本发明涉及兽医生物病毒检测
技术领域：
，具体涉及一种猪塞尼卡谷病毒的rt-pcr检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：2002年，美国基因治疗公司偶然从per.c6细胞(转化的胎儿成视网膜细胞)培养基中首次发现并分离到一种新的病毒——塞尼卡谷病毒(senecavalleyvirus，svv，另称senecavirusa，sva)，是一种无囊膜、单链、正股rna病毒，属于小rna病毒科，2015年，国际病毒分类委员会(ictv)将该病毒划分至新的病毒属——塞尼卡病毒属。猪感染后通常表现为急性、自限性水疱症状。临床表现为采食量下降，之后鼻吻出现水疱性病变，可见1个或多个大小不一、充满液体的囊泡；囊泡破裂后发展成溃疡病变，在感染后10-15d形成厚痂。水疱性及溃疡性病变多出现于蹄冠部趾间裂和冠状带周围，导致边缘上皮疏松坏死，严重者跛行，站立困难。有些母猪腹部和乳房部出现红色斑点，或伴有发热和厌食症状，甚至发烧(39.5-40.5℃)，部分跛行的母猪体温可达41.0℃。新生仔猪体态虚弱，嗜睡，不愿吸乳，并出现急性死亡，在蹄掌部可见部分化脓性小泡。猪感染svv-ⅰ后出现水疱的临床表现与感染口蹄疫(fmd)、猪水疱病(svd)、水疱性口炎(vs)等极为相似，主要都是鼻子和冠状带出现水泡、跛行、厌食、嗜睡、发烧，并且持续排毒。建立一种猪塞尼卡谷病毒的反转录pcr诊断方法和专用试剂盒，能够方便在疫病发生早期快速、准确的诊断疫病，为疫病的防控提供有效的参考。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种猪塞尼卡谷病毒的rt-pcr检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒能够快速区分猪塞尼卡谷病毒。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种猪塞尼卡谷病毒的rt-pcr检测试剂盒，所述的引物组包括引物s1、s2、s3，其中：s1：5’-aacttaggctagcttaccat-3’；s2：5’-caatagctgagtcgacctgtatg-3’；s3：5’-ataagctgagtcgactgat-3’。一种所述的引物组在制备用于猪塞尼卡谷病毒鉴别诊断试剂盒中的应用。一种所述的引物组的猪塞尼卡谷病毒鉴别诊断试剂盒。所述的试剂盒还包括核酸提取试剂、反转录试剂、pcr扩增试剂、和/或琼脂糖凝胶电泳试剂。所述的反转录试剂包括10×m-mlv缓冲液、dntp、m-mlv反转录酶、rnase酶抑制剂、s2引物。所述的pcr扩增试剂包括10×pcr扩增缓冲液、dntp、s1引物、s2引物、taqdna聚合酶和双蒸水。所述的pcr扩增试剂所构建的pcr扩增体系为：10×pcr扩增缓冲液5.0μl、2.5mmol/ldntp8.0μl、10mmol/ls1引物1.0μl、10mmol/ls2引物1.0μl、5u/μltaqdna聚合酶1.0μl、模板3.0μl，补加双蒸水至50μl。一种所述的试剂盒的使用方法，包括核酸提取、反转录、pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳。所述的pcr扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。本发明的有益效果：本发明通过比对猪塞尼卡谷病毒的差异，设计特异性引物s1、s2、s3，能够对猪塞尼卡谷病毒进行特异性扩增；在此基础上研制了专用试剂盒，先提取病毒rna，再使用s2引物反转录合成cdna，并采用rt-pcr方法鉴别检测猪塞尼卡谷病毒。与现有技术相比，本发明的专用试剂盒具有很强的敏感性、特异性，对猪流行性腹泻病毒(p-edv)和猪轮状病毒(porv)的扩增结果均为阴性，能够广泛用于临床猪塞尼卡谷病毒的鉴别诊断。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法，或按照制造厂所建议的条件与实施步骤。实施例1、鉴别诊断方法的构建1、引物设计设计两条特异性引物，具体如下:s1：5’-aacttaggctagcttaccat-3’(seqidno.1)s2：5’-caatagctgagtcgacctgtatg-3’(seqidno.2)s3：5’-ataagctgagtcgactgat-3’(seqidno.3)使用s1、s2和s3进行pcr扩增，svv疫苗株预期扩增片段大小为768bp，svv现地分离株预期扩增片段大小为378bp。2、病毒rna的提取取svv毒株细胞培养液，反复冻融3次后，5000g离心15min，取上清备用。(1)取0.2ml氯仿，加入等体积的上清，剧烈摇晃15s，室温放置3min，然后12，000g，4℃离心5min。离心后分成3层，最下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，上层是无色的水相，rna存在于水相中；(2)将步骤(1)中的上层水相转移到另一只干净的ep管中，加入0.5ml预冷的异丙醇，室温静置10min，然后12,000g，4℃离心10min；(3)倒掉上清，加入1ml体积分数75％乙醇洗涤rna沉淀，混匀后，7500g，4℃离心5min；(4)倒掉上清，室温放置10min，然后加入适量无rnase水溶解rna，即得到总rna。3、反转录以步骤2提取的rna为模板，进行反转录，获得cdna，反转录反应体系为：模板rna4.9μls2引物(10mmol/l)0.3μlrtase酶抑制剂(40u/μl)0.3μlm-mlv反转录酶(200u/μl)0.5μldntp(2.5mmol/l)2.0μl10×m-mlv缓冲液2.0μl反应条件为：42℃保温60min，70℃10min。4、聚合酶链式反应(pcr)4.1pcr反应体系以步骤3获得的cdna为模板，进行pcr扩增，pcr反应体系为：4.2pcr反应条件优化对svv疫苗株的pcr反应条件进行优化，分别以退火温度为54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃进行pcr反应扩增svv疫苗株，反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸10min。发现在57和62℃可以扩增出768bp大小的片段，与预期大小一致。对svv现地分离株的pcr反应条件进行优化，分别以退火温度为52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃进行pcr反应扩增svv现地分离株，反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸10min。发现在57℃出现378bp大小的片段，与预期大小一致。综合上述反应，本发明最终将复合pcr的退火温度设置为57℃，优化后的反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。pcr扩增产物置于-20℃保存。5、电泳对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，电压100v，电泳40min，在dna凝胶成像系统仪下观察结果。本发明的专用试剂盒包括上述检测方法中所用的核酸提取试剂、反转录试剂、pcr扩增试剂、琼脂糖凝胶电泳试剂。实施例2、特异性实验分别以猪流行性腹泻病毒(p-edv)和猪轮状病毒(porv)为对照毒株，以猪塞尼卡谷病毒作为实验毒株，以上3种病毒均是引起腹泻的常见病原，且这3种病毒引起的腹泻在流行病学上、临床上和病理变化等方面极其相似，临床上很难区分。按照实施例1中的方法进行检测，结果表明，只有svv疫苗株和svv现地分离株可以得到扩增片段，其他病毒均无扩增条带产生。实验结果证实，本发明的引物和检测方法具有很高的特异性。实施例4、灵敏度实验将svv现地分离株病毒液进行10倍梯度稀释，使病毒浓度为5.4×104-5.4×10-4copies/μl，并按照实施例1的方法进行检测，结果表明，在第8泳道浓度为5.4×10-3copies/μl可扩增出预期片段，本发明的引物和检测方法的最低核酸检测量为5.4×10-3copies/μl，但第9泳道5.4×10-4copies/μl无预期大小的片段，判断其灵敏度为5.4×10-3copies/μl。将svv疫苗株病毒液进行10倍梯度稀释，使病毒浓度为1.5×104-1.0×10-4copies/μl，并按照实施例1的方法进行检测，结果表明，在第8泳道浓度为1.5×10-3copies/μl可扩增出预期片段，本发明的引物和检测方法的最低核酸检测量为1.5×10-3copies/μl，但第9泳道1.5×10-4copies/μl无预期大小的片段，判断其灵敏度为1.5×10-3copies/μl。以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。序列表<110>滕建芬<120>一种猪塞尼卡谷病毒的rt-pcr检测试剂盒及其检测方法<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1aacttaggctagcttaccat20<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2caatagctgagtcgacctgtatg23<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ataagctgagtcgactgat19当前第1页12