本发明涉及细胞培养技术，涉及细胞生存率判定装置以及细胞生存率判定方法。
背景技术
在生物过程和细胞培养领域，为了控制细胞培养条件，以及为了判断细胞培养的停止时期等，对培养细胞的生死进行判定，从而测定生存率。作为判定细胞生死的判定方法，提出了使荧光色素与细胞内的核酸结合，根据激发的荧光的强度对细胞的生死进行判定的方法(参照例如专利文献1。)。此外，还已知有利用透过死细胞的细胞膜将死细胞的细胞质染成蓝色的锥虫蓝染色，来判定细胞的生死的方法。
但是，染色试剂价格昂贵，而且对细胞进行染色的工序繁杂。此外，染色试剂往往对人体有害。因此染色试剂需要管理、保管。此外，用染色试剂染色后的细胞难以继续培养，废液的处理也必须注意。对此，提出了不使用染色试剂，而是根据细胞发出的自体荧光来判定细胞的生死的方法(例如参照专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第2592114号公报
专利文献2：日本专利第4868879号公报
技术实现要素：
发明要解决的课题
由于细胞发出的自体荧光较微弱，因此有时需要较长的曝光时间，或需要高灵敏度的荧光检测装置。在此，本发明的目的在于，提供一种能够不使用染色试剂并且不依赖于细胞的自体荧光地判定细胞的生存率的细胞生存率判定装置以及细胞生存率判定方法。
解决课题的手段
根据本发明的方式，提供一种细胞生存率判定装置，包括：分布取得部，其获得含有包含培养细胞的粒子的溶液中的粒子的大小的分布；分类部，其在分布中，使用规定的阈值将粒子分类为小粒子群和大粒子群；比计算部，其计算出属于小粒子群的粒子的数量与属于大粒子群的粒子的数量之比的值；以及生存率判定部，其使用预先取得的比与细胞的生存率的关系，根据比的值判定培养细胞的生存率。
在上述细胞生存率判定装置中，也可以是，分布取得部根据溶液的图像，获得粒子的大小的分布
在上述细胞生存率判定装置中，也可以是，分布取得部根据在各个粒子上产生的散射光的强度，获得粒子的大小的分布。
上述细胞生存率判定装置还可以包括：流路，溶液在流路中流通，且流路能够卸下；测定室，其连接于流路，且能够卸下；照射器，其对测定室内照射测定光；以及散射光测定器，其测定被照射了测定光的测定室内产生的散射光的强度。
在上述细胞生存率判定装置中，培养细胞也可以被悬浮培养。
在上述细胞生存率判定装置中，培养细胞也可以是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。
此外，根据本发明的方式，提供一种细胞生存率判定方法，其包括：获得含有包含培养细胞的粒子的溶液中的粒子的大小的分布；在分布中，使用规定的阈值将粒子分类为小粒子群和大粒子群；计算出属于小粒子群的粒子的数量与属于大粒子群的粒子的数量之比的值；使用预先取得的比与细胞的生存率的关系，根据比的值判定培养细胞的生存率。
在上述细胞生存率判定方法中，也可以根据溶液的图像获得粒子的大小的分布。
在上述细胞生存率判定方法中，也可以根据在各个粒子上产生的散射光的强度，获得粒子的大小的分布。
上述细胞生存率判定方法还可以包括：使溶液在可卸下的流路、以及连接于流路的可卸下的测定室中流动；对测定室内照射测定光；以及测定被照射了测定光的测定室内产生的散射光的强度。
在上述细胞生存率判定方法中，培养细胞也可以被悬浮培养。
在上述细胞生存率判定方法中，培养细胞也可以是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。
发明效果
根据本发明，可以提供一种能够不使用染色试剂并且不依赖于细胞的自体荧光地判定细胞的生存率的细胞生存率判定装置以及细胞生存率判定方法。
附图说明
图1是第1实施方式涉及的细胞生存率判定装置的示意图。
图2是第1实施方式涉及的细胞生存率判定装置的示意图。
图3是示出第1实施方式涉及的粒子的频数分布的示意曲线图。
图4是示出第1实施方式涉及的细胞的培养时间、与属于小粒子群的粒子的数量相对于属于大粒子群的粒子的数量之比的关系的示意曲线图。
图5是示出第1实施方式涉及的死细胞的比例、与属于小粒子群的粒子的数量相对于属于大粒子群的粒子的数量之比的关系的示意曲线图。
图6是第2实施方式涉及的细胞生存率判定装置的示意图。
图7是第2实施方式涉及的细胞生存率判定装置的示意图。
图8是示出培养开始后第0天至第3天的实施例涉及的粒子的频数分布的曲线图。
图9是示出培养开始后第4天至第7天的实施例涉及的粒子的频数分布的曲线图。
图10是示出培养开始后第8天至第11天的实施例涉及的粒子的频数分布的曲线图。
图11是示出培养开始后第12天以及第13天的实施例涉及的粒子的频数分布的曲线图。
图12是实施例涉及的含有被悬浮培养的细胞的培养基的照片。
图13是示出实施例涉及的细胞的培养时间、与属于小粒子群的粒子的数量相对于属于大粒子群的粒子的数量之比的关系的曲线图。
图14是示出实施例涉及的细胞的生存率、与属于小粒子群的粒子的数量相对于属于大粒子群的粒子的数量之比的关系的曲线图。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式进行说明。下图的记载中，同一部分或类似的部分以相同或类似的符号表示。但是，附图是示意性的。因此，具体尺寸等应对照以下说明进行判断。此外，在附图相互之间，当然也包含彼此的尺寸关系、比例不同的部分。
还有，形成该公开的一部分的记述以及附图不应该理解为对本发明的限定。根据该公开，本领域技术人员理应清楚了解各种各样的替代实施方式、实施例及应用技术。因此，应该理解本发明也包含在这里没有记载的各种各样的实施方式等。
(第1实施方式)
如图1以及图2所示，第1实施方式涉及的细胞生存率判定装置包括：分布取得部301，其获得含有包含培养细胞的粒子的溶液中的粒子的大小的分布；分类部302，其在分布中使用规定的阈值，将粒子分类为小粒子群和大粒子群；比计算部303，其计算出属于小粒子群的粒子的数量与属于大粒子群的粒子的数量之比的值；以及生存率判定部304，其使用预先取得的比与细胞的生存率的关系，根据比的值判定培养细胞的生存率。分布取得部301、分类部302、比计算部303以及生存率判定部304例如包含于运算处理装置300中。
培养细胞是例如被悬浮培养的细胞。在悬浮培养中，使细胞不与培养器的底面接触地，使球状的细胞以在培养液中悬浮的状态增殖。培养细胞也可以是被接触培养的细胞。培养细胞包含所有种类的细胞。作为培养细胞的一例，可以举出抗体形成细胞。作为抗体形成细胞的例子，有例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞。cho细胞包含株化了的cho细胞。此外，cho细胞包含cho－k1细胞、二氢叶酸还原酶(dhfr)缺陷型cho－dg44细胞等的变种。
分布取得部301例如根据含有包含培养细胞的粒子的溶液的图像，获得每单位体积的粒子的大小的频数分布。通过测量含有包含培养细胞的粒子的溶液的图像上映现的各粒子的大小，得到粒子的大小的频数分布。含有包含培养细胞的粒子的溶液的图像为含有被悬浮培养的细胞的溶液的图像。或者，含有包含培养细胞的粒子的溶液的图像为，含有经接触培养后被从培养器上剥离而悬浮于溶液中的细胞的溶液的图像。粒子的大小的频数分布例如用直方图表示。不过，粒子的大小的频数分布并不一定必须以视觉的方式进行表现。
包含培养细胞的粒子的大小可以是粒子的直径，也可以是粒子的半径。此外，也可以将反映粒子的大小的数值用作表示粒子的大小的指标。例如，当对粒子照射光时，粒子上会产生米氏散射光。米氏散射光的强度反映了粒子的大小。因此，也可以将米氏散射光的强度用作表示粒子的大小的指标。在该情况下，分布取得部301根据各个粒子上产生的散射光的强度来获得粒子的大小的分布。
根据本发明人发现的知识，当针对含有包含培养细胞的粒子的溶液测定粒子的大小时，如图3的(a)所示，观察到大小比规定的阈值大的大粒子群、和大小比规定的阈值小的小粒子群。当经过一些细胞的培养天数，培养液中的死细胞增加时，如图3的(b)所示，与培养初期相比，会有属于大粒子群的粒子的数量减少、属于小粒子群的粒子的数量增加的倾向。当进一步经过了细胞的培养天数，培养液中的死细胞进一步增加时，如图3的(c)所示，会有属于大粒子群的粒子的数量进一步减少、属于小粒子群的粒子的数量进一步增加的倾向。
因此，例如如图4所示，随着培养时间的经过，属于小粒子群的粒子的数量相对于属于大粒子群的粒子的数量之比有增加的倾向。此外，如图5所示，随着溶液中的死细胞的比例的增加，属于小粒子群的粒子的数量相对于属于大粒子群的粒子的数量之比有增加的倾向。
属于小粒子群的粒子的数量相对于属于大粒子群的粒子的数量之比、与溶液中的死细胞或者活细胞的比例的关系能够预先取得。例如，在开始细胞的培养后，每天测定含有细胞的溶液中的、属于小粒子群的粒子的数量相对于属于大粒子群的粒子的数量之比，并且通过锥虫蓝染色等已知的方法测定含有细胞的溶液中的死细胞或者活细胞的比例。由此，取得属于小粒子群的粒子的数量相对于属于大粒子群的粒子的数量之比、与溶液中的死细胞或者活细胞的比例的关系。在该关系的取得时，也可以适当采用最小二乘法等近似法。例如，可以用以比为自变量、以比例为因变量的一次函数来表示该关系。
图1所示的运算处理装置300上例如连接有数据存储装置401。数据存储装置401保存如上述那样取得的属于小粒子群的粒子的数量相对于属于大粒子群的粒子的数量之比、与溶液中的死细胞或者活细胞的比例的关系。
如图3所示，分类部302在分布取得部301所取得的粒子的大小的频数分布中，使用规定的阈值，将粒子分类为小粒子群和大粒子群。规定的阈值例如设定成给出频数的极小值的粒子的大小。大小比规定的阈值小的粒子被分类为小粒子群，大小比规定的阈值大的粒子被分类为大粒子群。
图1所示的比计算部303计算出属于小粒子群的粒子的数量与属于大粒子群的粒子的数量之比的值。比的值可以是属于大粒子群的粒子的数量相对于属于小粒子群的粒子的数量之比的值，也可以是属于小粒子群的粒子的数量相对于属于大粒子群的粒子的数量之比的值。在下面，说明使用属于小粒子群的粒子的数量相对于属于大粒子群的粒子的数量之比的例子。
生存率判定部304从数据存储装置401中读出预先取得的属于小粒子群的粒子的数量相对于属于大粒子群的粒子的数量之比、与溶液中的死细胞或者活细胞的比例的关系。生存率判定部304根据读出的关系以及比计算部303所计算出的比的值，计算出溶液中的死细胞或者活细胞的比例，从而判定培养细胞的生存率。在此，培养细胞的生存率例如是活细胞相对于指死细胞与活细胞的合计值的比例。话虽如此，也可以根据死细胞的比例来判定培养细胞的生存率。
运算处理装置300上例如也可以连接暂时存储装置402、信号输出装置403、信号输入装置404、信号收发装置405、及显示装置406等。暂时存储装置402暂时存储运算处理装置300的运算过程中的信息。信号输出装置403输出运算处理装置300运算出的信号。信号输入装置404输入运算处理装置将进行运算的信号。信号收发装置405实施与外部装置的信号收发。显示装置406显示运算处理装置300的处理的过程中的信息以及处理结果信息。
根据以上说明的第1实施方式涉及的细胞生存率判定装置，能够不使用染色试剂并且不依赖于细胞的自体荧光地判定细胞的生存率。
(第2实施方式)
如图6以及图7所示，第2实施方式涉及的细胞生存率判定装置还具备光学式粒子检测装置500。光学式粒子检测装置500例如包括：含有包含培养细胞的粒子的溶液流通的可拆卸的流路501、连接于流路501的可拆卸的测定室502、向测定室502内照射测定光的照射器503、以及测定在被照射测定光的测定室502内产生的散射光的强度的散射光测定器504。
借助于送液装置505，使含有包含培养细胞的粒子的溶液流入流路501。送液装置505由送液控制部506控制，设定溶液的流量等。流路501可从光学式粒子检测装置500上卸下。卸下的流路501可以清洗，也可以更换为新的干净的流路501。测定室502由测定光及散射光能够透过的透明构件构成。作为测定室502的材料，可以列举石英玻璃，但不限于此。测定室502可从光学式粒子检测装置500卸下。卸下的测定室502可以清洗，也可以更换为新的干净的测定室502。
在流路501及测定室502不干净的情况下，上次测定的粒子残留于流路501及测定室502，可能影响其后的测定。对此，第2实施方式的流路501及测定室502能够从光学式粒子检测装置500上卸下，因此对流路501及测定室502进行清洗就变得容易。
照射器503具备例如激光光源、以及激光光源控制装置。照射器503向测定室502内照射例如作为激光的测定光。也可以配置透镜，使焦点落在测定室502内。当对测定室502内的粒子照射测定光时，粒子上会产生米氏散射光。散射光测定器504测定粒子上产生的散射光的强度。
由散射光测定器504测定的散射光的强度经由信号收发装置405等而送至分布取得部301。如上所述，由于米氏散射光的强度反映了粒子的大小，因此分布取得部301根据各个粒子上产生的散射光的强度来获得粒子的大小的分布。
第2实施方式涉及的细胞生存率判定装置的其他构成要素与第1实施方式相同，因此省略其说明。
[实施例]
准备好添加了l-谷氨酰胺(l－グルタミン)(终浓度6mmol/l)、抗细胞结团剂anti-clumpingagent(终浓度1％)的培养基(cdopticho、注册商标、不包含蛋白质、不包含来自动物的成分、invitrogen制)。在该培养基中，以37℃、5％co2的环境悬浮培养产生曲妥珠单抗(トラスツズマブ)的cho-k1细胞。悬浮培养开始后，定期对包含细胞的培养基进行取样。
将取样的培养基以规定的倍率稀释，利用粒子检测装置(imd-w，阿自倍尔制)，对培养基中包含的各细胞照射激光，测定在每个细胞上产生的米氏散射光的强度。粒子上产生的米氏散射光的强度表示粒子的粒径。此外，对取样并稀释了的培养基中包含的细胞用锥虫蓝进行染色，利用细胞计数器对总细胞数和染色细胞数进行计数。将染了色的细胞判定为死细胞。根据判定结果计算出细胞生存率。进一步地，拍摄取样并稀释了的培养基的照片，观察培养基中的粒子。
培养开始后，每天测定的表示粒子的粒径的频数分布的直方图示于图8至图11。在直方图中，以给出频数的极小值的粒径为边境，小粒子群的分布和大粒子群的分布显现出来。根据图12所示的取样的含有细胞的培养基的图像，可以认为被分类为大粒子群的粒子包含活细胞。
相对于培养时间绘制属于小粒子群的粒子的数量相对于属于大粒子群的粒子的数量之比的值而成的曲线图示于图13。如图13所示，随着培养天数的增加，比的值有变大的倾向。另外，比的值在培养初期稍大这一情况可以认为是以前测定的小粒子残留在粒子检测装置中。此外，这之后，比的值暂时变小，这被认为是由于活细胞增殖，从而被分类为大粒子群的粒子增加了的缘故。
此外，相对于细胞的生存率绘制属于小粒子群的粒子的数量相对于属于大粒子群的粒子的数量之比的值而成的曲线图示于图14。比与细胞的生存率之间的相关性得以确认。因此表示，培养细胞时，随着培养天数的增加，培养基中被分类为小粒子群的粒子会增加，能够根据属于小粒子群的粒子的数量与属于大粒子群的粒子的数量之比推测细胞的生存率。
符号说明
300···运算处理装置
301···分布取得部
302···分类部
303···比计算部
304···生存率判定部
401···数据存储装置
402···暂时存储装置
403···信号输出装置
404···信号输入装置
405···信号收发装置
406···显示装置
500···光学式粒子检测装置
501···流路
502···测定室
503···照射器
504···散射光测定器
505···送液装置
506···送液控制部。