本发明涉及微生物培养技术领域，尤其涉及一种提高益生菌热耐受性的方法。
背景技术：
益生菌是指当摄入足够数量时能对宿主产生有益作用的活的微生物。它们定植于人体肠道和生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡，发挥有益作用。但只有当益生菌产品中的活菌数达到一定数量时才能保证有益功效，通常食品工业推荐的最低水平是106cfu/ml，考虑到储存和消化过程会对益生菌的活性造成影响，所以每日摄入108-109cfu的益生菌是实现其在人类生物体中的作用所必须的。
随着消费者健康意识的提高，益生菌功能食品受到越来越多的关注，实现这类功能食品的低成本、高质量、大规模生产是该行业的迫切需求，而在生产过程、长期储存和消化期间保护益生菌的存活能力则尤为关键。
益生菌产品可分为液态形式和固态形式，通常液态形式需要低温贮藏、成本高，且货架期短，为克服这些问题，大部分生产机构通常会对益生菌产品进行干燥，加工成固态形式，如颗粒、片剂、胶囊等。而且干燥也能使得益生菌易于加工、运输和在功能食品方面的后续使用。
对益生菌产品进行干燥的常用方法有喷雾干燥、热空气干燥、冷冻干燥、真空干燥和流化床干燥等。
喷雾干燥的设备简单、成本较低、可连续生产，因而是工业上更受欢迎的一种干燥方法。过程中将液体在高达200℃下以雾化形式注射入干燥介质，喷雾后气液界面面积的增加显著提高了干燥速度，通常认为干燥发生在几秒钟内。但喷雾干燥同时也使得含益生菌的产品在短时间内暴露于非常高的温度，而这对活细菌细胞十分有害。除此之外，干燥也会使得益生菌由于脱水而失活。为保证干燥过程中益生菌有较高的存活率，从而保证产品中含有达到预期益生效果所需要的益生菌数目，研究人员们从多个方面进行优化，包括对益生菌进行预处理以增强菌本身耐受不利因素的能力、添加保护剂为菌提供有效的保护屏障、优化干燥参数来尽量减小对菌的伤害等。相关研究表明，将益生菌包埋入保护剂中，能够在食品加工、储存期间及胃肠道条件下对其提供有效的保护作用。所用的保护剂可以是脱脂奶粉颗粒、乳清蛋白、甘油、甜菜碱、核糖醇、乳糖、以及右旋糖苷、聚乙二醇等高聚物等。这些研究对改善益生菌对抗干燥过程中不利变化的能力提供了重要参考。
工业上生产益生菌颗粒产品，在进入干燥单元之前，通常还要经过菌的培养、离心分离去除培养基、添加干燥保护剂几大步骤，如果有一种基质既能作为培养基，又能在干燥中对菌提供保护作用，则有望省略中间的离心分离、添加保护剂步骤，大大减少材料的浪费、菌体的损失及降低污染风险，从而使生产更加高效、安全、节约资源。
脱脂牛奶是常用的益生菌干燥保护剂，已经有一些报道证明了乳清蛋白与钙能在喷雾干燥、储存与消化过程中对益生菌起到保护作用。这里的干燥保护剂指的是在进入干燥单元前与益生菌混合，作为一种物理性载体提供保护作用，是从外部提供一种保护性屏障。另外，脱脂牛奶营养物质丰富，可能也可以作为培养益生菌的基质。
由于脱脂牛奶产量巨大、极易获得，如果它可以作为一种双重作用基质，既能用于培养益生菌又能作为干燥保护剂，那么在简化益生菌从生长到干燥的处理步骤、降低污染风险及节省人力物力上都有着重大意义，而目前并未出现相关报道。此外，为达到益生菌培养物的一步干燥，双重作用基质的浓度有着重要意义。细菌等渗培养基的浓度值通常在5％～10％，但用作干燥的原料液时，这样低的浓度可能会导致不利的结果，例如可用于封装细菌细胞的壁材更少；但当提高培养基中的固含量时，因为渗透压更高，可能又会对细菌的生长造成抑制效应。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种提高益生菌热耐受性的方法，本发明使用脱脂牛奶作为双重作用基质培养益生菌，不需要经过离心分离、重悬洗涤而可以直接用于后续干燥等加工，提高了益生菌对热的耐受性。
本发明提供了一种提高益生菌热耐受性的方法，包括以下步骤：
(1)将益生菌接种至脱脂牛奶中进行培养，所述脱脂牛奶的质量浓度为5％-35％；
(2)干燥步骤(1)得到的培养物。
进一步地，在步骤(1)中，脱脂牛奶的制备方法包括以下步骤：
将脱脂奶粉溶于水，灭菌后得到所述脱脂牛奶。进一步地，在105℃下高压蒸汽灭菌10min。
进一步地，在步骤(1)中，每100g脱脂奶粉中包含：蛋白质35g、脂肪1g、碳水化合物53g、钙1150mg、钠450mg及其他维生素与微量元素。
进一步地，在步骤(1)中，益生菌为双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、丙酸杆菌属和链球菌属中的一种或几种。优选地，益生菌为乳杆菌属。更优选地，益生菌为干酪乳杆菌lactobacilluscaseizhang菌株(保藏号cgmcc1697，以下简称lcz)，其为专利cn101144062a中公开的菌株。
进一步地，在步骤(1)中，培养温度为20℃～40℃，培养时间为24h～100h。益生菌接种至脱脂牛奶后，培养温度、时长等根据菌的类型，按照目前的工艺水平常用的条件而确定。
进一步地，在步骤(1)中，将益生菌接种至脱脂牛奶中，常用接种量范围为1％-5％(v/v)。在某些特定的发酵实验中，也可以采用0.1％，或者高达100％的接种量。
进一步地，在步骤(1)中之前还包括使用标准培养基活化益生菌的步骤，例如mrs培养基、m17培养基或yel培养基。
进一步地，在步骤(2)中，采用直接加热的方式或采用喷雾干燥法进行干燥处理。
进一步地，可采用加热处理对喷雾干燥中益生菌所受的热伤害进行模拟，此时，步骤(1)中的脱脂牛奶的质量浓度为20-35％，加热处理的温度为45℃～80℃，加热时间为5min～30min。进一步地，加热处理采用金属浴加热，加热后还包括在冰水浴中冷却1min的步骤。
进一步地，当采用喷雾干燥法进行干燥处理时，步骤(1)中的脱脂牛奶的质量浓度为20-35％，喷雾干燥的出口温度为45℃～80℃。
本方法是将益生菌在脱脂牛奶中进行培养，是从干燥操作之前的培养阶段入手提高益生菌自身的耐受性。在此基础上，可以直接将益生菌的脱脂牛奶培养物直接用于干燥操作，例如喷雾干燥，在喷雾干燥过程中，脱脂牛奶同时起到喷雾干燥保护剂的作用，脱脂牛奶中的蛋白质可以通过稳定细胞膜的组分防止细胞受损，此外，乳蛋白与乳钙发生相互作用时，可能可以在细菌细胞壁外形成保护性涂层。保护剂的浓度较低时可能会导致不利的结果，例如可用于包覆细菌细胞的壁材更少、需要的干燥温度更高、产生的细粉会发生结块或粘连等；但浓度过高时，因为渗透压更高，可能又会对细菌的生长造成抑制效应。因而一定浓度范围内的脱脂牛奶才能达到更为理想的保护效果。
此外，益生菌的培养期间，脱脂牛奶中的糖类、柠檬酸盐、衍生自乳糖蛋白和糖脂的痕量碳水化合物等可以作为能源供细菌细胞的生长利用；比细菌等渗生长基高一些的浓度又提供了一定的高渗透压刺激，促进了细菌胞内相容性溶质的积累，从而提高了细菌对不利环境的耐受性。
本发明还提供了一种采用上述方法所制备的热耐受性提高后的益生菌。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
培养基浓度是益生菌生长过程中的重要影响因素，对益生菌的生长及耐受性有重要影响，但本领域的人还并不清楚其产生的具体效果，一般认为当培养基浓度较高时对益生菌的生长有抑制作用。
本发明中，脱脂牛奶一方面作为培养基提供营养、因浓度比标准培养基要高又可以为益生菌提供一定的预适应作用，另一方面能够在干燥过程中对益生菌提供保护作用。本发明首次公开了在不同浓度脱脂牛奶中培养一段时间对益生菌的耐受性有着不同的影响。
本发明方法将不同浓度脱脂牛奶作为益生菌的培养基，公开了其对益生菌生长的影响，并且将培养的益生菌直接进行加热处理，公开了不同浓度的脱脂牛奶对益生菌热耐受性的影响。
相比于低浓度脱脂牛奶(5％-10％)，较高浓度的脱脂牛奶(20％-35％)更能促进益生菌的生长，而且，经过脱脂牛奶培养的益生菌在模拟热伤害的加热处理后，存活率也相对较高。与传统的保护策略相比，本发明方法从菌的生长到干燥的整个过程出发来考虑培养基浓度对益生菌的影响，避免了进行干燥处理前除去生长基且需要另外添加干燥保护剂的繁琐操作，大大简化了高活性益生菌颗粒生产的流程。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是实施例2中不同浓度的培养基中干酪乳杆菌lcz的生长曲线；
图2是实施例3中热处理前后不同浓度培养基中干酪乳杆菌lcz的活菌数及存活率测试结果；
图3是实施例4中热处理前后不同浓度培养基中鼠李糖乳杆菌lgg的活菌数及存活率测试结果；
图4是实施例5中热处理前后不同浓度培养基中干酪乳杆菌l.caseibl23的活菌数及存活率测试结果；
图5是实施例6中热处理前后不同浓度培养基中植物乳杆菌lp-p8的活菌数及存活率测试结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
培养基的制备
(1)脱脂牛奶培养基的制备：将脱脂奶粉溶解于去离子水中得到固含量分别为5％、10％、20％、30％、35％的脱脂牛奶培养基(w/w)，置于105℃下高压蒸汽灭菌10min，室温下冷却。将已高压灭菌的20％的脱脂牛奶溶液于80mbar、128rpm以及50℃的旋蒸条件下无菌浓缩得到42％及48％的脱脂牛奶培养基(以下简称sm培养基)。
(2)mrs培养基的制备：将mrs肉汤(mrsbroth)溶解于去离子水中，得到固含量为5％的mrs培养基(w/w)，121℃下高压蒸汽灭菌15min，冷却至室温。
实施例2
生长曲线测定
采用专利号为cn101144062a中公开的菌株lactobacilluscaseizhang菌株作为培养菌株，该菌株目前可通过商业化渠道购买。
将lcz在mrs培养基中37℃下活化12h，然后将活化好的lcz以1％的接种量分别接种至实施例1制备的不同浓度的脱脂牛奶培养基和mrs培养基中，于37℃下静置培养，培养期间每隔6或12h取一次样用涂布平板法测试活菌数，直至培养至96h，得到的生长曲线如图1所示，从图中可看出，sm培养基用于益生菌的生长时，活菌数在达到稳定阶段后保持不变，且在5％-42％的质量浓度范围内，浓度越高，活菌数越多，而使用mrs培养基培养菌株时，在培养时间超过40h后，其活菌数明显下降。
实施例3
加热处理
(1)菌悬液制备：
采用专利号为cn101144062a中公开的菌株lactobacilluscaseizhang菌株(保藏号cgmcc1697，以下简称lcz)制备菌悬液，该菌株目前可通过商业化渠道购买。
将lcz在mrs培养基中37℃下活化12h，然后以1％的接种量接种至实施例1制备的不同浓度的脱脂牛奶培养基中培养36h，培养结束混匀即得到菌悬液。
同时，将lcz在mrs培养基中37℃下活化12h，然后再培养于mrs培养基中24h，作为对照组菌悬液。
(2)采用加热处理简单模拟喷雾干燥
对上述获得的脱脂牛奶培养基中培养的不同菌悬液进行金属浴热处理，将金属浴温度设置在65℃，到达设置温度后，将菌悬液放入金属浴中加热10min、转速为0rpm，加热10min后的样品立即放入冰水浴中降温1min。
采用传统涂布平板法测试热处理后的剩余活菌数，热处理前，菌的初始活菌浓度在108-109cfu/ml范围内，热处理前后的菌的活菌数及存活率如图2所示(图中，5％mrs代表对照组，其余代表不同浓度的脱脂牛奶培养基)。结果表明，加热前各培养基中益生菌的活菌数相近，而经过相同热处理条件后活菌数出现很大差异，在5％到30％浓度范围内，脱脂牛奶浓度越高，存活率也越高，35％的浓度下，存活率有所下降。这里采用的热处理虽然与喷雾干燥中的出口温度相近，但由于喷雾干燥前期存在着蒸发冷却效应，导致热处理过程中积累的整体热效应要高于喷雾干燥中的整体热效应。因此，由菌对热处理的耐受性可以预测其在喷雾干燥的最后阶段可以表现出更好的存活率。
实施例4
将脱脂奶粉溶于水，在105℃下高压蒸汽灭菌10min，得到脱脂牛奶，其质量浓度为5％、20％、30％。
使用mrs培养基在37℃下活化益生菌12h，益生菌为鼠李糖乳杆菌lgg。然后将活化后的益生菌以1％(v/v)的接种量接种至上述配制的脱脂牛奶中，在37℃下培养36h。
对所得的lgg培养物直接进行加热处理，将金属浴温度设置在65℃，到达设置温度后，将菌悬液放入金属浴中加热10min、转速为0rpm，加热10min后的样品立即放入冰水浴中降温1min。实验结果如图3所示，图中5％mrs代表对照组，其余代表不同浓度的脱脂牛奶培养基。
实施例5
将脱脂奶粉溶于水，在105℃下高压蒸汽灭菌10min，得到脱脂牛奶，其质量浓度为5％、30％。
使用mrs培养基在37℃下活化益生菌12h，益生菌为干酪乳杆菌l.caseibl23。然后将活化后的益生菌以1％(v/v)的接种量接种至上述配制的脱脂牛奶中，在37℃下培养36h。
对所得的l.caseibl23培养物直接进行加热处理，将金属浴温度设置在65℃，到达设置温度后，将菌悬液放入金属浴中加热10min、转速为0rpm，加热10min后的样品立即放入冰水浴中降温1min。实验结果如图4所示，图中5％mrs代表对照组，其余代表不同浓度的脱脂牛奶培养基。
实施例6
将脱脂奶粉溶于水，在105℃下高压蒸汽灭菌10min，得到脱脂牛奶，其质量浓度为5％、30％。
使用mrs培养基在37℃下活化益生菌12h，益生菌为植物乳杆菌lp-p8。然后将活化后的益生菌以1％(v/v)的接种量接种至上述配制的脱脂牛奶中，在37℃下培养36h。
对所得的lp-p8培养物直接进行加热处理，将金属浴温度设置在65℃，到达设置温度后，将菌悬液放入金属浴中加热10min、转速为0rpm，加热10min后的样品立即放入冰水浴中降温1min。实验结果如图5所示，图中5％mrs代表对照组，其余代表不同浓度的脱脂牛奶培养基。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。