本发明涉及一种用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重pcr微卫星标记及其应用，属于动物分子遗传学领域。
背景技术：
中华鲟是全世界20余种鲟科鱼类中分布纬度最低，体型最大的鱼，为我国特有的的物种。上世纪70年代，长江里的繁殖群体能达到1万余尾，由于环境污染、过度捕捞、栖息地丧失等诸多因素中华鲟已濒临灭绝。对濒危物种的保护不仅保护濒危物种的个体而且对濒危物种的基因也有进行了解和保护，进而制定良好的育种政策，防止近亲繁殖。但是直至今日对中华鲟的遗传性研究十分有限，急需从分子方向对中华鲟进行研究。
微卫星标记是目前研究濒危动物保护遗传学中最理想的一类方式，微卫星具有多态性高、共显性遗传、遍布整个基因组等优势，广泛应用于动物遗传性研究。微卫星标记多重pcr是在同一pcr反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的pcr反应。多重pcr具有高效性、系统性、经济简便性等优点。有关中华鲟的微卫星标记多重pcr国内外未见报道。本发明利用5组中华鲟微卫星标记的双重pcr反应体系实现了对中华鲟个体之间的亲缘关系的测量进而确定个体之间的亲缘关系，为中华鲟的遗传管理、人工繁殖配种制定、遗传背景分析提供了坚实的技术支持。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重pcr微卫星标记及其在鉴定个体之间亲缘关系的应用方法。
技术方案
用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重pcr微卫星标记及其应用的双重pcr微卫星标记引物如下：
用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重pcr微卫星标记及其应用，其步骤为：取中华鲟组织样品；提取中华鲟样品dna；利用所示的微卫星位点对中华鲟样品进行pcr扩增；把pcr扩增产物在10％的聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离；根据分离结果统计pcr扩增产物的基因型；根据各个个体的基因分型结果用ntsys软件画出各个个体之间的聚类分析图，确定个体之间的亲缘关系。
所述的pcr反应体系是25ul：10×pcrbuffer2-3ul，2.5mmol/ldntp0.1-1ul，mgcl21-2ul，反应体系中两对引物的上下游引物各0.5-1.5ul，taq酶0.1-0.5ul，dna模板1-5ul，超纯水10-15ul。
所述的pcr反应体系是25ul：10×pcrbuffer2.5ul，2.5mmol/ldntp0.5ul，mgcl21.5ul，反应体系中两对引物的上下游引物各1ul，taq酶0.3ul，dna模板3ul，超纯水13.2ul。
所述的pcr反应程序为：94℃预变性2-5min；94℃变性15-45s，退火温度56℃复性15-45s，72℃延伸15-45s，15-45个循环；72℃延伸8-15min；4℃保存。
所述的pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度56℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
所述的pcr产物用质量浓度为8-15％的非变性聚丙烯酰胺胶进行电泳。
与现有技术相比，本发明具有以下的优点：
利用本发明提供的用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重pcr微卫星标记及其应用可以实现对中华鲟的遗传多样性检测、个体识别，还可以计算个体之间的亲缘关系的远近，避免个体之间产生近亲繁殖，这为中华鲟的选育工作提供了重要的研究基础。并且本发明所提供的双重pcr微卫星标记消耗的财力和人力都比传统的pcr减少了一半，具有巨大的推广价值。
附图说明
图1为个体之间的亲缘关系分析图。
具体实施方式
实施例1
从中国长江三峡集团公司中华鲟研究所取48尾中华鲟，采集中华鲟的鳍条，提取中华鲟的基因组dna，提取方式采取传统的酚-氯仿抽提途径。
每个个体取0.1g尾鳍放于1.5ml的离心管内，剪碎，加入450μlste抽提缓冲液(10mmol/ltris-hcl，ph8.0；1mmol/ledta，ph8.0)、35μlsds(10％)、15μl蛋白酶k(0.2％)。
将离心管放入放在55℃的水浴锅内水浴1个小时至澄清透明。
在离心管内加入700ultris饱和酚，放在震荡机上混匀30分钟，4℃下12000转/min离心10min，将上清液转移入另一个干净的eppendorf管中(注意用尖端剪平的1ml管头吸取上清液，以防混淆下层沉淀)。
在上清液中加入等体积酚仿醇混合物(酚、氯仿、异戊醇比例为25：24：1)，振荡混匀15min后，4℃下12000转/min离心10min，吸上清液于另一新eppendorf管中。
上清液中加入等体积氯仿，振荡混匀15min后,4℃下12000转/min离10min，吸取上清液。
加入-20℃预冷的无水乙醇1ml沉淀dna，收集沉淀。
用70％乙醇洗涤沉淀两次，干燥后加入200μlte(10mmol/ltris-hcl，ph8.0；0.1mmol/ledta，ph8.0)，室温充分溶解。
利用本发明提供的5组中华鲟微卫星标记的双重pcr反应体系中的微卫星引物对这184个中华鲟个体的dna进行pcr反应，pcr反应体系是25ul：10×pcrbuffer2.5ul，2.5mmol/ldntp0.5ul，mgcl21.5ul，每组反应体系两对引物的上下游引物各1ul，taq酶0.3ul，dna模板3ul，超纯水13.2ul。pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。pcr产物用10％的聚丙烯酰胺胶进行电泳和银染。
所述的5组中华鲟微卫星标记的双重pcr反应体系中的微卫星引物对如下：
用软件bio-profil判断聚丙烯酰胺胶显示的各个个体的等位基因片段的大小，根据这48个个体在5组双重pcr体系中的等位基因大小，用ntsys软件画出各个个体之间的亲缘关系分析图，如下图1所示。根据聚类分析结果可以判断各个个体之间的亲缘关系，鉴别出全部的中华鲟个体，从而确定每条中华鲟之间的亲缘关系。从图1可得出，第1、3、14、43、32、34、35、37、27和41号个体为一个家系，亲缘关系比较近，他们之间不宜配对繁殖。第4、30、8和33号个体为一个家系，亲缘关系比较近，他们之间不宜配对繁殖。其余个体为一个家系，亲缘关系比较近，他们之间不宜配对繁殖。
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<110>中国长江三峡集团公司中华鲟研究所
<120>用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重pcr微卫星标记及其应用
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