本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种粪污噬菌体dna的提取方法、提取粪污噬菌体dna的试剂盒及该试剂盒的应用。
背景技术：
：肠道微生物群落是耐药基因的天然储存库，动物粪污中含有较丰富的耐药基因。噬菌体是一类以细菌为宿主的病毒，是耐药基因水平转移的重要载体，因此，提取噬菌体dna是研究粪污dna中耐药基因的种类和丰度的关键。natureprotocols中详细介绍了从粪污样品中提取噬菌体dna的方法，利用cscl密度梯度离心对粪污获得的噬菌体原液进行纯化，再通过甲酰胺/ctab法提取噬菌体dna[thurber,r.v.h.,matthewbreitbart,myawegley,lindarohwer,forest,laboratoryprocedurestogenerateviralmetagenomes.natureprotocols,2009.4(4):470-483]。另一种噬菌体dna提取方法是quirós[brown-jaque,m.,calero-cáceres,w.,espinal,p.,rodríguez-navarro,j.,miró,e.,gonzález-lópez,j.j.,cornejo,t.,hurtado,j.c.,andf.navarro,muniesa,m.,antibioticresistancegenesinphageparticlesisolatedfromhumanfaecesandinducedfromclinicalbacterialisolates.internationaljournalofantimicrobialagents,2018.51(3):434-442]和colomer-lluch等[colomer-lluch,m.,imamovic,l.,jofre,j.,muniesa,m.,bacteriophagescarryingantibioticresistancegenesinfecalwastefromcattle,pigs,andpoultry.antimicrobagentschemother,2011.55(10):49008-49011.]利用100-kda超滤浓缩器对噬菌体原液进行纯化浓缩，然后通过苯酚/氯仿抽提法提取dna。上述的两种方法中，cscl密度梯度离心法对设备要求高，且离心时间长；甲酰胺/ctab法和苯酚/氯仿抽提法提取dna也都比较耗时，且甲酰胺、ctab(十六烷基三甲基溴化铵)和苯酚/氯仿都是对人体有害的溶剂。目前，急需开发一种可快速便捷粪污提取噬菌体dna方法或试剂盒。技术实现要素：为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种粪污噬菌体dna的提取方法、提取粪污噬菌体dna的试剂盒及该试剂盒的应用。本发明所采用的技术方案为：一种粪污噬菌体dna的提取方法，该方法采用超滤浓缩法和硅胶吸附柱法相结合，即首先采用超滤浓缩器浓缩纯化噬菌体，然后再采用硅胶吸附柱法提取噬菌体dna。具体的，上述粪污噬菌体dna的提取方法，包括以下步骤：(1)超滤浓缩法浓缩纯化噬菌体：对粪污进行预处理，得到滤液，利用100-kda超滤浓缩器对滤液进行浓缩，得到浓缩液；(2)硅胶吸附柱法提取噬菌体dna，具体包含以下步骤：s1:向所述浓缩液中加入dnasei，反应后加入edta灭活dnasei，得到中间液一；s2:向所述中间液一中加入蛋白酶k裂解噬菌体，反应，离心，取上清，得到噬菌体裂解液上清；s3:向所述噬菌体裂解液上清中加入dna结合液，混匀，加入乙醇，混匀，得到中间液二，将中间液二移入吸附柱，离心，去滤液，得到吸附柱一；s4:向吸附柱一中加入去蛋白液，离心，去滤液，得到吸附柱二：s5:向吸附柱二中加入漂洗液，离心，去滤液，得吸附柱；s6:重复步骤s5；s7:向吸附柱中加入te洗脱液，离心，得到滤液，即所述粪污噬菌体dna。具体的，上述粪污噬菌体dna的提取方法，所述结合液包含8mol/l盐酸胍，20mmol/ltris-hcl，所述结合液的ph为6.5。具体的，上述粪污噬菌体dna的提取方法，所述去蛋白液包含4mol/l盐酸胍，20mmol/ltris-hcl和乙醇，所述乙醇在所述去蛋白液中的体积百分数为70％，所述蛋白液的ph为6.5。具体的，上述粪污噬菌体dna的提取方法，所述漂洗液包含20mol/lnacl，2mol/ltris-hcl和乙醇，所述乙醇在所述漂洗液中的体积百分数为70％，所述漂洗液的ph为8.0。具体的，上述粪污噬菌体dna的提取方法，所述步骤s1中反应条件为37℃温育1h。具体的，上述粪污噬菌体dna的提取方法，所述s2中加入的蛋白酶k至蛋白酶k的终浓度为50μg/ml，所述s2中加入蛋白酶k后反应的条件为55℃温育1h，所述步骤s2中添加蛋白酶k时，还添加sds至sds的质量终浓度为0.5％。具体的，上述粪污噬菌体dna的提取方法，所述粪污预处理包括以下步骤：向粪便中加入sm缓冲液，震荡，过滤，得到粪污预处理液，将粪污预处理液离心取上清，过滤，得到滤液。一种利用前述粪污噬菌体dna的提取方法提取粪污噬菌体dna的试剂盒，包括硅胶吸附柱，还包括以下试剂：(1)蛋白酶k；(2)结合液，所述结合液包含8mol/l盐酸胍，20mmol/ltris-hcl，所述结合液的ph为6.5；(3)去蛋白液：所述去蛋白液包含4mol/l盐酸胍，20mmol/ltris-hcl和乙醇，所述乙醇在所述去蛋白液中的体积百分数为70％，所述蛋白液的ph为6.5；(4)漂洗液：所述漂洗液包含20mol/lnacl，2mol/ltris-hcl和乙醇，所述乙醇在所述漂洗液中的体积百分数为70％，所述漂洗液的ph为8.0；(5)te洗脱液。一种前述试剂盒在提取粪污噬菌体dna中的应用。本发明的有益效果为：通过对现有技术的改进，结合100-kda超滤浓缩器和硅胶吸附柱可以在5h内获得浓度约为53.47ng/μl的粪污噬菌体dna，本发明提供的粪污噬菌体dna的提取方法不仅缩短了提取时间，且提取的dna浓度和纯度较好，满足后期qpcr和宏基因组测序要求。附图说明图1是本发明的粪污噬菌体dna提取过程中浓缩液示意图；图2是本发明实施例2中16srdna的pcr检测结果图；图3是本发明实施例2中噬菌体基因组dna凝胶电泳图。具体实施方式下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步阐释。实施例1：本实施例的目的在于提供一种粪污噬菌体dna的提取方法，包括如下步骤：(1)称取鸡粪3g，所述鸡粪来源于25日龄罗曼粉蛋鸡的新鲜鸡粪，采集自饲养规模为5万只蛋鸡的养殖场，封闭式鸡舍；放于无菌50ml管中，加入40mlsm缓冲液，置于旋涡振荡器上充分震荡30min，使附着于粪便上的噬菌体充分释放到缓冲液中；然后用孔径100μm的筛网过滤，去除较大的颗粒杂质；滤液2,500g离心5min，接着10,000g离心10min，然后采用0.45和0.22μm滤器去除细菌和真核细胞，获得滤液。(2)参考quirós和colomer-lluch等采用的提取方法，利用100-kda超滤浓缩器对滤液直接进行浓缩纯化。新的超滤管是干燥的，使用前先加入超纯水，水量完全过膜，冰箱预冷15min。将水倒出，轻轻加入适量样品，注意液体不宜超过管顶的白线；平衡后，4000g离心10-30min(可先离心10min，观察管中液体体积再决定继续离心时间)，当浓缩到剩下1ml时，继续加入剩下的滤液，直到所有滤液都加完为止，最终浓缩至0.5-1ml，得到浓缩液如图1所示。(3)硅胶吸附柱法(以下硅胶吸附柱简称吸附柱)s1:在通过100kda超滤浓缩器离心后获得的浓缩液中加入dnasei(每1ml浓缩液中加入100ul)，37℃温育1h后进行16srdna的pcr检测；添加0.5mol/l的edta(ph＝8.0)至终浓度20mmol/l，80℃水浴2min，灭活dnasei，得到中间液一；s2:16srdna的pcr检测结果为阴性，加入蛋白酶k至终浓度50μg/ml，10％(wt/vol)的sds至sds的终浓度0.5％(wt/vol)(0.1％～1％sds对蛋白酶k有促进作用)，混匀，55℃温育1h，裂解噬菌体充分混匀后室温放置1min，12,000rpm离心3min，得到噬菌体裂解液上清；s3:上清液转移至新的1.5ml离心管，大约获得400μl上清液，加入等体积dna结合液(8mol/l盐酸胍，20mmol/ltris-hcl，ph＝6.5)，混匀后加入400μl无水乙醇，混匀，将所有液体加入吸附柱中14,000rpm离心1min(液体较多，可分两次离心)；s4:加入500μl去蛋白液(4mol/l盐酸胍，20mmol/ltris-hcl，乙醇，去蛋白液中乙醇的体积百分数为70％，ph＝6.5)，14,000rpm离心1min；s5:加入500μl漂洗液(20mmol/lnacl，2mmol/ltris-hcl，乙醇，漂洗液中乙醇的体积百分数为70％，ph＝8.0)，14,000rpm离心1min，重复漂洗一次后，14,000rpm离心2min；s6:将步骤s5中得到的吸附柱室温放置5min，晾干残留乙醇，吸附柱转移到新的1.5ml离心管中，加入60μlte洗脱液，14,000rpm离心2min，dna样品在-20℃保存。本实施例所用粪污来源于25日龄罗曼粉蛋鸡的新鲜鸡粪，采集自饲养规模为5万只蛋鸡的养殖场，封闭式鸡舍；本实施例所用试剂：dnasei、蛋白酶k购自成都艺萌科技有限公司，2×taqpcrmastermix、goldview染料、琼脂糖、dna0marker2000plμs购自成都擎科梓熙生物技术有限公司。te洗脱液中包含2mol/ltris/0.2mol/ledta，ph＝8.5，余量为水。配置方式：称取24.228gtris-base，加入40ml0.5mol/ledta(ph＝8.0)和30ml蒸馏水，调整ph至8.5，加水补至100ml，0.22μm滤膜过滤除菌。sm缓冲液(50mmol/ltris(ph7.5)，100mmol/lnacl，8mmol/lmgso4，0.002％明胶)：称取nacl5.8g，mgso4·7h2o2g，1mol/ltris50ml，质量百分数为2％的明胶水溶液5ml，蒸馏水定容到1l，121℃、20min高压灭菌。实施例2：本实施例的目的在于对比本发明提供的一种粪污噬菌体dna的提取方法与其他dna提取方法提取效果的差异。本实施例所用粪污来源于25日龄罗曼粉蛋鸡的新鲜鸡粪，采集自饲养规模为5万只蛋鸡的养殖场，封闭式鸡舍；本实施例所用试剂：dnasei、蛋白酶k购自成都艺萌科技有限公司，2×taqpcrmastermix、goldview染料、琼脂糖、dnamarker2000plμs购自成都擎科梓熙生物技术有限公司。本实施例所用其他试剂的配制：(1)sm缓冲液(50mmol/ltris(ph7.5)，100mmol/lnacl，8mmol/lmgso4，0.002％明胶)：称取nacl5.8g，mgso4·7h2o2g，1mol/ltris50ml，质量百分数为2％的明胶水溶液5ml，蒸馏水定容到1l，121℃、20min高压灭菌。(2)cscl溶液：按表1称取相应质量的cscl加无菌水溶解后补至10ml。表1cscl密度g/mlcscl质量g总体积ml1.22.238101.45.388101.56.748101.658.75610(3)ctab/nacl溶液：1gnacl加入15ml蒸馏水中，缓慢加入2.5gctab，可以在65℃溶解，0.22μm滤膜过滤，保持无菌最多室温存放一个月。(4)te洗脱液中包含2mol/ltris/0.2mol/ledta，ph＝8.5，余量为水。配置方式：称取24.228gtris-base，加入40ml0.5mol/ledta(ph＝8.0)和30ml蒸馏水，调整ph至8.5，加水补至100ml，0.22μm滤膜过滤除菌。1、家禽粪污噬菌体浓缩和纯化称取鸡粪3g，放于无菌50ml管中，加入40mlsm缓冲液，置于旋涡振荡器上充分震荡30min，使附着于粪便上的噬菌体充分释放到缓冲液中；然后用孔径100μm的筛网过滤，去除较大的颗粒杂质；滤液2,500g离心5min后10,000g离心10min，然后采用0.45和0.22μm滤器去除细菌和真核细胞，获得滤液。将所得滤液通过后续3种方法提取噬菌体dna，并比较三种方法所得的噬菌体dna的质量。方法1，cscl密度梯度离心法+甲酰胺/ctab法；方法2，100kda超滤浓缩+苯酚/氯仿抽提法；方法3，本发明的方法。下一步进行滤液中噬菌体的浓缩和纯化，有两种方法：(1)peg浓缩+cscl密度梯度离心纯化参考thurber等的方法，首先利用peg浓缩滤液，加入10％(w/v)固体聚乙二醇8000(peg-8000)沉淀噬菌体颗粒，为获得最佳效果，在4℃下过夜沉淀；然后11,000g下离心样品20min，弃上清液，将含有噬菌体颗粒沉淀的离心管倒置5分钟以除去残余液体；加入1-2mlte缓冲液(ph＝7.6)重悬噬菌体颗粒，获得噬菌体原液。接着通过cscl密度梯度离心对噬菌体原液进行纯化。首先从最重到最轻密度灌注超速离心管，在离心管外做好密度标记，密度分别为1.65，1.5，1.4和1.2g/ml；密度梯度离心管灌注好以后从顶端小心加入样品，在离心之前要将离心管调平，可以适当添加或者取走部分样品液；对于噬菌体，22,000rpm(大约60,000g)4℃离心4h，不同病毒采用不同的离心力和时间；准备无菌注射器，将离心管置于合适的收集管上，将针尖置于合适的梯度层，对于噬菌体可以放置在1.5g/ml层，缓慢地将样品液抽到注射器中，然后再转移到离心管中，添加分子生物类型的氯仿到滤液中(所加氯仿的量为所抽得样品的0.2倍体积)。注意操作时一定要缓慢轻柔，避免物理剪切力破坏病毒颗粒。离心完成后的样品4℃保存备用。(2)100-kda超滤浓缩器直接浓缩纯化参考quirós和colomer-lluch等采用的提取方法，利用100-kda超滤浓缩器对滤液直接进行浓缩纯化。新的超滤管是干燥的，使用前先加入超纯水，水量完全过膜，冰箱预冷15min。将水倒出，轻轻加入适量样品，注意液体不宜超过管顶的白线；平衡后，4000g离心10-30min(可先离心10min，观察管中液体体积再决定继续离心时间)，当浓缩到剩下1ml时，继续加入剩下的滤液，直到所有滤液都加完为止，最终浓缩至0.5-1ml，如图1。2、噬菌体dna的提取(1)甲酰胺/ctab法参考thurber等的方法，在完成cscl密度梯度离心的样品中加入dnasei，1ml样品加入100μl的dna酶，37℃温育1h后进行16srdna的pcr检测，结果若为阴性就可以继续按照以下步骤操作：s1:首先提取病毒粒子，加入2mol/l的tris-hcl(ph＝8.5)和0.2mol/l的edta，使2mol/ltris-hcl(ph＝8.5)和0.2mol/ledta的加入量为样品体积的0.2倍体积。每10ml样品加入100μl0.5mol/ledta(ph＝8.0)，甲酰胺的加入量与样品的体积相同(甲酰胺有毒)，加入1-10μl糖原(20mg/ml)，室温(20-25度)孵育30min；s2:加入100％乙醇，乙醇的加入量为样品的2倍体积，4℃、12000g离心20min，沉淀dna；s3:沉淀用70％的乙醇洗两次，再次离心后加入567μl的te重新悬浮dna；s4:加入30μl10％(wt/vol)的sds和3μl20mg/ml的蛋白酶k，混匀后55度温育1h；s5:加入100μl5mol/lnacl，混匀后添加80μlctab/nacl溶液，混匀，65度温育10min，得到中间液；s6:加入与步骤s5中得到的中间液等体积的氯仿，混匀，8000g室温离心5min(氯仿有毒)；s7:将上清液转移到新的管子，加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇，混匀，8000g室温离心5min(苯酚/氯仿/异戊醇有毒)，转移上清液到新的管子，避免扰动有机层；s8:加入与s7中得到的上清液等体积氯仿到上清液中，混匀，8000g室温离心5min；转移上清液，加入0.7倍体积的异丙醇，轻柔的混匀，直到dna沉淀(-20℃存放2h或者4度过夜存放)；s9:4℃13,000g离心15min，去除上清液，加入500μl4℃预冷的70％乙醇，洗dna沉淀，离心；去除乙醇，室温风干20min，但是不要过于干燥，加入50μlte悬浮dna，最后噬菌体颗粒dna于-20℃保存。为确保没有细菌dna污染，采用常规方法做16srdna的pcr检测。(2)苯酚/氯仿抽提法s1:参考quirós和colomer-lluch等采用的方法，在通过100-kda超滤浓缩器离心后获得的浓缩液中加入dnasei(100μl/ml)，37℃温育1h后进行16srdna的pcr检测；添加0.5mol/l的edta(ph＝8.0)至终浓度20mmol/l，80℃水浴2min，灭活dnasei；s2:16srdna的pcr检测结果为阴性，加入蛋白酶k至终浓度50μg/ml，10％(wt/vol)的sds至sds终浓度(wt/vol)为0.5％(0.1％～1％sds对蛋白酶k有促进作用)，混匀，55℃温育1h，裂解噬菌体；s3:加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇溶液，混匀；苯酚氯仿/噬菌体溶菌产物混合液加到管中，即phaselockgeltubes(5prime；vwrinternational,madrid,spain)，根据说明离心，5000g，10min，分开水相和有机相；s4:取上清，加入1/10体积的ph＝5.2，3mol/l的醋酸钠和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀1h或过夜；s5:4℃，12,000g离心20min，去上清，回收dna沉淀，沉淀分别用70％乙醇1～2次(吸取dna沉淀中的盐离子并且也能起到沉淀dna的作用)，4℃、12,000g离心10min，去乙醇，室温晾干沉淀。s6:向dna沉淀中加入100μl的te溶液，-20℃保存dna。(3)硅胶吸附柱法s1:在通过100kda超滤浓缩器离心后获得的浓缩液中加入dnasei(100μl/ml)，37℃温育1h后进行16srdna的pcr检测；添加0.5mol/l的edta(ph＝8.0)至终浓度20mmol/l，80℃水浴2min，灭活dnasei，得到中间液一；s2:16srdna的pcr检测结果为阴性，加入蛋白酶k至终浓度50μg/ml，10％(wt/vol)的sds至sds的终浓度0.5％(wt/vol)(0.1％～1％sds对蛋白酶k有促进作用)，混匀，55℃温育1h，裂解噬菌体充分混匀后室温放置1min，12,000rpm离心3min，得到噬菌体裂解液上清；s3:上清液转移至新的1.5ml离心管，大约获得400μl上清液，加入等体积dna结合液(8mol/l盐酸胍，20mmol/ltris-hcl，ph＝6.5)，混匀后加入400μl无水乙醇，混匀，将所有液体加入吸附柱中14,000rpm离心1min(液体较多，可分两次离心)；s4:加入500μl去蛋白液(4mol/l盐酸胍，20mmol/ltris-hcl，乙醇，去蛋白液中乙醇的体积百分数为70％，ph＝6.5)，14,000rpm离心1min；s5:加入500μl漂洗液(20mmol/lnacl，2mmol/ltris-hcl，乙醇，漂洗液中乙醇的体积百分数为70％，ph＝8.0)，14,000rpm离心1min，重复漂洗一次后，14,000rpm离心2min；s6:将步骤s5中得到的吸附柱室温放置5min，晾干残留乙醇，吸附柱转移到新的1.5ml离心管中，加入60μlte洗脱液，14,000rpm离心2min，dna样品在-20℃保存。3、粪污噬菌体颗粒dna的纯化为了获得纯度更好的噬菌体dna用于宏基因组测序，将获得的dna再通过genomicdnacleanandconcentrator-25试剂盒(zymoresearch,theepigeneticscompany)进一步纯化，按照试剂盒操作说明书操作。4、粪污噬菌体基因组完整性的检测取2μl前述方法所得的噬菌体dna加入10μl6×loadingbμffer充分混匀后进行凝胶电泳，通过观察dna条带判断噬菌体dna的提取质量，主带在20kb以上说明基因组完整性较好。5、结果(1)dnasei对噬菌体颗粒的处理为确保消除外源细菌dna的污染，在蛋白酶k裂解噬菌体颗粒之前，必须用dnasei进行处理，结果显示dnasei处理后16srdna的pcr检测结果为阴性，表明dnasei处理有效。结果如图2所示。1-3分别为方法1、2、3过程中dnasei处理的样品，4为阳性对照，5为阴性对照，m为markerdl2000plus，由图2中可知，方法1、2、3过程中dnasei处理的样品均消除了外源细菌dna。(2)鸡粪噬菌体dna的质量比较噬菌体基因组dna凝胶电泳图(图3)显示了三种方法提取的dna完整性，图3中1-3分别为方法1、2和3提取的dna；m为markerdl2000plus，由图3可知，三种方法提取的dna较好，主带在均20kb以上，其中方法3的所得的dna的条带相对较亮。三种方法提取的鸡粪噬菌体颗粒dna浓度及纯度如表2所示。根据核酸纯度评价指标，a260/a280的比值应该在1.8-2.0之间。结果显示方法3提取效果较好，dna浓度高且蛋白和rna污染程度小；方法1使用甲酰胺/ctab法抽提，存在蛋白污染，且三个重复之间差异较大，提取效果不稳定；方法2提取的dna浓度是最低的。通过进一步纯化以后，结果如表3所示，方法3提取的dna浓度降低，但是蛋白污染基本消除；第1、2种方法纯度也提高，但是dna浓度较低(表3)。表2表3(3)三种方法提取粪污噬菌体dna的效果比较三种方法提取粪污噬菌体dna的效果比较的效果如表4所示，粪污噬菌体原液的浓缩纯化，100-kda超滤浓缩器具有明显的优势，省时而且操作简便，可以在1h以内完成；而peg浓缩后进行cscl密度梯度离心法耗时，还需要使用超高速离心机，而且cscl为重金属盐。其次硅胶吸附柱法可以快速得到高质量的dna，在提取噬菌体dna时具有明显优势。因此可以看出，本发明提供的粪污噬菌体dna的提取方法结合了100-kda超滤浓缩器浓缩纯化和硅胶吸附柱法是提取粪污噬菌体dna的最佳方法。表4首先对粪污噬菌体滤液进行浓缩纯化时，方法1中cscl密度梯度离心对仪器要求较高，cscl属于重金属盐，而且传统苯酚/氯仿/异戊醇抽提法需要使用对人体有毒有害的有机试剂，且耗时长。方法2，即鸡粪在进行预处理后采用100-kda超滤浓缩器对噬菌体滤液进行纯化和浓缩，然后通过苯酚/氯仿抽提法获得噬菌体dna，此方法明显缩短了获得dna的时间，本发明提供的粪污噬菌体dna的提取方法在此基础上将苯酚/氯仿抽提法改进为硅胶吸附柱收集纯化，在5h内获得了纯度和浓度都较好的噬菌体dna。硅胶吸附柱可以在高盐低ph条件下有效吸附dna，达到很好的分离纯化效果。因此本研究的优化方案可以在较短时间内成功提取鸡粪样品中的噬菌体dna，为后续研究奠定了基础。本发明提供的粪污噬菌体dna的提取方法和试剂盒不仅可用于鸡粪还可用于其他粪便中噬菌体dna的提取。本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。当前第1页12