本发明涉及一种dna分子鉴定方法，特别涉及中药绿丝郁金pcr鉴定试剂盒、特异性引物、模板及鉴定方法。
(二)
背景技术：
绿丝郁金为蓬莪术(curcumaphaeocaulisval.)的干燥块茎，地道产地为四川的崇州。郁金的其他品种还包括温郁金、黄丝郁金、桂郁金。郁金是一种传统中药，具有活血祛瘀的功效，用于治疗经闭痛经、胸腹胀痛、黄胆尿赤、癫痫发狂等疾病。近代研究表明郁金可以调节免疫功能、抗炎、抑制中枢神经、改善血液流动性等作用，亦可用于治疗癌症、胃炎、心脑血管疾病。不同的郁金品种，其有效成分和药效差别较大。由于郁金品种较多，来源多样，外观形态类似，单靠外形和传统中药检测方法较难区别，急需建立一种新型的鉴定方法。
本发明提供的pcr检测法是一种绿丝郁金的dna分子鉴定方法，能够准确鉴定绿丝郁金。利用pcr检测法对绿丝郁金进行鉴定尚未见报道。该方法的建立对实现中药现代化，规范管理郁金的种植，采摘和销售，具有重要意义。
(三)
技术实现要素：
本发明目的是提供一种能够准确鉴定中药绿丝郁金的pcr鉴定试剂盒和检测方法，包括pcr检测法关键试剂pcr引物、模板和pcr检测法的检测步骤。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种绿丝郁金pcr鉴定试剂盒，所述试剂盒中的特异性引物为lsy1和lsy2：
lsy1:5’-cctgagtgaggacttgtacg-3’
lsy2:5’-cgatgctaagggcacagcta-3’。
进一步，所述的绿丝郁金pcr鉴定试剂盒的组成为：
本发明还涉及一种利用所述绿丝郁金pcr鉴定试剂盒对绿丝郁金进行鉴定的方法，所述方法为：
(1)模板dna的提取和质量鉴定：采用常规提取法提取供试品dna作为pcr的模板；以电泳法检测模板dna的质量(检测方法同步骤(3))，条带清晰无弥散的，即为符合pcr反应的模板dna；
(2)pcr鉴定：利用绿丝郁金pcr鉴定试剂盒中的特异性引物lsy1和lsy2，进行pcr扩增：
pcr反应溶液：
将pcr反应溶液放入pcr自动扩增仪器中进行pcr扩增反应，反应程序设置为：94℃预变性5min，94℃变性45s，58～64℃复性45s，72℃延伸1min，32个循环，最后72℃延伸10min；
(3)pcr产物进行电泳检测：取出pcr扩增产物(即扩增反应后的反应液)5μl与加样缓冲液1μl混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭)检测扩增结果，在869bp处出现扩增条带的为绿丝郁金，在869bp处不出现扩增条带的不是绿丝郁金。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明根据凝胶电泳在869bp处有无扩增条带作为鉴定绿丝郁金的依据，可以检测单个或者混合绿丝郁金dna样品，检测准确、灵敏度高、操作简单、耗时短、重复性好；(2)利用绿丝郁金pcr鉴定试剂盒中引物lsy1和lsy2以及pcr反应溶液配方可以制造绿丝郁金鉴定试剂盒；(3)本发明提供了一种快速、准确鉴定绿丝郁金的方法，可以广泛应用于绿丝郁金中药选种育种、种植、采收储存、销售、临床应用各环节的品种鉴定，在鉴别中药真伪，打击伪品，加强中药质量监管，促进中药现代化发展方面具有重大意义。
(四)附图说明
图1为11种供试品经pcr检测法鉴定后的电泳图，泳道1～11分别为温郁金(浙江瑞安)、温郁金(浙江永嘉)、黄丝郁金(四川崇州)、黄丝郁金(四川双流)、绿丝郁金、桂郁金、生姜、海南三七、草果、浙白芍、安白术，泳道m为marker。
图2为不同浓度的绿丝郁金经pcr检测法鉴定后的电泳图，泳道m为marker，泳道1的绿丝郁金浓度为2ng/μl，泳道2的绿丝郁金浓度为4ng/μl，泳道3的绿丝郁金浓度为8ng/μl，泳道4的绿丝郁金浓度为20ng/μl。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所用温郁金(浙江瑞安)、温郁金(浙江永嘉)、黄丝郁金(四川崇州)、黄丝郁金(四川双流)、绿丝郁金、桂郁金、生姜、海南三七、草果、浙白芍、安白术均按照《中国药典》2010版采集制备。
实施例1
1、绿丝郁金pcr检测法关键试剂pcr引物的获得
应用植物dna快速提取试剂盒方法从温郁金、黄丝郁金、绿丝郁金和桂郁金中分别提取基因组dna。使用rapd扩增法对四种郁金进行rapd分析，筛选获得一条绿丝郁金特异性扩增条带，这条特异性扩增条带只出现在绿丝郁金品种中，在其他郁金品种中没有，此条带中的dna分子即是绿丝郁金特异性dna分子标记。将绿丝郁金特异性dna分子标记从琼脂糖凝胶中回收、克隆、测序，测序结果见seqidno.1所示，命名为lsy888。
根据lsy888序列，设计一对特异性引物lsy1和lsy2，引物序列为
lsy1:5’-cctgagtgaggacttgtacg-3’
lsy2:5’-cgatgctaagggcacagcta-3’
上下游引物选取的位点分别对应于lsy888序列位点上的9-28bp和858-877bp处。
seqidno.1为：
5’-atggtggacctgagtgaggacttgtacgaatcctatatcaaggtatgtcgctttgcattggggggtatttctacaattctgtaagttaactgaatttcatgtctcgtagatcggtatagaacagaaagccttgcaccgtcaagtggttaggtcggagaaacacatagcccggatggacaacgagataacttatttgcgagcggagctggctgaccgacttcccatgcctcaaggtttgtctgaagctttgagggatgtggacttagctcgggccgaggtgatggtggctcaaagtgctcagtcaaaagcagtggaggaggttgaaaattggaaggcgaaagttcaggaattgtataacactgagagactacatcgagactcctacttgcaagcggagcgtttgtcagctcaacgggagaccgagatagttgaagttagggatcaggttcaacggttgaaggctgactttgataaggaacgtgaacattgggctcaacagttatcagaagcccgtgctaaagaagaacaactcatctctgagctcaatgcggctcaagtggagatggaggatatgtagacgagggaggaggctcggtttgcggaacgccactagaccttcctttcttcacccgatttttaccacttggttgccctaagtgcaggtaaaatgatggaatatgattttgatgatgccattctccaattcatgaggtcgggcttgatcgctcgagatgccgacctcaagttttttgatttaaaggtcgcctggaatgctctacctgaggccgttcgacaagattttcctatctccgaagagattgcttaacctgaggctttggttgctgcagttagccagttagctgtgcccttagcatcggcccgatctcc-3’
2、绿丝郁金的pcr检测法
(1)采用常规提取法提取供试品dna作为pcr的模板；以电泳法(同步骤(3))检测模板dna的质量，条带清晰无弥散的，即为符合pcr反应的模板dna；
(2)按照lsy1和lsy2的序列用体外合成仪合成引物lsy1和lsy2。以lsy1和lsy2为引物进行pcr扩增。
按照下述配方配置pcr反应溶液：
将pcr反应溶液放入pcr自动扩增仪器中进行pcr扩增反应，反应程序设置为：
94℃预变性5min，94℃变性45s，58～64℃复性45s，72℃延伸1min，32个循环，最后72℃延伸10min；
(3)pcr产物进行电泳检测：取出pcr扩增后的反应液5μl与加样缓冲液1μl混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭)检测扩增结果，在869bp处出现扩增条带的样品为绿丝郁金，在869bp处不出现条带的样品不是绿丝郁金。
实施例2：
1、绿丝郁金pcr检测法的准确性研究
从温郁金(浙江瑞安)、温郁金(浙江永嘉)、黄丝郁金(四川崇州)、黄丝郁金(四川双流)、绿丝郁金、桂郁金、生姜、海南三七、草果、浙白芍、安白术植物中提取基因组dna。以上述11份材料基因组dna为模板，利用特异性引物“lsy1/lsy2”进行pcr扩增，pcr反应液、扩增程序、检测方法同实施例1，只是更换dna模板，以验证绿丝郁金pcr检测法的准确性和可靠性，结果见图1所示，泳道1～11分别分别为温郁金(浙江瑞安)、温郁金(浙江永嘉)、黄丝郁金(四川崇州)、黄丝郁金(四川双流)、绿丝郁金、桂郁金、生姜、海南三七、草果、浙白芍、安白术，泳道m为marker。
图1表明，绿丝郁金在869bp处具有特异性的扩增条带，而其他品种没有。本发明的绿丝郁金pcr检测法经实验证明可以用于绿丝郁金的鉴定，方法准确性高，简单、效率高、重复性好。
2、绿丝郁金pcr检测法的灵敏度研究
将绿丝郁金模板dna浓度(40ng/μl)经四个梯度进行稀释，配置四份不同浓度的绿丝郁金基因组dna溶液：一份浓度为稀释一倍，即20ng/μl；一份浓度稀释为原始浓度的五分之一，即8ng/μl；一份浓度稀释为原始浓度的十分之一，即4ng/μl；一份浓度稀释为原始浓度的二十分之一，即2ng/μl。
分别以这四种不同浓度的绿丝郁金基因组dna作为模板(1.0μl)，以“lsy1/lsy2”为引物进行pcr扩增，pcr反应液、扩增程序、检测方法同实施例1，以验证绿丝郁金pcr检测法的灵敏度，结果见图2所示，泳道m为marker，泳道1为2ng/μl，泳道2为4ng/μl，泳道3为8ng/μl，泳道4为20ng/μl。
结果显示当绿丝郁金模板基因组dna浓度仅为8ng/μl时，在869bp处依然出现绿丝郁金的特异性条带，经过多次重复验证，结果保持稳定，证明本发明提供的绿丝郁金pcr检测法灵敏度很高，含量较微弱的绿丝郁金也能够鉴定出来。
序列表
<110>浙江工业大学
<120>绿丝郁金pcr鉴定试剂盒及鉴定方法
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>887
<212>dna
<213>蓬莪术(curcumaphaeocaulisval.)
<400>1
atggtggacctgagtgaggacttgtacgaatcctatatcaaggtatgtcgctttgcattg60
gggggtatttctacaattctgtaagttaactgaatttcatgtctcgtagatcggtataga120
acagaaagccttgcaccgtcaagtggttaggtcggagaaacacatagcccggatggacaa180
cgagataacttatttgcgagcggagctggctgaccgacttcccatgcctcaaggtttgtc240
tgaagctttgagggatgtggacttagctcgggccgaggtgatggtggctcaaagtgctca300
gtcaaaagcagtggaggaggttgaaaattggaaggcgaaagttcaggaattgtataacac360
tgagagactacatcgagactcctacttgcaagcggagcgtttgtcagctcaacgggagac420
cgagatagttgaagttagggatcaggttcaacggttgaaggctgactttgataaggaacg480
tgaacattgggctcaacagttatcagaagcccgtgctaaagaagaacaactcatctctga540
gctcaatgcggctcaagtggagatggaggatatgtagacgagggaggaggctcggtttgc600
ggaacgccactagaccttcctttcttcacccgatttttaccacttggttgccctaagtgc660
aggtaaaatgatggaatatgattttgatgatgccattctccaattcatgaggtcgggctt720
gatcgctcgagatgccgacctcaagtttttgatttaaaggtcgcctggaatgctctacct780
gaggccgttcgacaagattttcctatctccgaagagattgcttaacctgaggctttggtt840
gctgcagttagccagttagctgtgcccttagcatcggcccgatctcc887
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>未知(unknown)
<400>2
cctgagtgaggacttgtacg20
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>未知(unknown)
<400>3
cgatgctaagggcacagcta20