本发明涉及生物技术领域中的检测莴苣花叶病毒的成套试剂。
背景技术：
莴苣(lactucasatival.)是菊科莴苣属植物，是常见的蔬菜之一。高品质的莴苣中含有丰富的无机盐、维生素、烟酸以及微量元素，莴苣中的无机盐有助于调节体内盐的平衡，烟酸可帮助糖尿病人改善糖的代谢功能，维生素和微量元素可维持人正常生命活动，然而莴苣花叶病毒病的发生可严重影响莴苣的品质，导致莴苣的营养价值降低。
莴苣花叶病毒病由莴苣花叶病毒(lettucemosicvirus，lmv)侵染引起，在自然条件下莴苣感染莴苣花叶病毒后，叶片边缘出现不规则和皱缩症状，继而出现淡绿色或淡黄色斑驳或者花叶症状；病害发生严重时，可导致莴苣严重矮化，结籽率下降，严重影响莴苣产量和质量。lmv是马铃薯y病毒科(potyviridae)马铃薯y病毒属(potyvirus)重要成员之一，其核酸为正义单链rna(+ssrna)，病毒粒体为线状。lmv的自然寄主包括莴苣(lactucasatival.)、菠菜(spinaciaoleraceal.)及豌豆(pisumsativuml.)等多种植物，lmv可通过莴苣种子传递给下一代，并通过蚜虫迅速传播，可导致病害大面积流行。
常用的lmv检测方法主要有生物学测定、血清学测定、病毒粒子特性观察以及分子检测。生物学以及血清学检测方法的检测灵敏度低、耗时长且工作量大；病毒粒子特性观察需使用的电子显微镜，而电子显微镜的高成本及低普及率限制了该技术的发展；目前使用最多的是分子检测技术，主要包括rt-pcr、荧光定量pcr和数字pcr等，这些分子检测技术都需要经过预变性、变性、退火及延伸等步骤，每个步骤都需要热循环仪来保证其对温度的特殊要求且整个过程耗时长。因此解决分子检测技术对温度的限制及耗时长的问题对于病毒检测具有重要意义。
重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplification，rpa)是近年来兴起的一种常温核酸扩增技术。rpa技术模仿体内核酸复制机制，在能结合单链核酸的重组酶uvsx、单链结合蛋白(ssb)gp32及链置换dna聚合酶bsu的作用下进行核酸分子的扩增。重组酶uvsx能在常温下解开双链dna，反应开始进行时，重组酶uvsx与单链引物dna结合，形成核酸蛋白复合体，复合体识别与引物序列互补的模板dna并形成d环状，与此同时，ssb与被置换的单链结合使单链稳定。然后，重组酶uvsx被降解，链置换dna聚合酶bsu与核酸蛋白复合体的3′端开始链的延伸，新链与原始链互补配对完成扩增。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是如何检测莴苣花叶病毒。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测或辅助检测莴苣花叶病毒的成套试剂，所述成套试剂由名称为p1的引物对和名称为a1的dna组成；
所述p1由序列表中序列1和序列2所示的两条单链dna组成；
所述a1为含有所述p1的识别序列的dna。
所述a1可为a1)或a2)：
a1)含有序列表中序列3所示dna片段的dna；
a2)序列表中序列3所示的dna片段。
a1)具体可为含有序列表中序列3所示dna片段的重组质粒。在本发明的一个实施例中，所述重组质粒为将序列3所示的dna片段连接至载体pmd18-t的多克隆位点得到的重组质粒。所述重组质粒具体是将载体pmd18-t用ecorv进行酶切，产生ta克隆位点，得到载体片段，连接所述载体片段与序列3所示的dna片段所得到的重组质粒
本发明还提供了检测或辅助检测莴苣花叶病毒的引物对，所述引物对为所述p1。
本发明检测或辅助检测莴苣花叶病毒的系统，包括所述成套试剂或所述引物对。
上述系统系统还包括进行重组酶聚合酶扩增所需的其他试剂和/或仪器。
所述进行重组酶聚合酶扩增所需的其他试剂可为rpa扩增试剂盒twistampbasicrtkits(tabasrt01kit)中试剂。
所述系统可为试剂盒。
本发明还提供了检测莴苣花叶病毒的方法，所述方法包括x1)或x2)：
x1)利用所述成套试剂对待测样本的基因组rna进行重组酶聚合酶扩增，得到扩增产物；若所述扩增产物含有272bp的dna片段和所述a1的dna片段，则所述待测样本含有或候选含有莴苣花叶病毒或所述待测样本为或候选为莴苣花叶病毒；若所述扩增产物含有所述a1的dna片段，不含有272bp的dna片段，则所述待测样本不含或候选不含莴苣花叶病毒或所述待测样本不为或候选不为莴苣花叶病毒；若所述扩增产物不含所述a1的dna片段和272bp的dna片段或含有272bp的dna片段不含有所述a1的dna片段，则扩增反应无效，需重新检测；
x2)利用所述成套试剂对待测样本的基因组rna进行重组酶聚合酶扩增，得到扩增产物；若所述扩增产物含有272bp和428bp的dna片段，则所述待测样本含有或候选含有莴苣花叶病毒或所述待测样本为或候选为莴苣花叶病毒；若所述扩增产物含有428bp的dna片段，不含有272bp的dna片段，则所述待测样本不含或候选不含莴苣花叶病毒或所述待测样本不为或候选不为莴苣花叶病毒；若所述扩增产物不含428bp和272bp的dna片段或含有272bp的dna片段不含有428bp的dna片段，则扩增反应无效，需重新检测。
上述方法中，所述重组酶聚合酶扩增的温度为可40℃。所述重组酶聚合酶扩增的时间可为40分钟。
上述方法中，所述重组酶聚合酶扩增的反应体系中，所述p1的两条单链dna的浓度均为0.4μmol/l，所述a1的浓度为0.4ng/μl。
本发明还提供了所述成套试剂或所述引物对的下述任一应用：
x1)在检测或辅助检测莴苣花叶病毒中的应用；
x2)在制备检测或辅助检测莴苣花叶病毒中的应用。
本发明还提供了所述系统在检测或辅助检测莴苣花叶病毒中的应用。
实验证明，利用本发明的检测莴苣花叶病毒的成套试剂，建立了检测莴苣花叶病毒的rt-rpa方法，该方法可对莴苣花叶病毒进行定性检测。本发明的成套试剂和方法可在确保目标序列高效扩增的同时有效规避筛查假阴性的发生。本发明的成套试剂和方法省去了lamp等其它恒温扩增方法需要的多对引物的复杂设计过程；扩增只需要40℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；反应时间仅需40min，筛查时间短；rt-rpa扩增产物具有特定大小的条带，其结果易于判断。本发明的成套试剂特异性好、灵敏度高且适用范围广。本发明的检测莴苣花叶病毒的rt-rpa方法，灵敏、准确、简便和快速，对进出境相关植物及产品检验检疫具有指导意义。
附图说明
图1为检测莴苣花叶病毒的成套试剂的特异性检测结果。
图2为检测莴苣花叶病毒的成套试剂的灵敏度检测结果。
图1和图2中，箭头所示为272和428bp的dna片段。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna的3′末端核苷酸。
下述实施例中的内标质粒是将载体pmd18-t(宝生物工程(大连)有限公司，货号d103a)用ecorv进行酶切，产生ta克隆位点，得到载体片段，连接载体片段与序列3所示的dna片段所得到的重组质粒。
实施例1、检测莴苣花叶病毒的成套试剂的制备
本实施例提供一种检测莴苣花叶病毒的成套试剂，该成套试剂由名称为p1的引物对和名称为a1的单链dna组成；
p1由序列表中序列1(上游引物序列)和序列2(下游引物序列)所示的两条单链dna组成，rt-rpa扩增时可以苣花叶病毒rna为模板扩增出序列大小为272bp的dna片段；
a1的序列为序列表中序列3，rt-rpa扩增时可以从内标质粒上扩增出序列大小为428bp的dna片段，该dna片段的序列为序列表中序列3。
该成套试剂中的三条单链dna均独立包装，各单链dna间的摩尔数均相等。
实施例2、检测莴苣花叶病毒的方法的建立
检测莴苣花叶病毒的方法步骤如下：
1、rna的提取
采用天根生物科技有限公司的货号为dp432的植物总rna提取试剂盒，根据其说明书提取待测样品的总rna；将获得的rna保存于-20℃备用。
2、rt-rpa扩增
以获得的rna为模板，采用实施例1的成套试剂进行rt-rpa扩增，得到rpa扩增产物，同时设置阴性对照(模板为健康莴苣病毒rna)和空白对照(模板为超纯水)。
rt-rpa扩增体系(50μl)的配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2mltwistamp反应管中加入再水化缓冲液(rehydrationbuffer)29.5μl、上游引物和下游引物各1μl(引物浓度均为20μmol/l)，模板rna2μl，内标质粒20ng，最后再加入醋酸镁溶液2.5μl(280mmol/l)，用去离子水补足至50μl。其中，含冻干酶粉(uvsx、gp32及bsu酶混合物)的0.2mltwistamp反应管、再水化缓冲液(rehydrationbuffer)和醋酸镁溶液(280mmol/l)均来源于rpa扩增试剂盒twistampbasicrtkits(tabasrt01kit)。
rt-rpa扩增反应条件：将上述rt-rpa扩增体系充分混匀，置于40℃的金属浴上反应40min，得到rt-rpa扩增产物。
3、rt-rpa扩增产物的电泳检测
rt-rpa反应结束后，向上述rt-rpa扩增产物中加入50μl苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀后12000rpm离心2min，取5μl上清液于1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果，并对rt-rpa扩增产物进行测序。
根据rt-rpa扩增产物确定莴苣花叶病毒的检测结果的方法如下：
若rt-rpa扩增产物含有272bp和428bp的dna片段，则待测植物样品感染莴苣花叶病毒或待测病毒为莴苣花叶病毒；若rt-rpa扩增产物含有428bp的dna片段，不含有272bp的dna片段，则待测植物样品未感染莴苣花叶病毒或待测病毒不为莴苣花叶病毒；若rt-rpa扩增产物不含428bp和272bp的dna片段或含有272bp的dna片段不含有428bp的dna片段，则扩增反应无效，需重新检测。
按照上述方法提取莴苣花叶病毒的基因组dna然后进行rt-rpa反应并对得到的rt-rpa扩增产物进行检测和测序，并同时设置阴性对照(模板为健康莴苣rna)和空白对照(模板为水)。结果显示莴苣花叶病毒的rt-rpa扩增产物含有1条大小为428bp的条带和1条大小为272bp的条带且序列正确，而阴性对照和空白对照均仅有428bp的条带无272bp的条带，说明本发明的检测莴苣花叶病毒的成套试剂可以有效检测莴苣花叶病毒。
实施例3、检测莴苣花叶病毒的成套试剂的特异性
供试病毒材料如下：南芥菜花叶病毒；黄瓜花叶病毒；烟草环斑病毒；番茄环斑病毒；马铃薯a病毒；马铃薯y病毒；小西葫芦花叶病毒；莴苣花叶病毒；共8种rna病毒，8种病毒如表1所示。上述供试材料均保存于中国检验检疫科学研究院，并设阴性对照(模板为健康莴苣rna)和空白对照(模板为水)。
表1、供试病毒
上述实施例3中的8种供试病毒分别记载在如下文献中：
南芥菜花叶病毒：南芥菜花叶病毒单克隆抗体的研制及检测应用.植物检疫，2011，25(6)：18-20.
黄瓜花叶病毒：黄瓜花叶病毒紫松果菊分离物外壳蛋白特性分析.江西农业大学学报，2007，29(1)：34-37.
烟草环斑病毒：双重胶体金层析法快速检测番茄环斑病毒和烟草环斑病毒rt-pcr扩增子.中国农学通报，2011，27(22)：197-201.
番茄环斑病毒、马铃薯a病毒、马铃薯y病毒：马番茄黑环病毒rt_lamp检测方法的建立.河南农业科学，2015，44(4):88-92.
小西葫芦花叶病毒：一步法rt-pcr检测小西葫芦黄花叶病毒.植物检疫，2005(03)：141-142.
莴苣花叶病毒：莴苣花叶病毒胶体金免疫层析试纸条的研制.黑龙江农业科学，2014(11)：74-77.
按照实施例2的方法检测各病毒，结果如图1所示，共有11条泳道：其中1为markerdl2000，单位为bp；2为莴苣花叶病毒(lmv)；3为南芥菜花叶病毒(armv)；4为黄瓜花叶病毒(cmv)；5为烟草环斑病毒(trsv)；6为番茄环斑病毒(torsv)；7为马铃薯a病毒(pva)；8为马铃薯y病毒(pvy)；9为小西葫芦花叶病毒(zymv)；10为空白对照(h2o)；11为阴性对照。泳道2-11在428bp处均有扩增条带，测序结果显示序列正确，与实施例2的序列一致，泳道2显示在272bp处有扩增条带，测序结果显示序列正确，与实施例2的序列一致，根据实施例2的判断方法，该样品的检测结果为阳性，即顺利检测到莴苣花叶病毒，其余泳道3-泳道11均无272bp的扩增条带，表明其余样品均无莴苣花叶病毒，且排除了假阴性可能性，进一步提高了结果的可靠性。综上，上述阳性和阴性结果均与实际情况一致，结果准确，由此证明本发明实施例1的成套试剂具有有效性、高特异性。
实施例4、检测莴苣花叶病毒的成套试剂的灵敏度
供试材料：将实施例3得到的莴苣花叶病毒的总rna(浓度为595ng/μl)进行梯度稀释，分别得到浓度为595×10-1ng/μl、595×10-2ng/μl、595×10-3ng/μl、595×10-4ng/μl、595×10-5ng/μl和595×10-6ng/μl的稀释液。
以实施例3得到的莴苣花叶病毒的rna以及各稀释液为模板，利用实施例2的方法进行rt-rpa扩增，电泳结果如图2所示。图2中，泳道1为markerdl2000，单位为bp，泳道2-8分别为莴苣花叶病毒浓度分别为595ng/μl、595×10-1ng/μl、595×10-2ng/μl、595×10-3ng/μl、595×10-4ng/μl、595×10-5ng/μl和595×10-6ng/μl的稀释液的结果，9为水对照(h2o)；10为阴性对照。
从图2可以看出，泳道2-10均含有大小为428bp的条带，说明泳道2-10的结果均有效且无假阴性的可能；泳道2-4中均含有大小为272bp的条带，泳道5-10均无大小为272bp的条带，表明本发明的检测莴苣花叶病毒的成套试剂的灵敏度为595×10-2ng/μl总rna；说明本发明的检测莴苣花叶病毒的成套试剂具有较高的灵敏度，可检测出样品中的微量rna。
对比例1、其它引物对莴苣花叶病毒的检测
用oligo6.0软件设计并选取其中排分靠前的5个引物对，即引物对1-5。利用引物对1-5分别替换实施例1中成套试剂的引物对p1，按照实施例2-4的方法分别确定这5对引物的特异性和灵敏度，结果如表2所示。引物序列如下：
引物对1：1f:5′-ggctatgacatacacgcttcacaagtta-3′
1r:5′-gatgaaaattccgtctttcttgatgccg-3′
引物对2：2f:5′-tacatggaagctatacgcagtcttgtca-3′
2r:5′-cagcaaatgatcaaggtttaaagccac-3′
引物对3：3f:5′-cacagccgcagatgtaaatcagaata-3′
3r:5′-taaaacctcacagcggaaactagaaa-3′
引物对4(即实施例1的引物对p1)：
4f:5′-catcaacgcagggctacatggtaaacaca-3′
4r:5′-tcccgttttctatacaccaaaccatcaatc-3′
引物对5：5f:5′-gacatcaacgcagggctacatggtaaacaca-3′
5r:5′-tatcatccacatcgtagtcattcttaaccccg-3′
表2、不同引物对检测莴苣花叶病毒的结果
结果显示：引物对1在lmv样品中除可扩增到目的条带外，还会扩增到其它非特异性条带，特异性不好；引物对2和5在lmv样品和所有7种对照样品中均无扩增条带出现；引物对3可在lmv样品中扩增到单一的目的条带，但会在对照样品pvy中扩增出条带，特异性不好；引物对4可在lmv样品中扩增到单一的目的条带，并且在所有7种对照样品中均无条带出现，特异性良好。结果表明，本发明的检测莴苣花叶病毒的成套试剂特异性强、灵敏度高且重复性好，而采用引物设计软件随机选取的若干对rt-rpa引物对则或多或少的存在特异性不强、灵敏度不高等各种缺陷。
<110>中国检验检疫科学研究院
<120>检测莴苣花叶病毒的成套试剂
<160>3
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>29
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
catcaacgcagggctacatggtaaacaca29
<210>2
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
tcccgttttctatacaccaaaccatcaatc30
<210>3
<211>428
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
catcaacgcagggctacatggtaaacacagacctggggtccccagcacacttagccgtgt60
tccttgcactctctgcatgtccccagtctggcctgactgcccccggcggcttcccgaggg120
tgacagtgtccctccctccctccagatcatgttcgagaccttcaacaccccagccatgta180
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ggactccggagacggggtcacccacacggtgcccatctacgaggggtacgccctgcccca300
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