在音乐环境下培养获得的微生物发酵物及其制备方法和用途与流程

本发明提供一种在音乐环境下培养获得的微生物发酵物，及其制备方法，和在用于制备促进脂肪细胞代谢的药物方面或制备保护肝脏的药物方面的用途。

背景技术：

长期以来，肥胖被定义为与大多数的健康问题以及与减少寿命有关的疾病病症。在人们努力追求身体健康的现代，市面上逐渐出现各式各样的营养、瘦身的补充品以符合人们的需求；然而，这些营养、瘦身补充品大多由化学合成、或以自然食物中不存在的单一分子结构结合而成，原料来源都是石油提炼物、煤炭沥青衍生物、化学过程处理后的糖或处理过后的工业化制品，但这些化学提炼而成的营养素是很难被细胞所认知、接受并利用，因此多于营养素就会主动随尿液或汗液排出体外。由于该些营养补充品的低吸收率、低体内停留时间、低生物利用率，化学合成营养素未达到宣称功效，含量可能会是每日建议摄取的几百倍甚至千倍以上，高剂量将有可能为人体带来产生毒性反应的风险；虽然身体会主动排出多余的营养素，但也表示未被吸收的化学营养素是需要肝肾代谢，会增加人体额外负担的；而长期食用化学合成营养素可能会累积毒性并产生副作用，甚至有致癌的风险。

因此，如何通过从天然食材制造出的营养成分，不需要在生活方式有太大的改变且不会引起毒素或对健康有不良的影响，同时又能达到保健身体健康及减少肥胖的双重功效，是人们长期努力追求的目标。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明一方面提供了一种微生物发酵物，所述微生物发酵物为蔬菜汁和莓果汁的混合液，在播放音乐的环境下，与嗜热链球菌、酵母菌和醋酸菌混合后发酵获得。

优选的，所述音乐环境为播放古典乐曲的环境，且所述古典乐曲中音频低于10,000hz的部分占整首曲目的99％以上，所述古典乐曲持续时间为1分钟到3分钟；或者，为播放流行乐曲的环境，且所述流行乐曲中音频低于10,000hz的部分占整首曲目的95％以上，所述流行乐曲持续时间持续时间为1分钟到3分钟；或者，为播放摇滚乐曲的环境，且所述摇滚乐曲中音频高于10,000hz占整首曲目的50％以上，所述摇滚乐曲持续时间为1分钟到3分钟。

本发明另一方面提供了上述微生物发酵物的制备方法，

所述制备方法包括如下步骤：

步骤1，制备空培液：首先将鲜榨的蔬菜汁与鲜榨的莓果汁以1:1～2:1的体积比混合，再用蒸馏水稀释3～6倍(体积)后，进行灭菌处理，获得所述空培液；

步骤2，接种菌种：将嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、酿酒酵母菌(saccharomycescerevisiae)和醋酸菌(acetobacteraceti)接种到所述空配液，三种菌种的重量比为1:1:1；所述嗜热链球菌、酵母菌和醋酸菌的总体积与所述蔬菜汁和莓果汁的混合液的体积的比例为2：100～7:100；

步骤3，发酵：在播放音乐的环境下，温度条件为25℃～35℃下，恒温发酵150～260小时以获得本发明的微生物发酵物。

优选的，所述鲜榨的蔬菜汁为绿花椰菜、芹菜和芦笋的等体积比例混合液；所述鲜榨的莓果汁为蓝莓、蔓越莓、红葡萄、白葡萄、杨梅、桑葚、苹果、胡萝卜、甘蔗、百香果、菠萝和柠檬的等体积比例混合液。

本发明还一方面提供了上述微生物发酵物或者上述制备方法制备获得的微生物发酵物用于制备促进脂肪细胞代谢的药物方面的用途。

优选的，所述促进脂肪细胞代谢为促进脂肪分解或促进棕色脂肪细胞分解。

优选的，所述促进脂肪分解包含增加脂肪甘油三酯脂肪酶(adiposetriglyceridelipase，atgl)以及激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitivelipase，lipe)的基因表达量。

优选的，所述加速棕色脂肪细胞分解包含增加脂肪解偶联蛋白1(uncouplingprotein1，ucp1)以及脂肪解偶联蛋白2(ucp2)的基因表达量。

本发明还一方面提供了上述微生物发酵物或者上述制备方法制备获得的微生物发酵物用于制备保护肝脏的药物方面的用途。

优选的，所述保护肝脏为提高肝细胞抗氧化能力或dna修复能力。

优选的，所述提高dna修复能力系是指提高dna结构损伤的修复能力或者提高dna双股断裂的修复能力。

优选的，所述提高肝细胞抗氧化能力包含增加超氧化物歧化酶1(superoxidedismutase1，sod1)以及超氧化物歧化酶2(sod2)的基因表达量，且提高该dna结构损伤的修复能力包含增加切除修复互补交叉基因1(excisionrepaircross-complementinggene1，ercc1)以及dna损伤认知及修复因子(dnadamagerecognitionandrepairfactor，xpa)的基因表达量，且提高该dna双股断裂的修复能力包含增加x线修复交叉互补基因1(x-rayrepaircrosscomplementing1，xrcc1)以及x线修复交叉互补基因2(xrcc2)的基因表达量。

本发明再一方面提供了一种药物组合物，该药物组合物包含上述的微生物发酵物或者如上述制备方法制备获得的所述微生物发酵物。

附图说明

图1为本发明实施例1的微生物发酵物的类超氧化物歧化酶sod-like的含量；

图2为本发明实施例1的微生物发酵物对胃上皮细胞的超氧化物歧化酶2(sod2)基因相对表达量的数据图；

图3为本发明实施例1的微生物发酵物对氧化损伤肝细胞的超氧化物歧化酶1(sod1)及超氧化物歧化酶2(sod2)基因相对表达量的数据图；

图4为本发明实施例1的微生物发酵物对氧化损伤肝细胞的切除修复互补交叉基因1(ercc1)以及dna损伤认知及修复因子(xpa)基因相对表达量的数据图；

图5为本发明实施例1的微生物发酵物对氧化损伤肝细胞的x线修复交叉互补基因1(xrcc1)以及x线修复交叉互补基因2(xrcc2)基因相对表达量的数据图；

图6为本发明实施例1的微生物发酵物对脂肪代谢的油红o染色(oil-redostain)分析的数据图；

图7为本发明实施例1的微生物发酵物对脂肪甘油三酯脂肪酶(atgl)与激素敏感性脂肪酶(lipe)基因相对表达量的数据图；

图8为本发明实施例1的微生物发酵物对脂肪解偶联蛋白1(ucp1)以及脂肪解偶联蛋白2(ucp2)基因相对表达量的数据图。

具体实施方式

以下将结合附图所示的具体实施方式对本发明进行详细描述。但这些实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。

现在将参考附图更全面地描述示例实施方式。然而，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的实施方式；相反，提供这些实施方式使得本发明将全面和完整，并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。

本发明利用液体作为声音传播的介质，以微生物在发酵时可听见的声音速度(约为1463m/s)，使细胞间反应加速。经声波刺激后，微生物活动力明显提高，使得代谢、合成、氧化及还原能力都得到的加速的效果，这是因为声波者种交变应力场作用后，使微生物的结构发生些微的改变，细胞内的营养物质的流动性及通透性的增强(ca²⁺、mg²⁺等等)，从而导致膜内外离子浓度的变化，使细胞内源生长素及其有关影响生长的物质发生定向迁移，从而改变细胞吸收和运转物质的能力。因此，本发明借由蔬菜汁及莓果汁的混合液发酵过程中播放音乐，可使发酵物接收乐曲中不同的频率及波长的能量，产生微生物发酵物。同时，本发明在发酵结束后测量该微生物发酵物的类超氧化物歧化酶(superoxidedismutase-like，sod-like)含量、胃细胞抗氧化力、肝细胞抗氧化力、肝细胞dna修复能力以及促进脂肪细胞代谢能力。

定义

本申请所述蔬菜包含叶菜类、豆芽类、瓜果类、茄果类、薯芋类、根菜类、花菜类等蔬菜，但不限于此；也包含核果类、仁果类、瓜类等水果，但不限于此。

本文所述莓果包含蓝莓、蔓越莓、红葡萄、白葡萄、杨梅、桑葚、苹果、胡萝卜、甘蔗、百香果、菠萝以及柠檬等，但不限于此。

使用excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(sd)表示，个此之间的差异以学生t检验(student'st-test)分析。

如于本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。

实施例1本发明的在音乐环境下培养的微生物发酵物的方法

在本发明的一个较佳实施例中，将蔬菜汁(鲜榨汁)及莓果汁(鲜榨汁)以3比2的比例混合后，再用蒸馏水5倍稀释，作为空培液；其中莓果汁包含：蓝莓、蔓越莓、红葡萄、白葡萄、杨梅、桑葚、苹果、胡萝卜、甘蔗、百香果、菠萝以及柠檬，它们的等比例混合液；蔬菜汁包含：绿花椰菜、芹菜以及芦笋，它们的等比例混合液。将该空培液以巴斯德灭菌法处理，再接入嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、酿酒酵母菌(saccharomycescerevisiae)以及醋酸菌(acetobacteraceti)至空培液中，进行前发酵，条件为30℃±1℃恒温发酵192小时以获得本发明的微生物发酵物，其中该些菌株的总体积为空培液体积的2至7％；发酵过程中分为三个群组，分别拨放三种不同类型的音乐，分为古典乐(莫扎特：第四十号交响曲-第一乐章)、流行乐(maroon5：sugar)及摇滚乐(maroon5：maps)，其中古典乐为曲目1至3分钟内低于10,000hz占整首曲目的99％以上、流行乐为曲目1至3分钟内低于10,000hz占整首曲目的95％以上、摇滚乐为曲目1至3分钟内高于10,000hz占整首曲目的50％以上。

实施例2本发明的微生物发酵物的类超氧化物歧化酶(sod-like)含量检测

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod)为一种催化超氧自由基歧化作用成为氧及过氧化氢的酵素，该些酵素在暴露于氧气的细胞中具有重要的抗氧化的防御作用。因此，本发明利用sod活性试剂组(sodactivitykit，enzolifescience公司，型号cat#adi-900-157)进行细胞氧化压力分析。

结果如图1所示，相较于控制组(只有未听音乐的酵素)，无论在哪一种音乐环境下(古典乐、流行乐以及摇滚乐)培养的微生物发酵物皆可有效提高类超氧化物歧化酶(sod-like)含量1倍以上，可推知其在抗氧化能力上会比未在音乐环境下培养的微生物发酵物更提升。该结果显示本发明的微生物发酵物含有较高的超氧化物歧化酶的活性，其可有较加强对氧化压力的防御。

实施例3本发明的微生物发酵物的胃细胞抗氧化能力

本发明以细胞平台进行抗氧化能力的测试，利用定量实时聚合酶连锁反应(quantitativerealtimepcr，qpcr)检测以本发明的微生物发酵物处理的ags人类胃上皮细胞(gastricepithelialcells)的超氧化物歧化酶2(sod2)的基因表达量，分析本发明的微生物发酵物的胃细胞抗氧化能力。

本发明使用人类胃上皮细胞购自美国标准生物品收藏中心(americantypeculturecollection，atcc)，编号crl-1739。将该细胞培养于添加10％胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)(gibco公司，编号10438-026，美国)与1％青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)(gibco公司，编号15140-122，美国)的rpmi1640基础培养基(roswellparkmemorialinstitute)(gibco公司，美国)中。

在6孔培养盘(genedirex公司，中国台湾)中每个孔洞接种1.5×10⁵个人类胃上皮细胞细胞，以上述培养基于37℃含有5％co2培养箱培养24小时；在没有干扰到该附着于培养盘上的细胞的情况下移除该培养基，之后更换新的培养基分别加入2％浓度的三种不同音乐环境下的本发明的微生物发酵物处理6小时，并以只含有培养基的细胞作为控制组，上述相同实验条件皆以每组重复三次进行。之后收集人类胃上皮细胞。使用rna萃取试剂组(geneaid公司，中国台湾)萃取上述细胞的rna，再利用反转录酶(iiireversetranscriptase)(invitrogen公司，美国)将rna反转录为cdna，接着使用kapafastqpcr试剂组(kapabiosystems公司，美国)以实时聚合酶链锁反应仪(abisteponeplus^tmsystem(appliedbiosystems公司，美国)进行定量实时聚合酶连锁反应(qpcr)，侦测目标基因(sod2)以及参考基因的表达水平，以参考基因(referencegene)的表达水平对目标基因的表达水平进行标准化。

结果如图2所示，相较于只含有培养基的细胞作为控制组，无论在哪一种音乐环境下(古典乐、流行乐以及摇滚乐)培养微生物发酵物处理的胃上皮细胞，其抗氧化相关sod2基因表达量可有效提高20％以上。

实施例4本发明的微生物发酵物的肝细胞抗氧化能力

本发明以过氧化氢(hydrogenperoxide，h2o2)诱导肝细胞氧化损伤，由于已知超氧化物歧化酶(sod)可催化超氧化物、降低自由基含量，其为人体内重要的抗氧化剂；本发明利用定量实时聚合酶连锁反应(qpcr)检测以本发明的微生物发酵物处理的氧化损伤肝细胞的超氧化物歧化酶1(sod1)及超氧化物歧化酶2(sod2)的基因表达量，分析本发明的微生物发酵物的肝细胞抗氧化能力。

本发明使用hepg2肝细胞(liverhepatocellularcells)购自美国标准生物品收藏中心，编号hb-8065。肝细胞培养条件如实施例1所述的方法，并以4mlh2o2诱导细胞氧化损伤，再分别加入2％浓度的三种不同音乐环境下的本发明的微生物发酵物处理6小时后，以定量实时聚合酶连锁反应(qpcr)检测以本发明的微生物发酵物处理的氧化损伤肝细胞的sod1与sod2基因表达量，检测方式如实施例3所述，上述相同实验条件皆以每组重复三次进行。

结果如图3所示，相较于只含有培养基的细胞作为控制组以及仅以h2o2诱导氧化损伤的细胞，在古典乐及流行乐音乐环境下培养微生物发酵物处理的肝细胞的sod1与sod2基因表达量皆明显增加；同时，以h2o2诱导氧化损伤并以实施例1的空培液处理的细胞作为对照组，亦能提升氧化损伤肝细胞的sod1与sod2基因表达量，但以古典乐环境下培养微生物发酵物处理的肝细胞的sod1与sod2基因表达量最佳。显示本发明的微生物发酵物能提升肝细胞氧化能力，对于保护肝细胞亦具有相当好的效果。

实施例5本发明的微生物发酵物的肝细胞dna修复能力

由于已知氧化损伤的细胞会产生自由基，而自由基会导致dna受损及基因突变。本发明以过氧化氢诱导hepg2肝细胞氧化损伤，再分别加入2％浓度的三种不同音乐环境下的本发明的微生物发酵物处理6小时后，以定量实时聚合酶连锁反应(qpcr)检测以本发明的微生物发酵物处理的氧化损伤肝细胞的dna结构损伤以及双股dna断裂的修复基因的表达量；其中dna结构损伤修复基因包含切除修复互补交叉基因1(excisionrepaircross-complementinggene1，ercc1)以及dna损伤认知及修复因子(dnadamagerecognitionandrepairfactor，xpa)；双股dna断裂的修复基因包含x线修复交叉互补基因1(x-rayrepaircrosscomplementing1，xrcc1)以及x线修复交叉互补基因2(xrcc2)，检测方式如实施例3所述，上述相同实验条件皆以每组重复三次进行。

结果如图4及图5所示，相较于只含有培养基的细胞作为控制组以及仅以h2o2诱导氧化损伤的细胞，无论在何种音乐环境下(古典乐、流行乐以及摇滚乐)培养微生物发酵物处理的氧化损伤肝细胞的ercc1、xpa、xrcc1以及xrcc2基因表达量皆明显增加；同时，以h2o2诱导氧化损伤并以未听音乐酵素产品对照组处理的细胞，能提升氧化损伤肝细胞的ercc1与xpa基因表达量(如图4)；以h2o2诱导氧化损伤并以实施例1的空培液处理的细胞，亦能提升氧化损伤肝细胞的xrcc1与xrcc2基因表达量(如图5)，但以古典乐环境下培养微生物发酵物处理的肝细胞的ercc1、xpa、xrcc1以及xrcc2基因平均表达量最佳。显示本发明的微生物发酵物能提升肝细胞dna结构损伤的修复能力(ercc1及xpa)以及在双股dna的基因表达上(xrcc1及xrcc5)亦具有修复的能力，对于保护肝细胞亦具有相当好的效果。

实施例6本发明的微生物发酵物的促进脂肪细胞代谢能力

本发明以地塞米松(dexamethasone，dexa)以及异丁基甲基黄嘌呤(isobutylmethylxanthine，ibmx)诱导老鼠3t3-l1前脂肪细胞(3t3-l1preadipocytes)分化为成熟的脂肪细胞，之后再分别加入三种不同音乐环境下的本发明的微生物发酵物处理后，以油红o染色(oil-redostain)确认本发明的微生物发酵物的促进脂肪细胞分解效果，以及qpcr检测以本发明的微生物发酵物处理的脂肪代谢基因的表达量。

6.13t3-l1细胞实验分析方法

首先，将3t3-l1前脂肪细胞置于6孔细胞培养盘每个孔洞接种1.5×10⁵个细胞，待细胞培养至致密视为第零天，此时更换添加有10％胎牛血清、10μg/ml胰岛素、1μmdexa、与0.5mmibmx的杜氏改良eagle培养基(dulbecco'smodifiedeaglemedium，dmem)，培养48小时；第三天更换培养基，培养48小时；第五天更换培养基添加有10％胎牛血清与10μg/ml胰岛素的dmem培养基，每二天更换一次培养基，持续分化至第6天，当细胞开始分化成脂肪细胞后分别加入1％或2％浓度的三种不同音乐环境下的本发明的微生物发酵物至各样本中，持续观察8天；进行油红染色，油红染剂为对中性脂肪细胞具有专一性的染剂；将培养基吸去，以pbs洗涤二次并以10％甲醛固定细胞30分钟；以pbs洗涤细胞二次再以油红o染剂，溶于异丙醇染一个小时，最后以pbs退染，即可在显微镜下观察；再用100％异丙醇将染色的油脂溶解，并于波长510nm下量测吸光值(od)。

本发明使用油红o染色(oil-redostain)确认本发明的微生物发酵物的促进脂肪细胞分解效果。结果如图6所示，在脂肪代谢实验中，相较于只含有培养基的脂肪细胞作为控制组、以实施例1的2％空培液处理的脂肪细胞以及以1％或2％味丹酵素处理的脂肪细胞，无论在1％或2％的音乐环境下(古典乐、流行乐以及摇滚乐)培养微生物发酵物处理的脂肪细胞皆具有显著促进脂肪分解的能力，且微生物发酵物的浓度越高效果越好。

6.2脂肪细胞的基因表达量分析

将3t3l1将3t3-l1前脂肪细胞置于6孔细胞培养盘每个孔洞接种2×10⁵个细胞，待细胞培养至致密视为第零天，此时更换添加有10％胎牛血清、10μg/ml胰岛素、1μm地塞米松(dexa)、与0.5mm异丁基甲基黄嘌呤(ibmx)的杜氏改良eagle培养基(dmem)，培养48小时；第三天更换培养基，培养48小时；第五天更换培养基添加有10％胎牛血清与10μg/ml胰岛素的dmem培养基，每二天更换一次培养基，持续分化至第6天，当细胞开始分化成脂肪细胞后分别加入三种不同音乐环境下的本发明的微生物发酵物至各样本中，进行处理24小时；收集细胞。使用rna萃取试剂组(geneaid公司，中国台湾)萃取上述细胞的rna，再利用反转录酶(iiireversetranscriptase)(invitrogen公司，美国)将rna反转录为cdna，接着使用fastqpcr试剂组(kapabiosystems公司，美国)以实时聚合酶链锁反应仪(abisteponeplus^tmsystem，appliedbiosystems公司，美国)进行定量实时聚合酶连锁反应(qpcr)，侦测本发明的微生物发酵物处理的脂肪代谢基因的表达量；其中脂肪代谢基因包含促进脂肪分解的脂肪甘油三酯脂肪酶(adiposetriglyceridelipase，atgl)与激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitivelipase，lipe)基因；以及加速棕色脂肪细胞分解包含提升脂肪解偶联蛋白1(uncouplingprotein1，ucp1)以及脂肪解偶联蛋白2(ucp2)基因，检测方式如实施例3所述，上述相同实验条件皆以重复三次进行。

结果如图7及8所示，相较于只含有培养基的脂肪细胞作为控制组以及以实施例1的2％空培液处理的脂肪细胞，无论在何种音乐环境下(古典乐、流行乐以及摇滚乐)培养微生物发酵物处理的脂肪细胞的atgl以及lipe基因的表达量皆明显增加，表示本发明的微生物发酵物确实具有提升脂肪分解的能力；而流行乐培养微生物发酵物处理的脂肪细胞的ucp1以及ucp2基因的表达量最佳，表示本发明的微生物发酵物确实对于棕色脂肪具有促进分解的效果。

综上所述，本发明藉由蔬菜汁及莓果汁的混合液发酵过程中拨放不同类型的音乐，可使发酵物接收乐曲中不同的频率及波长的能量，产生的微生物发酵物。在发酵过程中，无论给予何种音乐(古典乐、流行乐或摇滚乐)，本发明的微生物发酵物皆可有效提高类超氧化物歧化酶(sod-like)成分含量1倍以上，可推知其在抗氧化能力上会比未在音乐环境下培养的微生物发酵物更提升。本发明进一步利用细胞平台进行抗氧化能力的测试，以2％浓度的三种不同音乐环境下的本发明的微生物发酵物处理胃上皮细胞细胞，再以定量实时聚合酶连锁反应(qpcr)方法检测sod2基因表达量，其结果显示本发明的微生物发酵物具有提升抗氧化sod2基因表达量的效果。

此外，本发明的微生物发酵物对于保护肝脏亦具有极佳的效果，以古典乐环境下培养微生物发酵物处理的肝细胞的sod1与sod2基因表达量增加，并进一步深究该微生物发酵物亦可提升dna修复能力，提升dna结构损伤修复基因(ercc1与xpa)以及在双股dna断裂的修复基因(xrcc1与xrcc5)的表达量。

再者，在促进脂肪细胞代谢能力的实验中,以1％和2％浓度本发明的微生物发酵物处理的脂肪细胞具有促进脂肪分解的能力，且以流行乐环境下培养微生物发酵物处理的脂肪细胞的脂肪代谢基因(atgl与lipe)以及加速棕色脂肪细胞分解基因(ucp1与ucp2)的表达量增加，表示本发明的微生物发酵物对于棕色脂肪具有促进分解的效果。

应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。