修饰胆固醇氧化酶和peg修饰胆固醇脂酶的制备：
制备步骤：
1）首先配置缓冲液，然后加入对氨基苯磺酸和aeo-9两种物质作为激活剂，然后加入载体peg20000（sigma），再加入保护剂以及乳化剂和离子物质搅拌均匀后，依次加入胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶，慢中速搅拌10分钟，然后使用低转速离心机离心后，取出上清液即可得到同等效果的peg修饰酶。
2)配方组成成分：
piepes100mmol/lph=7.0
对氨基苯磺酸5mmol/l
aeo-91.2g/l
peg20000（sigma）5g/l
磷脂血清3ml/l
曲拉通-1003ml/l
氯化钠5g/l
胆固醇氧化酶3ku/l
胆固醇脂酶1ku/l
mit1g/l。
实施例3
本实施例描述的是将实施例1、2方法获取的peg修饰酶与sugiuchi方法获取的peg修饰酶进行临床应用检测结果比较。
1）配置peg修饰酶方法的高密度脂蛋白检测试剂配置方案：
本方案为双试剂:
试剂r1:mops缓冲液30mmol/l,ph7.0；a-环状葡聚糖硫酸盐0.5mmol/l；硫酸葡聚糖0.5g/l；氯化镁2mmol/l；emse0.3g/l。
试剂r2:mops缓冲液30mmol/l,ph7.0；peg修饰胆固醇脂酶1ku/l；peg修饰胆固醇氧化酶5ku/l；过氧化物酶30ku/l；4-aa0.5g/l。
2)检测比较：
将实施例1和实施2作为实验组，以sugiuchi方法描述制备的peg修饰酶作为对照组，按照peg修饰酶法高密度脂蛋白胆固醇检测试剂的配置方法，作为原材料加入使用，在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如日立7180全自动分析仪等，利用终点法进行测定。将试剂r1和r2按照3:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，具体操作方法见图1。
将实施例1、2方法获取的peg修饰酶和对照组peg修饰酶，分别配置成高密度脂蛋白胆固醇检测试剂，进行40个临床样本的检测比对，其对比检测的结果见图2。结果发现相对偏差在10%以内，实施例1与和实施例2分别与对照组的相关系数分别为：r1=0.9980和r2=0.9977，结果如图3、图4，这说明具有非常好的相关性。