本发明属于诊断领域，更具体地，本发明涉及诊断肿瘤的dna甲基化相关的标记物及其应用。
背景技术：
随着对肿瘤这一疾病的研究的深入，本领域中越来越多的证据表明表观遗传调控的细小变化在肿瘤中具有重要的作用。表观遗传学是研究基因在不发生dna序列改变的情况下，基因功能发生的可遗传的变化，并最终导致了表型的变化的一门学科。表观遗传学主要包括dna甲基化，组蛋白修饰，microrna水平变化等生化过程。dna甲基化是指生物体内在dna甲基转移酶的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。dna甲基化可以发生在腺嘌呤的n-6位、胞嘧啶的n-4位、鸟嘌呤的n-7位或胞嘧啶的c-5位等。但在哺乳动物中dna甲基化主要发生在5’-cpg-3’的c上，生成5-甲基胞嘧啶(5mc)。在基因组中98％以上的cpg二核苷酸散在的分布位于具有转录依赖性的转座潜能的重复序列中。在正常细胞中，这些cpg处于高度甲基化/转录沉默的状态，而在肿瘤细胞中这些cpg发生了广泛的去甲基化，导致重复序列的转录、转座子的活化，基因组的高度不稳定性和原癌基因转录增强。余下的占总量2％左右的cpg密集地分布于较小的区域(cpg岛)。约40％-50％的基因启动子区域或其附近存在cpg岛，暗示dna甲基化可能参与该类基因转录调控机制。在一些肿瘤中，这些原本在正常细胞中处于低甲基化状态的cpg岛会发生高甲基化而导致基因的转录失活。受影响的基因包括dna修复基因，细胞周期控制基因和抗凋亡基因等抑癌基因。鉴于目前临床常用的肿瘤标记物存在很高的假阳性与假阴性，例如甲胎蛋白(afp)，本领域亟需开发进一步的标志物。找到肿瘤细胞dna异常甲基化谱式，是研究肿瘤生物标志物的新途径。然而，需要大量的研究以及长期对大量患者的基因鉴定、比较，才能找到真正与肿瘤相关的异常甲基化谱式。技术实现要素：本发明的目的在于提供诊断肿瘤的dna甲基化相关的标记物及其应用。在本发明的第一方面，提供分离的多核苷酸，包括：(a)seqidno:1所示核苷酸序列的多核苷酸；(b)seqidno:3所示核苷酸序列的多核苷酸；(c)seqidno:5所示核苷酸序列的多核苷酸；(d)seqidno:7所示核苷酸序列的多核苷酸；(e)上述(a)～(d)的多核苷酸的片段，且其中存在至少1个(如2～40个，更具体如3，5，8，10，15，20，25，30，35个)修饰的cpg位点；和/或(f)与上述(a)～(e)的多核苷酸或片段互补的核酸(反义链)。在一个优选例中，所述修饰包括5-甲基化修饰(5mc)、5-羟甲基化修饰(5hmc)、5-醛甲基化修饰(5-fc)或5-羧甲基化(5-cac)修饰。在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，其由前面所述的多核苷酸转变而来，对应于上述(a)～(e)的序列，其修饰的cpg位点的胞嘧啶c不变，非修饰的胞嘧啶转为t(u)。在一个优选例中，其由对应于上述(a)～(e)的多核苷酸经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理转变而来。在另一优选例中，所述的多核苷酸包括：(g)seqidno:2所示核苷酸序列的多核苷酸；(h)seqidno:4所示核苷酸序列的多核苷酸；(i)seqidno:6所示核苷酸序列的多核苷酸；(j)seqidno:8所示核苷酸序列的多核苷酸；(k)上述(g)～(j)的多核苷酸的片段，且其中存在至少1个(如2～40个，更具体如3，5，8，10，15，20，25，30，35个)修饰的cpg位点。在本发明的另一方面，提供前面任一所述的多核苷酸的用途，用于制备肿瘤的检测试剂或试剂盒。在一个优选例中，所述的肿瘤包括：消化系统肿瘤如食道癌，胃癌，结直肠癌，肝癌，胰腺癌，胆管及胆囊癌；呼吸系统肿瘤如肺癌，胸膜瘤；血液系统肿瘤如白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤；妇科及生殖系统肿瘤如乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，外阴癌，睾丸癌，前列腺癌，阴茎癌；神经系统肿瘤如胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤；头颈部肿瘤如口腔癌，舌癌，喉癌，鼻咽癌；泌尿系统肿瘤如肾癌，膀胱癌，皮肤及其他系统如皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤，脂肪肉瘤，甲状腺癌。在本发明的另一方面，提供一种制备肿瘤检测试剂的方法，所述方法包括：提供前面任一所述的多核苷酸(如1，2，3或4条)，以所述多核苷酸的全长或片段作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的检测试剂；其中，所述的靶序列中存在至少1个(如2～40个，更具体如3，5，8，10，15，20，25，30，35个)修饰的cpg位点；较佳地，所述的检测试剂包括(但不限于)：引物，探针。在本发明的另一方面，提供试剂或组合的试剂，其特异性检测靶序列，所述的靶序列是前面任一所述的多核苷酸的全长或片段，其中存在至少1个(如2～40个，更具体如3，5，8，10，15，20，25，30，35个)修饰的cpg位点；较佳地，所述的检测试剂包括(但不限于)：引物，探针。在一个优选例中，所述的多核苷酸为seqidno:1所示核苷酸序列的多核苷酸，所述的靶序列包含seqidno:1中第240～296位的核苷酸片段；较佳地，所述的引物为seqidno:9～12所示的引物。在另一优选例中，所述的多核苷酸为seqidno:3所示核苷酸序列的多核苷酸，所述的靶序列包含seqidno:3中第279～323位的核苷酸片段；较佳地，所述的引物为seqidno:12～15所示的引物；或在另一优选例中，所述的多核苷酸为seqidno:5所示核苷酸序列的多核苷酸，所述的靶序列包含seqidno:5中第186～235位的核苷酸片段；较佳地，所述的引物为seqidno:12，16～18所示的引物；或在另一优选例中，所述的多核苷酸为seqidno:7所示核苷酸序列的多核苷酸，所述的靶序列包含seqidno:7中第164～198位的核苷酸片段；较佳地，所述的引物为seqidno:12，19～21所示的引物。在本发明的另一方面，提供所述的试剂或组合的试剂的用途，用于制备检测肿瘤的试剂盒；较佳地，所述的肿瘤包括：消化系统肿瘤如食道癌，胃癌，结直肠癌，肝癌，胰腺癌，胆管及胆囊癌；呼吸系统肿瘤如肺癌，胸膜瘤；血液系统肿瘤如白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤；妇科及生殖系统肿瘤如乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，外阴癌，睾丸癌，前列腺癌，阴茎癌；神经系统肿瘤如胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤；头颈部肿瘤如口腔癌，舌癌，喉癌，鼻咽癌；泌尿系统肿瘤如肾癌，膀胱癌，皮肤及其他系统如皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤，脂肪肉瘤，甲状腺癌。在本发明的另一方面，提供一种检测试剂盒，其包括：容器，以及位于容器中的所述的试剂或试剂组合；较佳地，每一种试剂位于一个独立的容器中。在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括：亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐，dna纯化试剂，dna提取试剂，pcr扩增试剂和/或使用说明书(标明检测操作步骤和结果判定标准)。在本发明的另一方面，提供一种体外检测样品中所述的多核苷酸或其片段的甲基化谱式的方法，包括：(i)提供样品，提取dna；(ii)对待测样本进行处理，使未发生修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶；较佳地，所述修饰包括5-甲基化修饰(5mc)、5-羟甲基化修饰(5hmc)、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰；较佳地，利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(i)所述的dna；(iii)分析经步骤(ii)处理的基因组dna中所述的多核苷酸或其片段的修饰情况。在一个优选例中，所述的甲基化谱式异常是指该多核苷酸cpg中的c发生高度甲基化。在另一优选例中，所述的甲基化谱式的方法不以直接获得疾病的诊断结果为目的，或不是诊断性的方法。在另一优选例中，步骤(3)中，分析的方法包括(但不限于)：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、qpcr法、二代测序法、全基因组甲基化测序法、dna富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、hplc法、或它们的组合。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、ctsm-4f在结直肠癌中检测结果。图2、ctsm-4f在肝癌中检测结果。图3、ctsm-4f在头颈部肿瘤中检测结果。图4、ctsm-4f在肺癌中检测结果。图5、ctsm-2be在乳腺癌中检测结果。图6、ctsm-2be在头颈部肿瘤中检测结果。图7、ctsm-2be在肺癌中检测结果。图8、ctsm-2be在胰腺癌中检测结果。图9、ctsm-3c在结直肠癌中检测结果。图10、ctsm-3c在头颈部癌中检测结果。图11、ctsm-3c在肺癌中检测结果。图12、ctsm-4i在乳腺癌中检测结果。图13、ctsm-4i在结直肠癌中检测结果。图14、ctsm-4i在头颈部癌中检测结果。图15、ctsm-4i在肺癌中检测结果。具体实施方式本发明人致力于肿瘤标志物的研究，经过广泛的研究筛选，鉴定到基因组中dna甲基化异常的基因序列区域，命名为肿瘤标志物ctsm-4f、ctsm-2be、ctsm-3c、ctsm-4i。针对临床样本的研究显示，这些序列区域的甲基化状态在肿瘤组织和非肿瘤组织之间存在显著的差异，其cpg发生高度甲基化。因此，这些基因是肿瘤的标志物；可作为设计肿瘤诊断试剂的基础。术语如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“样本”或“样品”包括从任何个体或分离的组织、细胞或体液中获得的、适合于dna甲基化状态检测的物质。如本文所用，“高(度)甲基化”是指在一个基因序列中cpg存在高度甲基化、羟甲基化、醛甲基化或羧甲基化修饰。例如，以甲基化特异pcr(msp)分析手段而言，以甲基化特异性引物所进行的pcr反应可获得阳性的pcr结果即可认为该受试的dna(基因)区处于高甲基化状态。例如，以实时定量甲基化特异性pcr而言，高甲基化状态的判定可根据其对照样品的甲基化状态的相对值分析统计学差异。如本文所用，所述的肿瘤包括但不限于：消化系统肿瘤如食道癌，胃癌，结直肠癌，肝癌，胰腺癌，胆管及胆囊癌；呼吸系统肿瘤如肺癌，胸膜瘤；血液系统肿瘤如白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤；妇科及生殖系统肿瘤如乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，外阴癌，睾丸癌，前列腺癌，阴茎癌；神经系统肿瘤如胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤；头颈部肿瘤如口腔癌，舌癌，喉癌，鼻咽癌；泌尿系统肿瘤如肾癌，膀胱癌，皮肤及其他系统如皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤，脂肪肉瘤，甲状腺癌。基因标志物为了寻找对于诊断肿瘤有用的靶标，本发明人经过了广泛而深入的研究，最终找到了一组基因序列区域，它们是ctsm-4f、ctsm-2be、ctsm-3c、ctsm-4i。这些基因序列区域的甲基化状态在肿瘤组织和非肿瘤组织之间存在显著的差异，只要检测到其中一个上述基因的启动子区域发生异常的甲基化状态(高度甲基化)，即可判定该受检者为肿瘤高危人员。因此，本发明提供了分离的多核苷酸，所述的多核苷酸来自于人基因组，具有seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7所示核苷酸序列，在肿瘤患者的肿瘤细胞内，该多核苷酸序列中，多处5’-cpg-3’的碱基c位置上，生成5-甲基胞嘧啶(5mc)。本发明也包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7所示核苷酸序列的多核苷酸的片段，且其中存在至少1个(如2～40个，更具体如3，5，8，10，15，20，25，30，35个)甲基化cpg位点。上述的多核苷酸或片段或互补链(反义链)也可以应用于设计检测试剂或检测试剂盒。上述的多核苷酸可以作为基因组中人们分析甲基化状态的关键区域，通过各种本领域已知的技术来分析它们的甲基化状态。任何可用于分析甲基化状态的技术均可被应用于本发明。上述的多核苷酸在经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后，其中未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶保持不变。因此，本发明还提供了上述多核苷酸(包括其互补链(反义链))经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸，包括：seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6、seqidno:8所示核苷酸序列的多核苷酸。这些多核苷酸也可以应用于设计检测试剂或检测试剂盒。本发明也包含上述多核苷酸(包括其互补链(反义链))经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸的片段，且其中存在至少1个甲基化cpg位点。检测试剂及试剂盒基于本发明的新发现，还提供了基于所述的多核苷酸序列设计的检测试剂，用于体外检测样品中多核苷酸的甲基化谱式。本领域已知的确定基因组的序列及甲基化状态的检测方法和试剂均可被应用于本发明中。因此，本发明提供了一种制备肿瘤检测试剂的方法，包括：提供所述的多核苷酸(1，2，3或4条)，以所述多核苷酸的全长或片段作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的检测试剂；其中，所述的靶序列中存在至少1个甲基化cpg位点。在本发明的优选方式中，所述的靶序列包含seqidno:1中第240～296位的核苷酸片段；或包含seqidno:3中第279～323位的核苷酸片段；或包含seqidno:5中第186～235位的核苷酸片段；较佳地，所述的引物为seqidno:12，16～18所示的引物；或包含seqidno:7中第164～198位的核苷酸片段。所述的检测试剂包括但不限于：引物，探针，等等。所述的试剂例如是引物对，在得知了多核苷酸的序列后，设计引物是本领域技术人员已知的，两个引物在将被扩增的目标基因特定序列的两侧(包含cpg序列在内，与其中cpg互补为针对原为甲基化的基因区，而与其中tpg互补为针对原为去甲基化的基因区)。所述的试剂也可以是试剂组合(引物组合)，包括多于一组的引物，从而可分别扩增上述的多条多核苷酸。作为本发明的优选方式，所述的引物为seqidno:9～12所示的引物；或为seqidno:12～15所示的引物；或为seqidno:12，16～18所示的引物；或为seqidno:12，19～21所示的引物。上述引物为应用于进行巢式pcr的引物，通过两轮pcr扩增反应，获得的扩增产物用于序列鉴定。上述的引物扩增获得的产物具有合适的长度，且特异性高，对于复杂体系的扩增也具有良好的特异性，特别适合用于甲基化特异性pcr。本发明还提供了体外检测样品中多核苷酸的甲基化谱式的试剂盒，该试剂盒包括：容器，以及位于容器中的上述引物对。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取dna、dna纯化、pcr扩增等所需的各种试剂。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书，其中标明检测操作步骤和结果判定标准，以便于本领域技术人员应用。检测方法测定多核苷酸的甲基化谱式可通过已有的技术(如甲基化特异性pcr(msp)或实时定量甲基化特异性pcr，methylight)来进行，或其它仍在发展中和将被开发出来的技术来进行。检测甲基化水平时也可使用定量甲基化特异性pcr(qmsp)的方法。这种方法是基于一种荧光pcr的持续性的光学监控，其较msp方法更为敏感。其通量高并避免了用电泳方法对其结果进行分析。其他可用的技术还有：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、qpcr法、二代测序法、全基因组甲基化测序法、dna富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术或hplc法以及组合基因群组检测法等该领域常规方法。应理解，在本发明的新揭示的基础上，本领域公知的这些技术以及即将发展的一些技术，均可被应用于本发明中。作为本发明的优选方式，还提供了一种体外检测样品中多核苷酸的甲基化谱式的方法。所述的方法基于的原理是：亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐可以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，在后续的pcr扩增过程中转变为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变；因而，经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理多核苷酸后，甲基化的位点产生类似于一个c/t的多核苷酸多态性(snp)。基于上述原理来鉴定检测样品中多核苷酸的甲基化谱式，可以有效区分出甲基化与非甲基化的胞嘧啶。本发明所述的方法包括：包括：(a)提供样品，提取基因组dna；(b)利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(a)所述的基因组dna，从而基因组dna中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；(c)分析经步骤(b)处理的基因组dna中是否存在甲基化谱式异常。本发明的方法可用于：(i)对受试者样品进行检测，分析受试者是否患有肿瘤；(ii)区分肿瘤高危人群。所述的方法也可以是不以获得直接的疾病诊断结果为目的的情形。在本发明的优选实施例中，通过pcr扩增及焦磷酸测序法检测dna甲基化，本领域人员应理解，实际应用中并不限于该方法，其它dna甲基化检测方法亦可。在进行pcr扩增中，所应用的引物也不限于是实施例中所提供的。在本发明的优选实施例中，由于基因组dna经过重亚硫酸盐处理后，非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，在后续的pcr过程中又转换为胸腺嘧啶，会降低基因组的序列复杂度，使得pcr扩增出特异目标片段的难度增大。本发明人发现，采用巢式pcr扩增，设计外围与内围两对引物，进行两轮pcr扩增反应，以第一轮的扩增产物作为第二轮扩增的模板，可以有效提高扩增的效率与特异性。应理解，本发明中可用的检测方法并不限于此。经过针对临床样本的研究验证，本发明的方法用于诊断临床肿瘤时，准确性非常高，具有很高的临床应用价值。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、肿瘤标记物ctsm-4f一、检测序列描述本实施例中，提供ctsm-4f肿瘤标记物的序列，如seqidno:1所示，其中方框标示碱基为潜在甲基化cpg位点，最优检测区域为中间下划线区域。seqidno:1如下：二、检测步骤1、待测样本获取：选取临床组织样本，包括癌组织以及对应的癌旁对照组织。2、dna提取：通过常规的酚氯仿提取待测样本基因组dna。3、通过焦磷酸测序法检测dna甲基化，dna甲基化检测步骤如下：(1)重亚硫酸盐处理操作：取5～200ng前述提取获得的基因组dna进行重亚硫酸盐处理，本步骤中使用zymoresearch公司的methylation-goldtmkit试剂盒(货号d5006)，严格按照使用说明书进行处理，最终用20ul洗脱液洗脱，作为后续pcr扩增模板。(2)经过重亚硫酸盐处理后，获得seqidno:2，其中，y代表c(胞嘧啶)或t(胸腺嘧啶)。相应于seqidno:1，原存在甲基化修饰的胞嘧啶c不变，原非甲基化修饰的胞嘧啶转为t(u)，所以用y代表c或t。seqidno:2如下：在seqidno:2的基础上，根据巢式pcr以及焦磷酸测序特点，提供一组扩增引物以及测序引物，如表1(对应于seqidno:2中双下划线或字体加粗序列)：表1(3)巢式pcr扩增：使用的pcr扩增试剂为莱枫公司生产的2×pcrmastermix试剂，货号pt102，但不限于该试剂。第一轮pcr扩增体系：第一轮pcr扩增程序：第一轮pcr扩增结束后，以第一轮pcr扩增后的产物作为模板进行第二轮pcr扩增，体系如下：2×pcrmix13ulctsm-4f-f2(10um)0.5ulctsm-4f-r2(5’末端生物素修饰)(10um)0.5ul模板4ul双蒸水12ul第二轮扩增程序如下：(4)琼脂糖凝胶电泳：为了鉴定pcr扩增产物的特异性，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增产物长度应该为177bp。(5)焦磷酸测序：通过qiagen公司生产的焦磷酸测序仪，按照具体步骤操作，检测出目标区域每个cpg位点的甲基化值。(6)分析计算：通过本焦磷酸测序步骤共检测11个cpg位点的甲基化值，计算平均值作为样本在该区域的最终甲基化值。此处采用平均值法，其他计算方法如加和、中位数等亦可。三、结果分析通过分析样本甲基化值，可以有效区分肿瘤样本与对照样本，在对照组样本中，ctsm-4f处于低甲基化状态，在肿瘤样本中，ctsm-4f处于高甲基化状态。四、临床检测和分析1、直肠癌的检测和分析从获自医院的已确诊的直肠癌样本中，随机选取4例结直肠癌样本，并选取对应癌旁组织作为对照样本。应用前述步骤二～三的方法，获取上述样本中的dna，并进行重亚硫酸盐处理、巢式pcr、琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸测序及分析计算cpg位点的甲基化值。结果如图1，该结果显示，在对照样本中ctsm-4f的甲基化显著低于结直肠癌样本，ctsm-4f在结直肠癌中显著异常高甲基化，可以作为非常好的结直肠癌标记物。进一步扩大的临床样本呈现同样的显著性。2、肝癌的检测和分析从获自医院的已确诊的肝癌样本中，随机选取8例肝癌样本，并选取对应癌旁组织作为对照样本。应用前述步骤二～三的方法，获取上述样本中的dna，并进行重亚硫酸盐处理、巢式pcr、琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸测序及分析计算cpg位点的甲基化值。结果如图2，该结果显示，在对照样本中ctsm-4f的甲基化显著低于肝癌样本，ctsm-4f在肝癌中显著异常高甲基化，可以作为非常好的肝癌标记物。进一步扩大的临床样本呈现同样的显著性。3、头颈部肿瘤的检测和分析从获自医院的已确诊的头颈部肿瘤样本中，随机选取5例头颈部肿瘤样本，并选取对应癌旁组织作为对照样本。应用前述步骤二～三的方法，获取上述样本中的dna，并进行重亚硫酸盐处理、巢式pcr、琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸测序及分析计算cpg位点的甲基化值。结果如图3，该结果显示，在对照样本中ctsm-4f的甲基化显著低于头颈部肿瘤样本，ctsm-4f在头颈部肿瘤中显著异常高甲基化，可以作为非常好的头颈部肿瘤标记物。进一步扩大的临床样本呈现同样的显著性。4、肺癌的检测和分析从获自医院的已确诊的肺癌样本中，随机选取5例肺癌血浆样本作为实验组，并选取5例正常人血浆样本作为对照组。应用前述步骤二～三的方法，获取上述样本中的dna，并进行重亚硫酸盐处理、巢式pcr、琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸测序及分析计算cpg位点的甲基化值。结果如图4，该结果显示，在对照组样本中ctsm-4f的甲基化显著低于实验组，ctsm-4f在肺癌中显著异常高甲基化，可以作为非常好的肺癌标记物。进一步扩大的临床样本呈现同样的显著性。实施例2、肿瘤标记物ctsm-2be一、检测序列描述本实施例中，提供ctsm-2be肿瘤标记物的序列，如seqidno:3所示，其中方框标示碱基为潜在甲基化cpg位点。最优检测区域为中间下划线区域。seqidno:3如下：经过重亚硫酸盐处理后，获得seqidno:4，其中，y代表c(胞嘧啶)或t(胸腺嘧啶)。seqidno:4如下：在seqidno:4的基础上，根据巢式pcr以及焦磷酸测序特点，提供一组扩增引物以及测序引物，如表2。表2应用上述引物，采用如实施例1中相同的方法进行待测样本的dna提取，并进行重亚硫酸盐处理、巢式pcr扩增、琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸测序及分析计算cpg位点的甲基化值。二、临床检测和分析1、乳腺癌的检测和分析从获自医院的已确诊的乳腺癌样本中，随机选取8例乳腺癌样本，并选取对应癌旁组织作为对照样本。获取上述样本中的dna，并进行重亚硫酸盐处理、巢式pcr、琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸测序及分析计算cpg位点的甲基化值。结果如图5，该结果显示，在对照样本中ctsm-2be的甲基化显著低于乳腺癌样本，ctsm-2be在乳腺癌中显著异常高甲基化，可以作为非常好的乳腺癌标记物。进一步扩大的临床样本呈现同样的显著性。2、头颈部肿瘤的检测和分析从获自医院的已确诊的头颈部肿瘤样本中，随机选取6例头颈部肿瘤样本，并获取对应癌旁组织作为对照样本。获取上述样本中的dna，并进行重亚硫酸盐处理、巢式pcr、琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸测序及分析计算cpg位点的甲基化值。结果如图6，该结果显示，在对照样本中ctsm-2be的甲基化显著低于头颈部肿瘤样本，ctsm-2be在头颈部肿瘤中显著异常高甲基化，可以作为非常好的头颈部肿瘤标记物。进一步扩大的临床样本呈现同样的显著性。3、肺癌的检测和分析从获自医院的已确诊的肺癌样本中，随机选取8例肺癌样本，并获取对应癌旁组织作为对照样本。获取上述样本中的dna，并进行重亚硫酸盐处理、巢式pcr、琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸测序及分析计算cpg位点的甲基化值。结果如图7，该结果显示，在对照样本中ctsm-2be的甲基化显著低于肺癌样本，ctsm-2be在肺癌中显著异常高甲基化，可以作为非常好的肺癌标记物。进一步扩大的临床样本呈现同样的显著性。4、胰腺癌的检测和分析从获自医院的已确诊的胰腺癌样本中，随机选取8例胰腺癌样本，并获取对应癌旁组织作为对照样本。获取上述样本中的dna，并进行重亚硫酸盐处理、巢式pcr、琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸测序及分析计算cpg位点的甲基化值。结果如图8，该结果显示，在对照样本中ctsm-2be的甲基化显著低于胰腺癌样本，ctsm-2be在胰腺癌中显著异常高甲基化，可以作为非常好的胰腺癌标记物。进一步扩大的临床样本呈现同样的显著性。实施例3、肿瘤标记物ctsm-3c一、检测序列描述本实施例中，提供ctsm-3c肿瘤标记物的序列，如seqidno:5所示，其中方框标示碱基为潜在甲基化cpg位点。最优检测区域为中间下划线区域。seqidno:5如下：经过重亚硫酸盐处理后，获得seqidno:6，其中，y代表c(胞嘧啶)或t(胸腺嘧啶)：seqidno:6如下：在seqidno:6的基础上，根据巢式pcr以及焦磷酸测序特点，提供一组扩增引物以及测序引物，如表3。表3应用上述引物，采用如实施例1中相同的方法进行待测样本的dna提取，并进行重亚硫酸盐处理、巢式pcr扩增、琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸测序及分析计算cpg位点的甲基化值。二、临床检测和分析1、结直肠癌的检测和分析从获自医院的已确诊的结直肠癌样本中，随机选取9例结直肠癌样本，并选取对应癌旁组织作为对照样本。获取上述样本中的dna，并进行重亚硫酸盐处理、巢式pcr、琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸测序及分析计算cpg位点的甲基化值。结果如图9，该结果显示，在对照样本中ctsm-3c的甲基化显著低于结直肠癌样本，ctsm-3c在结直肠癌中显著异常高甲基化，可以作为非常好的结直肠癌标记物。进一步扩大的临床样本呈现同样的显著性。2、头颈部癌的检测和分析从获自医院的已确诊的头颈部癌样本中，随机选取5例头颈部癌样本，并选取对应癌旁组织作为对照样本。获取上述样本中的dna，并进行重亚硫酸盐处理、巢式pcr、琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸测序及分析计算cpg位点的甲基化值。结果如图10，该结果显示，在对照样本中ctsm-3c的甲基化显著低于头颈部癌样本，ctsm-3c在头颈部癌中显著异常高甲基化，可以作为非常好的头颈部癌标记物。进一步扩大的临床样本呈现同样的显著性。3、肺癌的检测和分析从获自医院的已确诊的肺癌样本中，随机选取6例肺癌样本，并选取对应癌旁组织作为对照样本。获取上述样本中的dna，并进行重亚硫酸盐处理、巢式pcr、琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸测序及分析计算cpg位点的甲基化值。结果如图11，该结果显示，在对照样本中ctsm-3c的甲基化显著低于肺癌样本，ctsm-3c在肺癌中显著异常高甲基化，可以作为非常好的肺癌标记物。进一步扩大的临床样本呈现同样的显著性。实施例4、肿瘤标记物ctsm-4i一、检测序列描述本实施例中，提供ctsm-4i肿瘤标记物的序列，如seqidno:7所示，其中方框标示碱基为潜在甲基化cpg位点。最优检测区域为中间下划线区域。seqidno:7如下：经过重亚硫酸盐处理后，获得seqidno:8，其中，y代表c(胞嘧啶)或t(胸腺嘧啶)：seqidno:8如下：在seqidno:8的基础上，根据巢式pcr以及焦磷酸测序特点，提供一组扩增引物以及测序引物，如表4。表4二、临床检测和分析1、乳腺癌的检测和分析从获自医院的已确诊的乳腺癌样本中，随机选取4例乳腺癌样本，并选取对应癌旁组织作为对照样本。获取上述样本中的dna，并进行重亚硫酸盐处理、巢式pcr、琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸测序及分析计算cpg位点的甲基化值。结果如图12，该结果显示，在对照样本中ctsm-4i的甲基化显著低于乳腺癌样本，ctsm-4i在肺癌中显著异常高甲基化，可以作为非常好的乳腺癌标记物。2、结直肠癌的检测和分析从获自医院的已确诊的结直肠癌样本中，随机选取5例结直肠癌样本，并选取对应癌旁组织作为对照样本。获取上述样本中的dna，并进行重亚硫酸盐处理、巢式pcr、琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸测序及分析计算cpg位点的甲基化值。结果如图13，该结果显示，在对照样本中ctsm-4i的甲基化显著低于结直肠癌样本，ctsm-4i在结直肠癌中显著异常高甲基化，可以作为非常好的结直肠癌标记物。3、头颈部癌的检测和分析从获自医院的已确诊的头颈部癌样本中，随机选取6例头颈部癌样本，并选取对应癌旁组织作为对照样本。获取上述样本中的dna，并进行重亚硫酸盐处理、巢式pcr、琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸测序及分析计算cpg位点的甲基化值。结果如图14，该结果显示，在对照样本中ctsm-4i的甲基化显著低于头颈部癌样本，ctsm-4i在头颈部癌中显著异常高甲基化，可以作为非常好的头颈部癌标记物。进一步扩大的临床样本呈现同样的显著性。4、肺癌的检测和分析从获自医院的已确诊的肺癌样本中，随机选取7例肺癌样本，并选取对应癌旁组织作为对照样本。获取上述样本中的dna，并进行重亚硫酸盐处理、巢式pcr、琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸测序及分析计算cpg位点的甲基化值。结果如图15，该结果显示，在对照样本中ctsm-4i的甲基化显著低于肺癌样本，ctsm-4i在肺癌中显著异常高甲基化，可以作为非常好的肺癌标记物。进一步扩大的临床样本呈现同样的显著性。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>上海市公共卫生临床中心<120>诊断肿瘤的dna甲基化相关的标记物及其应用<130>183361<160>21<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>699<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>1cgcccagtaagttacggaaaaggcggagacagaggtttcgttcccgcccctccaattcag60tctccaaaaaggtccgcataattgatatataaggggcttcagtgtgtagcaaagttgcaa120aagttaagagttgttgtttgtcttcgatcatgtctggtagaggcaaaggtggtaaaggtt180taggaaagggaggcgccaagcgccatcgcaaagtgctgcgtgacaacatacagggcatca240cgaagcccgccatccgtcgcttggcccgacgcggcggcgtgaaacgcatttcgggcctca300tttatgaggagacccgcggtgttcttaaggtgttcctggagaatgtgatacgggacgccg360taacctacacggagcacgccaagcgtaagacagtcactgcaatggatgttgtctacgcgc420tcaagcgccagggacgcactctgtacggctttggtggctgagcctcaccccggcttttta480tttaacagctcacccataaaaggcccttttcagggccacctccttcgtcacacgaagggc540tgtaactgatgacgacttgggtttcgttttgtaaatttgggattctaactgagttaaacc600gagccgtttttagcgatcttcctaagatggcggatgtgctaaggagaaagggaaggcgaa660acattagaaacttgttcaggtatttcgatcgcaaacatt699<210>2<211>699<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(1)..(699)<223>重亚硫酸盐处理的序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(699)<223>yiscort<400>2ygtttagtaagttayggaaaaggyggagatagaggtttygttttygtttttttaatttag60tttttaaaaaggttygtataattgatatataaggggttttagtgtgtagtaaagttgtaa120aagttaagagttgttgtttgttttygattatgtttggtagaggtaaaggtggtaaaggtt180taggaaagggaggygttaagygttatygtaaagtgttgygtgataatatatagggtatta240ygaagttygttattygtygtttggttygaygyggyggygtgaaaygtatttygggtttta300tttatgaggagattygyggtgtttttaaggtgtttttggagaatgtgataygggaygtyg360taatttatayggagtaygttaagygtaagatagttattgtaatggatgttgtttaygygt420ttaagygttagggaygtattttgtayggttttggtggttgagttttatttyggtttttta480tttaatagtttatttataaaaggttttttttagggttatttttttygttataygaagggt540tgtaattgatgaygatttgggtttygttttgtaaatttgggattttaattgagttaaaty600gagtygtttttagygatttttttaagatggyggatgtgttaaggagaaagggaaggygaa660atattagaaatttgtttaggtatttygatygtaaatatt699<210>3<211>624<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>3agctgtttgttaaataggctttcattttaattttttaaaaaatattttcactagttagac60ggaatatttatttctgatcctcgttgtagggctaaactaggtgtgacttgcttttccatt120aaggactgtagccattttggctaagaaagtctttcctgtcttagctctcttcaagagatg180ctatttacttttttgttgttgttttctccggagctttattgcctaccctttattttcacg240atgtgtttgtgcattctgtaaaaagtgggaaacactgttctccggattgtgtgggtgatc300gccggtcgcctagcttgccgttcttcaggtatctcctgctgctccagaatctacatctga360atgtcaaggcatagcttttccaggagcttttaaaccgacctttcaattcgaagacgtaac420tgcgccaggagctttgtctccctggcatataaaagcatagaagagagcaacttctggttt480ttaaaataagtaaactaatctgaattgtttgcaatggtaggaacttgttatataaaatgt540taattaggtggcccgtgctcgaaaactgctctcaggatatgaccaatgggagagtagacc600taagctccttcatttgcatgcaga624<210>4<211>624<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(1)..(624)<223>重亚硫酸盐处理的序列<220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