本发明涉及水产生物技术领域，特别涉及一种用于欧鳇苗种鉴定的生物传感检测方法。
背景技术
鲟鱼是鲟形目(acipenseriformes)鱼类的统称，全世界现存2科6属27种，已全部列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(cites)保护物种名录，当前合法销售的鲟鱼及其制品主要依赖人工养殖。在这一背景下，我国鲟鱼养殖产业蓬勃发展，年产量从2003年的0.94万吨增长至2016年的8.98万吨，稳居世界第一鲟鱼养殖大国，占世界总产量的80％以上。2017年起，鲟鱼被列入国家现代农业产业技术体系(特色淡水鱼体系)中。
鲟鱼是水产养殖物种中典型的高附加值品类，其鱼卵加工而成的鱼子酱是国际公认的高端食材，具有深厚的历史积淀和文化传承。鱼子酱饮食文化中对鱼卵的种质来源有着严格的限定，不同物种的鱼子酱价格差异巨大，使用欧鳇鱼卵加工而成的beluga鱼子酱为其中的极品，价比黄金。但目前人工养殖的鲟鱼品类繁多，不仅包括鲟形目的多个物种，还涉及多个人工育成的杂交品种，外形相似度较高，很多养殖机构和人员并不清楚养殖对象的遗传背景。
目前进行鲟鱼物种鉴定主要采用的方法包括形态学和分子生物学方法。形态学方法不适用于受精卵和小规格苗种，无法在苗种引进阶段准确鉴定物种，而以物种特异性dna序列为检测靶标的方法则不受发育时期、样本形态、组织来源的影响，并能够形成易于标准化的检测体系，在物种鉴定技术中逐渐占据了主流地位。
congiu等使用aflp分子标记方法进行了鲟鱼及鱼子酱产品的鉴别应用，chelomina等使用rapd分子标记进行施氏鲟(acipenserschrenckii)自然种群中杂交种鉴别分析，董传举等开发了基于线粒体dna的pcr-rflp分子鉴定方法，但现有方法均需要通过电泳操作来检测产物，操作不当时对检测人员存在健康风险，未经安全处理的实验废弃物也可能造成环境污染隐患，因此只适用于专业实验室，不适用于现场检测。
因此，亟待开发准确便捷的现场检测技术，用于苗种引进时鉴定其物种来源，协助养殖机构开展养殖对象和加工产品分级。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种用于欧鳇苗种鉴定的生物传感检测方法，其能够通过对鲟鱼的待测苗种进行检测，以在欧鳇引进时鉴定其物种来源，协助养殖机构开展养殖对象和加工产品分级。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种用于欧鳇苗种鉴定的生物传感检测方法，以待测苗种的dna为模板进行探针延伸获得探针延伸产物，应用生物传感检测方法检测所述探针延伸产物是否能够通过锚定标记分子锚定至修饰有锚定受体的电极表面并产生电化学信号，若是，则待测苗种为欧鳇苗种，其中，包括以下步骤：
在探针延伸中，将带有锚定标记分子的dutp连接至如seqidno:3所示的核苷酸序列的探针上以获得所述待测苗种中欧鳇苗种的探针延伸产物。
优选的是，还包括以下步骤：在探针延伸之前，向提取的待测苗种的dna中依次加入带有锚定标记分子的dutp、datp、dttp、dna聚合酶、缓冲液和如seqidno:3所示的核苷酸序列作为欧鳇特异性单链dna探针构建探针延伸反应体系。
优选的是，所述步骤一还包括以下步骤：提取待测苗种的dna，以如seqidno:1和seqidno:2所示的核苷酸序列作为特异性引物进行pcr扩增，纯化pcr产物；
向所述纯化pcr产物中加入datp、dttp、带有锚定标记分子的dutp、dna聚合酶、缓冲液和如seqidno:3所示的核苷酸序列作为欧鳇特异性单链dna探针构建探针延伸反应体系并进行探针延伸。
优选的是，所述步骤一还包括以下步骤：向所述纯化pcr产物中加入datp、dttp、带有锚定标记分子的dutp、dna聚合酶及其缓冲液，之后分为均等的两份；其中一份中加入如seqidno:3所示的核苷酸序列作为欧鳇特异性单链dna探针以构建探针延伸反应体系并进行探针延伸获得探针延伸产物ⅰ；另一份中加入如seqidno:4所示的核苷酸序列作为鲟属通用性单链dna探针以构建探针延伸反应体系并进行探针延伸获得探针延伸产物ⅱ；
所述步骤二还包括：将所述探针延伸产物ⅰ和所述探针延伸产物ⅱ分别滴加于两支修饰有锚定受体的电极表面进行锚定反应，检测所述电极表面是否存在所述电化学活性标记分子的电化学信号，若两支修饰有锚定受体的电极表面均能够检测到所述电化学标记分子的电化学信号，表明所述待测苗种为具有欧鳇血统的杂交鲟；若滴加所述探针延伸产物ⅰ的电极表面未检测到所述电化学标记分子的电化学信号，滴加所述探针延伸产物ⅱ的电极表面检测到所述电化学标记分子的电化学信号，表明所述待测苗种为除欧鳇之外的其他鲟鱼。
优选的是，若两支修饰有锚定受体的电极表面均未检测到所述电化学标记分子的电化学信号，则探针延伸反应体系异常，检测失败。
优选的是，所述的用于鲑鳟鱼苗种鉴定的生物传感检测方法中，所述的电化学活性标记分子为二茂铁及其衍生物、铁氰化钾、硫堇、邻苯二酚、对苯二酚、稀土单酞菁、铱氯水配合物、血红蛋白和肌红蛋白中的任意一种。
优选的是，所述锚定分子为生物素、亲和素、抗原、抗体、抗抗体、细胞因子、受体和核酸适配体中的任意一种。
优选的是，所述的电化学信号为差分脉冲伏安信号、循环伏安信号或交流阻抗信号。
优选的是，所述pcr扩增的反应条件为94℃预变性5min，然后94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，从预热、退火到延伸重复25个循环，然后72℃延伸5min，
94℃变性5min，迅速降温至4℃。
优选的是，datp、dttp、dutp物质的量比为2:1:1；
其中，所述的dna聚合酶为bstdna聚合酶时，探针延伸的反应温度为60-65℃，反应时间为1-3min；
所述dna聚合酶为高保真taqdna聚合酶时，探针延伸反应温度60-70℃，反应时间为1-3min。
优选的是，所述的锚定标记分子为生物素，所述的锚定受体为亲和素或链霉亲和素，锚定反应温度为37℃，锚定反应时间为10-30min。
优选的是，将探针延伸后的探针延伸产物滴加于修饰有锚定受体的电极表面进行锚定反应，然后洗脱电极表面未结合的反应液成分；其中，洗脱条件为使用ph7.0的tris-edta缓冲液洗脱3次，每次洗脱2-5min。
本发明至少包括以下有益效果：
一种准确便捷的欧鳇物种鉴定技术，适用于处在生活史任何阶段、任意形态的鱼类样本，包括鱼卵、鱼苗、成鱼，以及dna未完全降解的各种组织和制品。
本发明中pcr扩增靶标为待测苗种的核基因组内的血红蛋白基因，规避了常规物种鉴定技术中靶序列来源于线粒体基因组的母系遗传特征，能够避免人工养殖中杂交制种对检测结果的误导。
本发明基于电化学生物传感检测原理，易于数字化和集成化，可在其基础上构建芯片进行高通量多位点快速检测。
本发明不使用任何有毒有害试剂，检测操作全程不存在人身健康或环境污染隐患。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明中引物和探针的基因组位置比对图，所示序列自上而下依次为俄罗斯鲟(acipensergueldenstaedtii)、裸腹鲟(acipensernudiventris)、闪光鲟(acipenserstellatus)、小体鲟(acipenserruthenus)、欧鳇(husohuso)血红蛋白基因，以及俄罗斯鲟(acipensergueldenstaedtii)血红蛋白基因编码区，序列右侧数字表示在相应物种肌红蛋白基因上的位置，序列下方柱状图表示碱基保守性，背景框中的序列依次为上游引物(forwardprimer)、鲟属通用性探针(acipenserprobe)、欧鳇特异性探针(husoprobe)、下游引物(reverseprimer)的结合位置，箭头指示引物或探针方向(5’至3’)；
图2为本发明检测欧鳇样品的差分脉冲伏安信号，粗实线表示欧鳇特异性探针(h-probe)延伸产物检测信号，细虚线表示鲟属通用性探针(a-probe)延伸产物检测信号；
图3为本发明检测中华鲟(acipensersinensis)样品的差分脉冲伏安信号，粗实线表示欧鳇特异性探针(h-probe)延伸产物检测信号，细虚线表示鲟属通用性探针(a-probe)延伸产物检测信号；
图4为本发明检测杂交鲟(欧鳇×俄罗斯鲟)样品的差分脉冲伏安信号，粗实线表示欧鳇特异性探针(h-probe)延伸产物检测信号，细虚线表示鲟属通用性探针(a-probe)延伸产物检测信号。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种基于生物传感原理的检测技术，使用带有电化学活性标记的单链dna探针，识别并结合待测样品基因组dna中的互补序列，在dna聚合酶的催化作用下延伸，向探针末端添加带有锚定标记的核苷酸，然后利用锚定标记将扩增产物捕获在电极表面，检测电极表面的电化学活性，从而准确判定样品的物种来源。
本发明中，pcr扩增引物位于核基因组中的血红蛋白基因外显子区，保守程度较高，以各种鲟形目鱼类dna为模板均能获得扩增产物，其中以欧鳇dna为模板的扩增产物长度为252bp。欧鳇特异性探针和鲟属通用性探针均位于血红蛋白基因内含子区，探针结合位点下游为一段仅由at碱基组成的7bp序列。引物和探针序列及其基因组位置如图1所示。将引物和探针序列在ncbi数据库现有的鲟鱼基因组序列中进行blast比对，证实不存在非特异性扩增或结合。
一种用于欧鳇苗种鉴定的生物传感检测方法，以待测苗种的dna为模板进行探针延伸获得探针延伸产物，应用生物传感检测方法检测所述探针延伸产物是否能够通过锚定标记分子锚定至修饰有锚定受体的电极表面并产生电化学信号，若是，则待测苗种为欧鳇苗种，其中，包括以下步骤：在探针延伸中，将带有锚定标记分子的dutp连接至如seqidno:3所示的核苷酸序列的探针上以获得所述待测苗种中欧鳇苗种的探针延伸产物。
在本方案中，将提取待测苗种的dna作为直接的检测对象，只要应用生物传感检测方法检测到探针延伸产物能够产生电化学信号(电化学检测设备的最低检测限低于0.1na时，即可直接用于检测待测苗种的dna的探针延伸产物，而不需要pcr扩增)，即可获得检测结果为待测苗种为欧鳇苗种，检测方法准确便捷，适用于处在生活史任何阶段、任意形态的鱼类样本，包括鱼卵、鱼苗、成鱼，以及dna未完全降解的各种组织和制品。方法简单灵敏，应用范围广。
如图1所示，在一个优选方案中，所述步骤一还包括以下步骤：提取待测苗种的dna，以如seqidno:1和seqidno:2所示的核苷酸序列作为特异性引物进行pcr扩增，纯化pcr产物；向所述纯化pcr产物中加入datp、dttp、带有锚定标记分子的dutp、dna聚合酶、缓冲液和如seqidno:3所示的核苷酸序列作为欧鳇特异性单链dna探针构建探针延伸反应体系并进行探针延伸。在实际检测过程中，探针延伸反应的底物中只含有datp、dttp和dutp，不含dgtp和dctp，只有结合在欧鳇基因组预期靶标位置的单链dna探针才能够成功延伸，同时带有电化学活性标记和锚定标记，然后被偶联有锚定受体的电极表面所捕获，检出电化学信号。当欧鳇特异性探针与非欧鳇的其它鲟鱼基因组dna结合时，其下游连续的3个碱基为cgc，因缺乏底物dctp、gttp而不能延伸，锚定标记无法添加，因而不能被电极表面捕获。
一个优选方案中，所述步骤一还包括以下步骤：提取待测苗种的dna，以如seqidno:1和seqidno:2所示的核苷酸序列作为特异性引物进行pcr扩增，纯化pcr产物；向所述纯化pcr产物中加入datp、dttp、带有锚定标记分子的dutp、dna聚合酶、缓冲液和如seqidno:3所示的核苷酸序列作为欧鳇特异性单链dna探针构建探针延伸反应体系并进行探针延伸。本方案中，以如seqidno:1和seqidno:2所示的核苷酸序列作为特异性引物进行pcr扩增，以数量级增大待测苗种的dna中seqidno:3所示的核苷酸序列作为欧鳇特异性单链dna探针进行探针延伸的部分dna片段，进而放大电化学信号，保证检测结果准确可靠。其中使用的人工dna序列如下：
seqidno:1：cactgagagtcgatcctgcca
seqidno:2：cagggaagtaaagggccagg
seqidno:3：tagctatagtacaatatcat
seqidno:4：catcgcagaaatatcgg
扩增的部分dna片段的核苷酸序列如seqidno:5所示。
一个优选方案中，所述步骤一还包括以下步骤：向所述纯化pcr产物中加入datp、dttp、带有锚定标记分子的dutp、dna聚合酶及其缓冲液，之后分为均等的两份；其中一份中加入如seqidno:3所示的核苷酸序列作为欧鳇特异性单链dna探针以构建探针延伸反应体系并进行探针延伸获得探针延伸产物ⅰ；另一份中加入如seqidno:4所示的核苷酸序列作为鲟属通用性单链dna探针以构建探针延伸反应体系并进行探针延伸获得探针延伸产物ⅱ；所述步骤二还包括：将所述探针延伸产物ⅰ和所述探针延伸产物ⅱ分别滴加于两支修饰有锚定受体的电极表面进行锚定反应，检测所述电极表面是否存在所述电化学活性标记分子的电化学信号，若两支修饰有锚定受体的电极表面均能够检测到所述电化学标记分子的电化学信号，表明所述待测苗种为具有欧鳇血统的杂交鲟；若滴加所述探针延伸产物ⅰ的电极表面未检测到所述电化学标记分子的电化学信号，滴加所述探针延伸产物ⅱ的电极表面检测到所述电化学标记分子的电化学信号，表明所述待测苗种为除欧鳇之外的其他鲟鱼。
在方案中，探针延伸反应的底物中只含有datp、dttp和dutp，不含dgtp和dctp，因此只有结合在预期靶标位置的单链dna探针才能够成功延伸，同时带有电化学活性标记和锚定标记，然后被偶联有锚定受体的电极表面所捕获，检出电化学信号。当欧鳇特异性探针与非欧鳇的其它鲟鱼基因组dna结合时，其下游连续的3个碱基为cgc，因缺乏底物而不能延伸，锚定标记无法添加，因而不能被电极表面捕获。鲟属通用性探针在纯种欧鳇基因组内无结合位点，也不能延伸，检测体系中设置该探针的作用在于，检出基因组内同时含有欧鳇和其它鲟鱼遗传成分的杂交鲟，并在检测出非欧鳇苗种时充当质控，指示所有实验流程操作成功。其他鲟鱼种类包括钝吻鲟siberiansturgeonacipenserbaeribrandt、短吻鲟shortnosesturgeonacipenserbrevirostrumlesueur、达氏鲟riversturgeonacipenserdabryanusdumeril、黄鲟lakesturgeonacipenserfulvescensrafinesque、俄罗斯鲟russiansturgeonacipensergueldenstaedtibrandt、中吻鲟greensturgeonacipensermedirostrisayres、裸腹鲟shipsturgeonacipensernudiventrislovetzky、尖吻鲟atlanticsturgeonacipenseroxyrhynchusmitchill、小体鲟sterletacipenserruthenuslinnaeus、史氏鲟amursturgeonacipenserschrenckiibrandt、中华鲟chinesesturgeonacipensersinensisgray、闪光鲟stellatesturgeonacipenserstellatuspallas、大西洋鲟commonsturgeonacipensersturiolinnaeus、高首鲟whitesturgeonacipensertransmontanusrichardson、匙吻鲟paddlefishpolyodonspathula、白鲟chinesepaddlefishpsephurusgladius、拟铲鲟asiaticshovelnosesturgeonpseudoscaphirhynchusfedtschenkoi、短尾拟铲鲟pygmysturgeonpseudoscaphirhynchushermanni、丝尾拟铲鲟threadtailsturgeonpseudoscaphirhynchuskaufmanni、苍铲鲟pallidsturgeonscaphirhynchusalbus和铲鲟shovelnosesturgeonscaphirhynchusplatorhynchus。
一个优选方案中，若两支修饰有锚定受体的电极表面均未检测到所述电化学标记分子的电化学信号，则探针延伸反应体系异常，检测失败。若欧鳇特异性探针和鲟属通用性探针检测电极均无信号，提示应排查dna提取是否成功、各步骤反应是否正常等操作问题，具有一定的故障排查作用。
一个优选方案中，所述电化学活性标记分子为二茂铁及其衍生物、铁氰化钾、硫堇、邻苯二酚、对苯二酚、稀土单酞菁、铱氯水配合物、血红蛋白和肌红蛋白中的任意一种。
一个优选方案中，所述锚定分子为生物素、亲和素、抗原、抗体、抗抗体、细胞因子、受体和核酸适配体中的任意一种。
一个优选方案中，所述的电化学信号为差分脉冲伏安信号、循环伏安信号或交流阻抗信号。
一个优选方案中，所述pcr扩增的反应条件为94℃预变性5min，然后94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，从预热、退火到延伸重复25个循环，然后72℃延伸5min，94℃变性5min，迅速降温至4℃。
一个优选方案中，datp、dttp、dutp物质的量比为2:1:1；
其中，所述的dna聚合酶为bstdna聚合酶时，探针延伸的反应温度为60-65℃，反应时间为1-3min；
所述dna聚合酶为高保真taqdna聚合酶时，探针延伸反应温度60-70℃，反应时间为1-3min。
一个优选方案中，所述的锚定标记分子为生物素，所述的锚定受体为亲和素或链霉亲和素，锚定反应温度为37℃，锚定反应时间为10-30min。
一个优选方案中，将探针延伸后的探针延伸产物滴加于修饰有锚定受体的电极表面进行锚定反应，然后洗脱电极表面未结合的反应液成分；其中，洗脱条件为使用ph7.0的tris-edta缓冲液洗脱3次，每次洗脱2-5min。
实施例1
1.基因组dna提取
取1月龄鲟鱼幼鱼组织约100mg，使用海洋动物基因组dna提取试剂盒(天根dp324-03)，按照说明书步骤提取基因组dna，溶于100μl灭菌去离子水，紫外分光光度计测定浓度。
2.溶液配制
定制合成碱基序列如seqidno:1-4所示寡核苷酸(上海生工)，其中seqidno:3-4序列5’端带有二茂铁修饰，分别溶于无核酸酶的灭菌去离子水，配制成10μm的使用液。
使用无核酸酶的灭菌去离子水配制dntp使用液，使之含有datp、dttp、dctp、dgtp各2mm。使用无核酸酶的灭菌去离子水配制dattp使用液，使之含有datp2mm、dttp1mm、biotin-16-dutp1mm。
3.pcr扩增
反应体系如下：
pcr程序为
4.pcr产物纯化
向50μlpcr反应液中，加入4m醋酸铵10μl、无水乙醇180μl，颠倒混合，轻微离心，室温静置10min。4℃下15000rpm离心10min。弃上清，加70％乙醇150μl，4℃下15000rpm离心10min，弃上清，真空干燥。
5.探针结合与延伸
向pcr纯化产物中，依次加入灭菌去离子水13μl、dattp使用液10μl、8u/μl的bstdna聚合酶2.0μl、10xbstdna聚合酶缓冲液5.0μl，吹吸混匀后等分为2管，分别加入seqidno:3探针10μl，及seqidno:4探针10μl。65℃反应1min。
6.电极表面修饰
使用au2o3粉末对金电极进行抛光，超声波清洗5min，浸入纳米金溶液(sigma，柠檬酸钠还原氯金酸法制备，粒径30nm)，+1.55v电位下沉积15min，静置5min，灭菌去离子水清洗。
电极表面浸入含10mmα-硫辛酸的乙醇溶液活化20min，移入浓度为100g/l的edc/nhs混合液活化羧基，向电极表面滴加0.2g/l的亲和素50μl，偶联30min，去离子水洗脱未结合亲和素。超净台风干后可4℃长期保存，12个月内均可用于检测。短期保存可置于室温ph7.0磷酸缓冲液中。
将2管探针延伸产物，分别滴加在2支修饰电极表面，37℃温育30min。
将dna修饰电极浸入ph7.0tris-edta缓冲液，洗脱5min，换新的缓冲液重复2次。
7.电化学信号检测
采用三电极测试系统，以dna修饰电极为工作电极，铂丝(直径1mm)为对电极，ag/agcl为参比电极，20mlph7.0磷酸缓冲溶液为支持电解质，在0.1mkclo4存在的条件下，分别测定3支电极的差分脉冲伏安曲线，扫描电位设为0至+500mv，振幅设为50mv。
8.检测结果
欧鳇样品检测结果如图2所示，粗实线表示欧鳇特异性探针(h-probe)延伸产物检测信号，细虚线表示鲟属通用性探针(a-probe)延伸产物检测信号，图中可见h-probe呈现出典型的差分脉冲伏安信号，峰电位位于+244mv，峰电流值为1128na，而a-probe未出现特征性电化学信号，基线呈平缓上升趋势。
中华鲟样品检测结果如图3所示，粗实线表示欧鳇特异性探针(h-probe)延伸产物检测信号，细虚线表示鲟属通用性探针(a-probe)延伸产物检测信号，图中可见a-probe呈现出典型的差分脉冲伏安信号，峰电位位于+266mv，峰电流值为1137na，而h-probe未出现特征性电化学信号，基线呈平缓上升趋势。
杂交鲟(欧鳇×俄罗斯鲟)样品检测结果如图4所示，粗实线表示欧鳇特异性探针(h-probe)延伸产物检测信号，细虚线表示鲟属通用性探针(a-probe)延伸产物检测信号，图中可见h-probe和a-probe均检测到明显的差分脉冲伏安信号，h-probe峰电位位于+250mv，峰电流值为709na，a-probe峰电位比h-probe略有右移，位于+262mv，峰电流值也略有升高，达到762na。
这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的用于欧鳇苗种鉴定的生物传感检测方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离说明书及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
<110>中国水产科学研究院生物技术研究中心
<120>用于鲟鱼苗种鉴定的生物传感检测方法
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cactgagagtcgatcctgccaacttcaaggtaaaaaagactttaataactttatatatga60
tattgtactatagctacgtggaataaacagttaggctattttttaaattgtatttactgt120
taaacatcattataggttatgttatcttgtcgttatgtatctggaagtggcactgattga180
ttgattgaattctgttttcatctcagcccttttcccacaccatccttgtggtcctggccc240
tttacttccctg252