本发明属于生物基因治疗领域，具体涉及一种抑制人恶性脑胶质瘤的靶向auf1基因的抑制剂及其应用。
背景技术：
恶性胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤之一。尽管以外科手术治疗为基础，结合术后放化疗的综合性治疗广泛应用，但是恶性胶质瘤患者中位生存期仍不超过15个月，肿瘤易复发，患者死亡率极高(phillipsetal.,molecularsubclassesofhigh-gradegliomapredictprognosis,delineateapatternofdiseaseprogression,andresemblestagesinneurogenesis.9(3):157-173.2006)。胶质瘤是一种典型的血管依赖性实体肿瘤(vanmeiretal.excitingnewadvancesinneuro-oncology:theavenuetoacureformalignantglioma.60(3):166-193.2010)，丰富的肿瘤血管生成和难以抑制的肿瘤血液供应一直是临床治疗的难点之一(reardonandwen,gliomain2014:unravellingtumourheterogeneity-implicationsfortherapy.12(2):69-70.2015)。
体内血管生成由血管形成及血管新生两种方式构成：前者由内皮祖细胞或者血管母细胞形成新血管；后者由组织中既存的成熟血管内皮细胞发生增殖和游走形成小血管。与其他实体性肿瘤血管发生一样，血管新生是胶质瘤血管生成的主要形式(vanmeiretal.,excitingnewadvancesinneuro-oncology:theavenuetoacureformalignantglioma.60(3):166-193.2010)。胶质瘤的血管新生是一个涉及既存血管内皮细胞激活、增殖、迁移、基底膜与细胞外基质降解、内皮细胞重塑形成管腔样结构的复杂过程。
随着“精准医疗计划”的推进和基因研究的发展，肿瘤的靶向治疗已成为肿瘤治疗领域的新热点。而抗血管新生的靶向治疗成为胶质瘤研究的新方向(fineetal.,phaseiitrialofthalidomideandcarmustineforpatientswithrecurrenthigh-gradegliomas.21(12):2299-2304.2003)。特异性的靶向药物通过结合递药载体，靶向性传递到肿瘤组织内部，能够有效提高药物在肿瘤组织中的药物浓度，降低药物在其他组织器官内的分布，提高靶向药物的疗效、降低药物毒副作用。
auf1隶属于异源核核糖核蛋白（hnrnps）亚家族，编码基因定位于人染色体4q21.22，主要表达于细胞核，并在细胞核和细胞质中穿梭。近年来发现auf1在肝癌、乳腺癌中高表达，发挥促肿瘤作用。例如auf1通过结合细胞周期蛋白依赖激酶抑制蛋白p16ink4a，刺激乳腺癌细胞增殖和上皮间质转化(al-khalafandaboussekhra,p16(ink4a)inducessenescenceandinhibitsemtthroughmicrorna-141/microrna-146b-5p-dependentrepressionofauf1.56(3):985-999.2017)。auf1高表达与肝癌患者甲胎蛋白表达相关，提示肝癌患者预后不良(yangetal.,au-bindingfactor1expressionwascorrelatedwithmetadherinexpressionandprogressionofhepatocellularcarcinoma.35(3):2747-2751.2014)。作为一种rna结合蛋白，auf1结合于靶基因信使rna（mrna）的au碱基富集区（ares），参与靶基因mrna稳定性调控。ares位于靶基因3′非翻译区(3′utr)，长度约40-120个碱基，常包括auuua或者uuauuuauu重复序列。auf1募集并结合富含ares的mrna，形成反式作用复合体，并降解靶基因mrna。经检索，关于auf1在胶质瘤中的作用和相关机制，目前国内外尚未见报道。
rna干扰技术的原理是利用dicer酶切割rna分子，形成rna沉默复合体，靶向结合目标rna分子进而降解rna分子的过程，主要是通过小双链rna(sirna)或者小发夹rna（shorthairpinrna，shrna）发挥作用。shrna是一种特异性茎环结构的rna序列，通过rna干扰机制发挥作用，导致靶基因沉默。
本发明希望利用rna干扰技术研制auf1基因的抑制剂，为胶质瘤抗血管新生治疗寻找新的作用靶点，在胶质瘤基因治疗领域发挥作用。
技术实现要素：
本发明的目的就是为了解决恶性胶质瘤的抗血管生成基因治疗问题，以rna干扰技术为基础，通过人工合成auf1靶向shrna可以靶向作用于auf1基因的mrna，从而阻断其翻译过程，达到使auf1基因表达降低的结果，而提供一种抑制人恶性脑胶质瘤血管新生的靶向auf1基因的抑制剂和应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种auf1基因的靶向抑制剂，针对auf基因的mrna版本号为nm_001003810.1转录本，经过blast特异性比对，该靶向抑制剂的核苷酸序列为：
5’-tggatcaaaaagaacataaattg-3’（seqidno.1）。
所述靶向抑制剂能够抑制auf1基因表达的shrna序列，所述shrna模板序列包括正义链和反义链，所述正义链和反义链分别为：
正义链：
5’-
caccauuuauguucuuuuugaucuccattcaagagagaucaaaaagaacauaaauugttttttg-3’（seqidno.2）；
反义链：
5’-
gatccaaaaaaauuuauguucuuuuugaucuccatctcttgaagaucaaaaagaacauaaauug-3’（seqidno.3）。
所述转录shrna序列的转录产物，序列为：
5’-auuuauguucuuuuugaucuccattcaagagaaucaaaaagaacauaaauug-3’（seqidno.4）。
所述auf1基因抑制剂能够抑制人恶性脑胶质瘤血管新生。
一种auf1基因抑制剂作为制备用于治疗人脑胶质瘤药物中的应用，该抑制剂为任何药物治疗学上可接受的的剂型。优选的，该抑制剂的剂型为注射制剂。
优选的，该抑制剂为任何药物治疗学上可接受的的剂量。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
1.本发明靶向抑制剂特异性强，序列高度保守，显著抑制auf1基因的表达，从而能够抑制人恶性脑胶质瘤血管新生。
2.该抑制剂制备技术可实现，auf1基因抑制剂靶向治疗，针对性强，能显著降低传统治疗药物的耐药问题。
3.实验已证明在体外细胞学和实验动物两个水平上应用，治疗效果确切，无不良反应发生。
附图说明
图1为应用real-timepcr检测auf1基因mrna表达水平显著增高的柱状图。
图2为应用westernblot检测auf1基因蛋白表达水平显著增高的条带和统计图。
图3为应用real-timepcr检测应用auf1基因抑制剂后，胶质瘤血管内皮细胞中的auf1表达水平显著下调的柱状图。
图4为cck-8细胞活力法检测应用auf1基因抑制剂后，显著抑制胶质瘤微血管内皮细胞增殖被显著抑制的柱状图。
图5为transwell细胞迁移实验检测应用auf1基因抑制剂后，显著抑制胶质瘤微血管内皮细胞迁移的照片。
图6为流式细胞仪annexinv-fitc/pi双染法检测应用auf1基因抑制剂后,促进胶质瘤微血管内皮细胞凋亡的照片。
图7为matrigel体外三维血管生成实验检测应用auf1基因抑制剂后，显著抑制胶质瘤的血管内皮细胞体外成管能力的照片和统计图。
图8建立裸鼠移植瘤模型，应用auf1基因抑制剂后，显著抑制移植瘤的生长的照片。
图9建立裸鼠移植瘤模型，应用auf1基因抑制剂后，荷瘤小鼠生存期分析图。
具体实施方式
一、胶质瘤的血管内皮细胞培养和条件培养基的制备。
人脑微血管内皮细胞系由法国巴黎笛卡尔大学pierre-oliviercouraud教授惠赠，恶性胶质瘤细胞由人恶性胶质瘤组织分离获得。所有组织标本来源于神经外科手术切除废弃组织，经伦理委员会批准获取。人脑微血管内皮细胞培养于内皮细胞专用ebm-2培养液(按照说明书加入ebm-2添加物，包括vegf、egf、bfgf、氢化可的松、抗坏血酸、庆大霉素、胎牛血清)，每2天更换一次培养液，约5-7天内皮细胞可长至单层。恶性胶质瘤细胞培养于含10%胎牛血清的dmem高糖培养液，每2天更换一次培养液，约2-3天细胞可长至单层。参照文献，将恶性胶质瘤细胞和人脑微血管内皮细胞共培养，在共培养体系下，100mm细胞培养皿中，每个培养皿接种100,000个恶性胶质瘤细胞，每天更换一次培养液，待细胞密度达到80%左右，弃去原瓶中的培养液，pbs洗2遍，以除去残留的血清。然后，加入含5%胎牛血清的ebm-2培养液，培养肿瘤细胞24h后，收集细胞培养液于15ml离心管，800g低速离心3min，取上清，重新按照说明书加入ebm-2添加物，包括vegf、egf、bfgf、氢化可的松、抗坏血酸、庆大霉素以及使终浓度为5%的fbs，在共培养体系上层接种人脑微血管内皮细胞，共培养体系下获得胶质瘤微血管内皮细胞。
二、real-timepcr
1.real-timepcr检测auf1基因的表达。
（1）trizol法提取组织细胞中的总rna。
①用冷pbs洗涤收集的细胞，加入1mltrizol试剂吹打数次，镜下观察细胞成油滴状（充分裂解），后移入1.5mlep管中，静置5分钟，使其充分裂解；②向样品中加入0.2ml氯仿，手动剧烈震荡室温下静置3分钟；③于4℃12000g离心15分钟，取上层水相到新的ep管中，再加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温下静置10分钟；④4℃12000g离心15分钟后弃上清，加入1ml75%乙醇；⑤4℃7500g离心5分钟，干燥15分钟后加入40μldepc水，样品可冻存于-80℃冰箱。
（2）一步染料法qrt-pcr检测auf1的表达：
测定ct值，以gapdh为内参照，以2-△△ct表示auf1的相对表达量。
real-timepcr检测正常脑组织、低级别胶质瘤和高级别胶质瘤组织中auf1的mrna表达水平，实验结果如图1所示，auf1基因在胶质瘤组织中的表达水平较正常脑组织显著增高。
三、westernblot
1.应用westernblot检测auf1基因的表达。
(1)组织标本加入ripa蛋白裂解液，震荡摇匀，冰上静置30min,4°c条件下12000g离心30min；
(2)获得并收集上清并采用bca法测定样品的蛋白浓度；
(3)取40mg蛋白与5x上样缓冲液混合(1:4)，煮沸5min变性；
(4)将变性蛋白加入8-10%不等的sds变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；
(5)转膜：电压100v，电流120ma,转膜时间根据蛋白分子量决定，90min-200min；
(6)5%脱脂牛奶封闭2h；
(7)一抗稀释液以一定比例稀释相关抗体封膜，4°c过夜；
(8)ttbs洗5min，3次，加相应二抗，室温摇床上孵育2h；
(9)ecl发光，照相，quantityone软件定量分析。
分别检测正常脑组织恶性胶质瘤组织中auf1的蛋白表达，实验结果如图2所示，auf1基因蛋白在恶性胶质瘤组织中的表达水平显著增高。
四、auf1基因抑制剂的制备和应用。
在pubmed搜索auf1基因序列，利用thomofisher公司在线软件设计auf1基因的干扰序列，选定靶向人auf1基因并特异性抑制auf1基因表达的核苷酸序列如下：
5’-tggatcaaaaagaacataaattg-3’（seqidno.1）。
在ncbi的同原序列比对分析nucleotideblast中输入tggatcaaaaagaacataaattg序列进行比对分析，结果表明该序列和人的其它mrna基因没有高度同源性，可作特异性干扰auf1基因的特异性序列。
针对以上靶序列设计靶向人auf1基因而抑制auf1基因表达的shrna模板序列如下，包括正义链和反义链，此shrna序列为：
正义链：
5’-
caccauuuauguucuuuuugaucuccattcaagagagaucaaaaagaacauaaauugttttttg-3’（seqidno.2）；
反义链：
5’-
gatccaaaaaaauuuauguucuuuuugaucuccatctcttgaagaucaaaaagaacauaaauug-3’（seqidno.3）。
转录上述的shrna的转录产物，序列为：
5’-auuuauguucuuuuugaucuccattcaagagaaucaaaaagaacauaaauug-3’（seqidno.4）。
将以上序列信息连接载体制备相应质粒，作为auf1基因抑制剂。auf1基因抑制剂转染：sh-nc、sh-auf1的质粒u6/gfp/neo,使auf1表达沉默，不含有auf1序列或shrna的空质粒为对照组；应用24孔培养板培养胶质瘤的血管内皮细胞，当细胞生长达到80%左右时进行转染；配置转染需要的质粒、opti-mem®ⅰ和ltxandplusreagent(lifetechnologies)转染试剂。a管：一个孔按照1μg质粒dna溶解于50μlopti-mem®ⅰ+1μlp3000，放置5min，b管：孔按照1μlltxandplus溶解于50μlopti-mem®ⅰ中；将a、b两管混匀后静置5min；吸出培养液，每孔加入转染混合液100µl，再加入ebm-2培养液400µl，48h后进行后续实验。在后续实验中分为3组，分别是：不加任何处理的空白组;转染auf1沉默空质粒的对照组；转染auf1沉默质粒的抑制剂组。
应用real-timepcr分别检测各组auf1基因的表达水平，相对于空白组和对照组，应用auf1基因的抑制剂后，胶质瘤的血管内皮细胞中的auf1的mrna表达水平显著下调（如图3所示）。
四、胶质瘤的血管内皮细胞增殖实验
胶质瘤的血管内皮细胞用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液。计数细胞，以2000个/孔的浓度接种于96孔细胞培养板。每组设5个复孔，每孔共计200ul。24h后加入10ulcck-8试剂。2h后用酶标仪测定波长450nm时各孔光吸收值。实验数据分析，计算出各组细胞的细胞活力。
实验结果可知，cck-8细胞活力法检测细胞增殖能力变化，相对于空白组和对照组，应用auf1基因抑制剂后，显著抑制了胶质瘤的血管内皮细胞增殖能力（如图4所示）。
五、胶质瘤的血管内皮细胞迁移实验
检测细胞迁移能力：在24孔板中各孔添加600µl含有血清的ebm-2培养液，之后放上聚碳酸酯小室；将不同组的胶质瘤的血管内皮细胞用胰酶消化后轻轻吹散后离心，加入不含血清的ebm-2培养液将细胞进行重悬，各个小室里添加100μl细胞悬液，均匀地铺在上室，大概有104个细胞。放置于37℃细胞培养箱中培养24h；24h后拿出小室，使用棉签轻轻把上室里面擦干净，使用pbs清洗小室并晾干。之后配置固定液，根据甲醇∶冰乙酸=3∶1的配比进行配置，即750ml的甲醇+250ml的冰乙酸吹打混匀；把小室浸没到固定液中固定细胞30min；使用pbs清洗小室并晾干，把吉姆约200µl萨染料铺于倒置小室底部，染色至少30min；使用pbs清洗小室两次，放于倒置显微镜下，在400×镜下观察，随机选择5个视野进行细胞个数统计，计算获得细胞迁移能力数据。
实验结果可知，transwell细胞迁移实验检测各组细胞迁移能力的变化，相对于空白组和对照组，应用auf1基因抑制剂后，胶质瘤的血管内皮细胞迁移数目显著减少（如图5所示）。
六、细胞凋亡实验
（1）用预冷的pbs清洗细胞两次。用不含edta的胰酶消化，将细胞轻轻吹打成细胞悬液后转移至1.5ml离心管中，1000rpm离心3分钟收集细胞。
（2）用pbs继续清洗，1000rpm离心3分钟，离心后倒掉上清。重复两次。
（3）将工作液10×bindingbuffer稀释十倍。每管加入100µlbindingbuffer，悬浮细胞。
（4）每管相继加入5µlannexinv-fitc和5µlpi混匀，室温避光15分钟。
（5）上机前向每管加入400µl1×bindingbuffer，吹打均匀后，上流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。
实验结果可知，流式细胞仪annexinv-fitc/pi双染法检测各组的细胞调亡率，相对于空白组和对照组，应用auf1基因抑制剂后，促进了胶质瘤的血管内皮细胞凋亡（如图6所示）。
七、matrigel体外血管形成实验
matrigel胶原液融化后，96孔细胞培养板每孔加入50ul，取胶质瘤的内皮细胞，0.25%的胰蛋白酶消化，分别用正常内皮培养液和胶质瘤条件培养液制成单细胞悬液。计数细胞，以1500个/孔的浓度接种于96孔细胞培养板。培养24h后显微镜观察，5个高倍镜视野下拍照，计数形成的微血管分支数长度。
实验结果可知，相对于空白组和对照组，应用auf1基因抑制剂后，胶质瘤的血管内皮细胞体外成管能力显著降低（如图7所示）。
八、裸鼠皮下移植瘤模型实验
所有动物实验均得到实验动物管理委员会的批准。4周龄的balb/c无胸腺裸鼠购于中国医学科学院癌症研究所。将动物随机分为三组(每组5只)。实验分组如下：空白组、对照组和抑制剂组。
对于移植瘤实验，5×105个细胞注入4周龄的balb/c无胸腺裸鼠的皮下。每5天记录存活裸鼠的数量，直到45天。肿瘤大小测定，每组5只，观察各组小鼠移植瘤大小，记录各组小鼠的生存时间。
实验结果如图8所示，相对于空白组和对照组，应用auf1基因抑制剂后，小鼠移植瘤体积显著缩小。
实验结果如图9所示，相对于空白组和对照组，应用auf1基因抑制剂后，移植瘤荷瘤小鼠总体生存时间显著延长。
九、统计学方法
以上所有的实验都单独重复三次，数据都用平均值±标准差来表示。多组数据间利用统计软件spss19.0，使用单因素方差分析（anova）法进行分析是否有组间差异，当p值<0.05则认为有统计学意义。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>中国医科大学附属盛京医院
<120>抑制人恶性脑胶质瘤的靶向auf1基因抑制剂及其应用
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