本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测沙眼衣原体的试剂盒及其应用。
背景技术：
沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis，ct)是一类严格活细胞内寄生的原核细胞型微生物，主要感染泌尿生殖道上皮细胞，是近年来国内外最为常见的性传播疾病病原体之一。
临床上检测沙眼衣原体感染包括细胞培养法、直接免疫荧光法、聚合酶链反应法、酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法等。近年来，金纳米标记的核酸探针技术发展迅速，该方法具有简单、快速、成本低廉、高通量等特点，如纳米金颗粒环介导等温扩增联用法。但以上方法有检测周期长、操作繁琐、通量小、设备昂贵等缺点。例如实时荧光定量pcr法，需要在特殊的薄壁pcr管中进行反应，同时对pcr管盖也有特殊要求，由于荧光定量pcr灵敏度较高，细微干扰就能产生较大的假阳性结果，其加样操作对于工作人员有较高的要求；同时实时荧光定量pcr法利用pcr过程中的荧光基团累积信号进行检测，整个扩增过程需在专门的荧光定量pcr仪中进行。该仪器及相关配套耗材设备昂贵，限制了其进一步推广。
而另一种常用方法-纳米金颗粒环介导等温扩增联用法，为了能够直观看到金纳米因聚集而发生的从酒红到蓝紫色的颜色变化，常采用透明的ep管作为整个体系的反应平台。而且纳米金颗粒环介导等温扩增联用法利用纳米金不同粒径在510～540nm处不同吸收峰来实现对金纳米颗粒的检测，所用仪器常为紫外可见分光光度计，在进行检测之前需将不同的反应液转移至比色皿中。检测样本越多，转移次数越多，操作越繁琐。并且比色皿规格也会对反应体系的体积进行限制。
目前临床上各种沙眼衣原体的检测方法仍然存在不同程度的缺陷，摸索并建立一种简便、快速、敏感、特异和高通量的沙眼衣原体检测技术，对于沙眼衣原体诊断和预防具有重要的意义。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种可肉眼识别、简便、快速、敏感、特异和高通量的沙眼衣原体检测试剂盒，用于对沙眼衣原体的临床诊断。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种检测沙眼衣原体的试剂盒，包括第一修饰物修饰的捕获探针、金纳米标记的巯基信号探针、包被第二修饰物的载体、银染引发液和银增强液；所述第一修饰物修饰的捕获探针为在seqidno:1所示序列的5’或3’端偶联有第一修饰物的探针，所述金纳米标记的巯基信号探针为在seqidno:2所示序列的5’或3’端偶联有巯基基团的被金纳米标记的探针，所述第一修饰物和第二修饰物能够特异性结合，所述银染引发液由氢醌，明胶、柠檬酸和柠檬酸三钠溶于水而成，所述银增强液为银离子水溶液。
针对现有检测沙眼衣原体的方法繁琐和需要借助各种仪器观测结果的缺陷，本发明选择沙眼衣原体中特定保守序列作为模板设计金纳米标记的巯基信号探针，带有特异性寡核苷酸链的金纳米会与沙眼衣原体靶序列结合，同时另一段带有第一修饰物的寡核苷酸链(捕获探针)会将靶序列连同信号探针一起锚定于包被第二修饰物的载体上，最终形成一种核酸三明治复合物。
正常条件下金纳米颗粒在溶液中显现酒红色，当溶液中出现靶序列时，带有标记寡核苷酸的金纳米颗粒会连接在靶序列表面，金纳米颗粒会相互拉近距离从而使得溶液颜色变为蓝紫色。核酸之间的杂交反应改变了金纳米颗粒之间的距离。这种由红到紫的变化能够确定是否存在靶序列，从而实现检测。但是，本发明形成的这种三明治复合物中，金纳米作为信号标记物其自身所带颜色不做为显色信号，在银染液中还原银离子形成银壳，信号进一步放大，使得微孔板底部显色变深。微孔板底部颜色深浅与沙眼衣原体含量相关，可直接通过肉眼观测检测结果，并且所用仪器常见，整体简便高效(本发明所述试剂盒工作原理示意图见图1)。
作为优选，所述第一修饰物为生物素，第二修饰物为亲和素；或第一修饰物为亲和素，第二修饰物为生物素。其中，生物素进一步选择为链霉亲和素。除此之外，本发明也可以使用本领域其他可以特异性结合的成对物质，来实现将本发明三明治复合物锚定在载体上的目的。
作为优选，所述巯基基团为-(ch2)3-sh；所述载体为聚苯乙烯培养板或其它适宜材质的培养板，例如常规使用的6、12、48、96孔板或孔数更多的培养板。
本发明形成银壳显色过程中，所用银染色还原剂主要为氢醌，并由此配需要依据相对应的银染引发液和银增强液，在反应中金纳米颗粒起到催化反应的作用，更多的银离子会被还原，“银壳”不断增大从而使得信号放大。本发明银染色借助纳米金颗粒使其显色信号增强，才会与阴性样本形成明显区别。
在本发明具体实施方式中，所述银染引发液中各组分浓度为0.017g/ml氢醌，0.006g/ml明胶，0.0255g/ml柠檬酸和0.0235g/ml柠檬酸三钠；所述银离子水溶液为硝酸银水溶液，其中硝酸银的浓度为0.1g/ml。在具体使用中，按照银增强液：银染引发液体积比为20μl:1ml混匀后使用。
为了更加方便检测工作的进行，本发明所述试剂盒还包括如下组分中的一种或两种以上：
扩增沙眼衣原体保守序列的上游引物、扩增沙眼衣原体保守序列的下游引物和ssc缓冲液。
其中，扩增沙眼衣原体保守序列的上游引物和扩增沙眼衣原体保守序列的下游引物与金纳米标记的巯基信号探针以及捕获探针采用相同的保守序列为模板进行设计，在本发明具体实施过程中，扩增沙眼衣原体保守序列的上、下游引物序列依次如seqidno:3-4所示；所述ssc缓冲液可用作杂交缓冲液和杂交过程中的洗涤液。
基于本发明提供的试剂盒，本发明还提供了一种检测沙眼衣原体的方法：
提取待测样本中的沙眼衣原体dna，然后采用本发明所述扩增沙眼衣原体保守序列的上、下游引物进行pcr扩增；
pcr扩增产物变性后，加入杂交缓冲液、本发明所述第一修饰物修饰的捕获探针、金纳米标记的巯基信号探针混合进行杂交反应，然后转移至包被第二修饰物的载体中，一定温度反应一段时间后弃反应液，用ssc缓冲液洗涤拍干。
取本发明银增强液加入到银染引发液中混匀，加入上述载体中37℃避光孵育，用超纯水洗涤，拍干后置于酶标仪上，测定630nm处吸光度a值；或者通过肉眼直接分辨，参见图9；
图9中，银染色结果肉眼可直观辨别，衣原体阳性孔内(10nmol/l)显黑色深染，弱阳性孔(100pmol/l-1nmol/l)显灰色浅染，而阴性孔则显透明。
更为具体地步骤如下：
提取待测样本中的沙眼衣原体dna，然后采用本发明所述扩增沙眼衣原体保守序列的上、下游引物进行pcr扩增；总体系为50μl，2×taqmix25μl，10μmol/l上下游引物各1μl，dna模板2μl，ddh2o21μl。pcr条件94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸10min。
取扩增后靶序列95℃变性5min，冰浴3min，分别取变性处理后的靶序列10μl、杂交缓冲液20μl、生物素标记的捕获探针10μl(100nmol/l)、金纳米标记的信号探针10μl，于ep管中混合。45℃反应5min后，将上述50μl杂交混合液转移至包被链霉亲和素的96孔板内，25℃反应一段时间后弃反应液，用2xssc缓冲液洗涤1次后拍干，0.5xssc缓冲液洗涤1次后拍干，0.2xssc缓冲液洗涤一次后拍干。
将1.7g氢醌，0.6g明胶，2.55g柠檬酸，2.35g柠檬酸三钠溶于100ml超纯水中配置成引发液。将0.2g硝酸银溶解于2ml超纯水配置得银增强液。取20μl银增强液加入到1ml引发液中混匀，加入96孔板中37℃避光孵育一段时间后，用超纯水洗涤96孔板，拍干后置于酶标仪上，测定630nm处吸光度a值；或通过肉眼分别样品颜色，黑色深染为阳性，灰色浅染为弱阳性，透明为阴性。
用本实验方法对沙眼衣原体、淋病奈瑟球菌、支原体、梅毒螺旋体进行检测，结果显示，沙眼衣原体与其它生殖道病原菌之间差异显著(p＜0.05)，本发明所述试剂盒在检测时具有较高特异性。
同时，对扩增后的靶序列进行稀释使其终浓度分别为20pmol/l、50pmol/l、100pmol/l、150pmol/l、200pmol/l、500pmol/l、1nmol/l、1.5nmol/l、2nmol/l、4nmol/l、10nmol/l，然后按照本发明所述检测方法进行检测，结果显示，其在100pmol/l至2nmol/l时具有良好线性且具备较高的灵敏度。
在临床样本检测上，用本方法和普通pcr法对50例疑似沙眼衣原体感染患者样本进行检测，pcr法检出率为58％，本方法检出率为62％，经配对χ2检验分析，两种方法检出率无显著性差异(p＞0.05)。
此外，本发明采用聚苯乙烯培养板，反应体积在50～100ul之间，能够有效节省试剂用量。且使用的仪器价格较低，一次最多能够测定96个样(采用96孔板)，并且可通过肉眼直观观察结果，操作更加简便高效。
基于上述优异的试验结果，本发明提出了利用本发明所述试剂盒制备检测沙眼衣原体产品中的应用。
由以上技术方案可知，本发明选择沙眼衣原体中特定保守序列作为模板设计金纳米标记的巯基信号探针和第一修饰物修饰的捕获探针，两者均和目标靶序列特异性结合形成三明治复合物，并通过可与第一修饰物相结合的第二修饰物锚定在载体上，通过金纳米的催化作用，在银染引发液和银增强液的配合下，在金纳米表面形成银壳，实现不同显色信号的差异，可通过肉眼和酶标仪进行高效、特异、高通量和灵敏的检测沙眼衣原体。
附图说明
图1所示为本发明试剂盒工作原理的示意图；其中，streptavidin表示链霉亲和素、probe-biotin表示生物素标记的捕获探针、targetdna为靶序列、probe-aunp表示金纳米信号探针、sliverstaining表示银染色；
图2所示为沙眼衣原体与其它生殖道病原菌的检测结果；其中，纵坐标表示吸光度值，横坐标ct表示沙眼衣原体、ng表示淋病奈瑟球菌、tp表示梅毒螺旋体、mp表示支原体；
图3所示为不同浓度的扩增产物的检测结果；横坐标表示扩增后靶序列浓度对数值，纵坐标表示吸光度值；
图4所示为不同杂交反应时间的检测结果；纵坐标表示吸光度值，横坐标表示反应时间；
图5所示为不同杂交反应温度的检测结果；纵坐标表示吸光度值，横坐标表示反应温度；
图6所示为不同银染时间的检测结果；纵坐标表示吸光度值，横坐标表示银染时间；
图7所示为不同生物素修饰的捕获探针浓度的检测结果；纵坐标表示吸光度值，横坐标表示生物素修饰的捕获探针浓度；
图8所示为不同金纳米标记的巯基信号探针的检测结果；纵坐标表示吸光度值，横坐标表示金纳米标记的巯基信号探针浓度；
图9所示为肉眼分辨不同检测结果的银染结果；其中，阳性样本呈黑色，弱阳性样本呈灰色或浅灰色，阴性样本呈透明无色，整体趋势随浓度加深而呈现从无色透明到灰色再到黑色的渐变。
具体实施方式
本发明公开了一种检测沙眼衣原体的试剂盒及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述试剂盒及其应用经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的试剂盒及其应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明中所述的生物素修饰、包被链霉亲和素的载体以及金纳米标记的探针均可以采用常规的方法进行修饰、包被和标记。在本发明具体实施方式中，本发明提供了金纳米合成以及金纳米探针制备的优选方式：
向锥形瓶内加入50ml0.01％氯金酸，开启磁力搅拌并加热至沸腾。迅速加入1.3ml1％柠檬酸三钠，避光反应至不变色后继续反应5min。停止加热，搅拌至室温。采用紫外-可见吸收光谱、tem进行表征后取500μl金纳米溶液离心13200rpm，30min。弃上清后加入46μl磷酸缓冲液(10mmol/lpb，ph7.0)重悬，再加入4μl，100μmol/l巯基探针(在seqidno:2所示序列的5’或3’端偶联有巯基基团的探针)。避光37℃80rpm震荡16h以上。每隔16h缓慢加入pbs(0.2mol/lnacl，10mmol/lpb，ph7.0)，共三次，使体系中nacl终浓度为0.1mol/lnacl。13200rpm，离心30min，弃上清后加入重悬液(2.5％蔗糖，0.1％peg8000,0.1mol/lnacl,10mmol/lpb,ph7.0)混匀后13200rpm，离心30min，弃上清后重复重悬2次，最后用重悬液定容至400μl，4℃避光保存。
以下就本发明所提供的一种检测沙眼衣原体的试剂盒及其应用做进一步说明。
实施例1：模板选择和探针设计
选择特定沙眼衣原体保守序列作为模板。模板通过primer-blast设计上游引物5’-gtgcgggacaacatggagta-3’(seqidno:3)，下游引物5’-aaggtcctaaggccgatcct-3’(seqidno:4)。
根据模板用oligo7.0设计探针：
生物素捕获探针5’-biotin(a)10tgttacagaaacgacttcagcacc-3’
巯基信号探针5’-gcgcattttctctacatttggttt(a)10-(ch2)3-sh-3’
实施例2：沙眼衣原体dna提取以及靶序列制备
根据omega核酸提取试剂盒说明书对沙眼衣原体dna进行抽提，对抽提所得dna进行pcr扩增。总体系为50μl，2×taqmix25μl，10μmol/l上下游引物各1μl，dna模板2μl，ddh2o21μl。pcr条件94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸10min。所得产物用dna纯化试剂盒处理后，经紫外分光光度计测定核酸浓度后备用。
实施例3：金纳米合成以及金纳米探针制备
向锥形瓶内加入50ml0.01％氯金酸，开启磁力搅拌并加热至沸腾。迅速加入1.3ml1％柠檬酸三钠，避光反应至不变色后继续反应5min。停止加热，搅拌至室温。采用紫外-可见吸收光谱、tem进行表征后取500μl金纳米溶液离心13200rpm，30min。弃上清后加入46μl磷酸缓冲液(10mmol/lpb，ph7.0)重悬，再加入4μl，100μmol/l巯基探针。避光37℃80rpm震荡16h以上。每隔16h缓慢加入pbs(0.2mol/lnacl，10mmol/lpb，ph7.0)，共三次，使体系中nacl终浓度为0.1mol/lnacl。13200rpm，离心30min，弃上清后加入重悬液(2.5％蔗糖，0.1％peg8000,0.1mol/lnacl,10mmol/lpb,ph7.0)混匀后13200rpm，离心30min，弃上清后重复重悬2次，最后用重悬液定容至400μl，4℃避光保存。
实施例4：探针杂交
取扩增后靶序列95℃变性5min，冰浴3min，分别取变性处理后的靶序列10μl、杂交缓冲液20μl、生物素标记的捕获探针10μl(100nmol/l)、金纳米标记的信号探针10μl(4.05nmol/l)，于ep管中混合。45℃反应5min后，将上述50μl杂交混合液转移至包被链霉亲和素的96孔板内，25℃反应90-120min后弃反应液，用2xssc缓冲液洗涤1次后拍干，0.5xssc缓冲液洗涤1次后拍干，0.2xssc缓冲液洗涤一次后拍干。
实施例5：银染
将1.7g氢醌，0.6g明胶，2.55g柠檬酸，2.35g柠檬酸三钠溶于100ml超纯水中配置成引发液。将0.2g硝酸银溶解于2ml超纯水配置得银增强液。取20μl银增强液加入到1ml引发液中混匀，加入96孔板中37℃避光孵育10min后，用超纯水洗涤96孔板，拍干后置于酶标仪上，测定630nm处吸光度a值。
实施例6：特异性检测
用实施例1-5的检测方法对沙眼衣原体、支原体、淋病奈瑟菌、梅毒螺旋体进行检测，判断所述试剂盒检测时的特异性。结果见图2。图2结果可以明显看出，经统计学分析，沙眼衣原体与其它生殖道病原菌之间差异显著(p＜0.05)，该方法具有较高特异性。
实施例7：线性范围和灵敏度检测
将扩增后的靶序列用超纯水稀释成不同浓度后(20pmol/l、50pmol/l、100pmol/l、150pmol/l、200pmol/l、500pmol/l、1nmol/l、1.5nmol/l、2nmol/l、4nmol/l、10nmol/l)，用实施例1-5的检测方法进行检测，获得灵敏度和线性范围。结果见图3，其在100pmol/l至2nmol/l时具有良好线性，同时具备极佳的灵敏度。
实施例8：临床检测
收集临床沙眼衣原体样本，提取dna后用传统pcr法以及本发明试剂盒进行检测，比较两者差异。结果见表1。
表1pcr法与金纳米标记银染色法临床样本检测结果比较
经配对χ2检验显示两种方法间的检测结果无显著性差异(p＞0.05)。
实施例9：不同检测条件对结果的影响
建立检测体系后保持其它条件不变分别对反应体系的温度、反应时间、银染时间、捕获探针浓度、金纳米信号探针浓度等一系列条件进行优化。
1、图4杂交时间梯度结果显示，在90～120min时反应信号强度最明显，120min之后由于空白孔非特异性吸附金纳米颗粒，背景值升高使得相对吸光度下降；
2、图5杂交温度试验发现25℃时该体系信号强度最大，故选择25℃作为最佳杂交温度条件；
3、图6银染时间结果显示，在银染10min内信号强度随时间增加而增强，10min后由于空白孔非特异性吸附导致背景值升高，相对吸光度值下降。故选择10min作为本体系银染最佳时间；
4、图7生物素修饰探针浓度试验显示，生物素探针浓度为100nmol/l时信号强度最高，大于或小于100nmol/l浓度信号均显著降低。
5、图8金纳米标记的巯基信号探针浓度显示，金纳米探针浓度于4.05nmol/l时信号强度最高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>南华大学
<120>一种检测沙眼衣原体的试剂盒及其应用
<130>mp1806382
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>34
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
aaaaaaaaaatgttacagaaacgacttcagcacc34
<210>2
<211>34
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gcgcattttctctacatttggtttaaaaaaaaaa34
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
gtgcgggacaacatggagta20
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
aaggtcctaaggccgatcct20