本发明涉及分子生物学与植物病毒检测
技术领域：
，特别涉及一种检测蟹爪兰x病毒所用pcr引物对、检测方法及其应用。技术背景火龙果(hylocereusundatusbritt.)作为一种典型的热带水果植物，属仙人掌科(cactaceae)三角柱属(hylocereus),近年来在我国南方各省发展迅速。上世纪90年代后期，大陆地区陆续开始引进火龙果种植，到2017年，我国火龙果种植面积约55万亩，其中贵州种植面积13.02万亩，为国内最大种植省。由于火龙果的繁殖方式主要为扦插繁殖，使得病毒病得以加速传播，贵州作为国内火龙果种植面积最大的地区，近年来调查发现，在田间病毒病感染症状明显，枝条表现斑驳黄化褪绿、花叶、畸形等各种症状，植株长势也逐渐衰退。在侵染火龙果的病毒病当中，蟹爪兰x病毒是火龙果上较为常见的一种，导致火龙果产量下降和品质变劣。然而，针对该病害，目前国内尚缺少较为有效的治疗措施，要控制病情扩散，首要任务是保障苗木无毒安全，而对于该病毒，国内报道较少，亦未建立完整的检测体系。技术实现要素：本发明的目的是提供一种检测蟹爪兰x病毒所用pcr引物对、检测方法及其应用，填补了国内在该领域的空缺，同时也能在生产上普遍运用。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：首先，本发明提出了一种检测蟹爪兰x病毒所用pcr引物对，该引物对包括上游引物schvxcp-f：5’-ggtcatcaccggaaactgt-3’，下游引物schvxcp-r：5’-ctttgggctttcagatcctt-3’。其次，本发明提出了采用该pcr引物对检测蟹爪兰x病毒的方法，该方法包括如下步骤：步骤1.提取待检火龙果样品的总rna；步骤2.逆转录；步骤3.pcr扩增。其中，步骤3中pcr反应体系配制如下：25μl扩增反应体系如下：10×pcr缓冲液，2.5μl；25mmol/lmgcl2，1.5μl；2.5mmol/ldntp，2.0μl；上游引物schvxcp-f，2.0μl；下游引物schvxcp-r，2.0μl；模板cdna(1ng/μl)，2.0μl；taqdna聚合酶，0.2μl；无rna酶去离子水，12.8μl。pcr反应条件如下：在pcr热循环仪上设置程序，按程序设置的条件进行扩增：1)94℃预变性5min；2)94℃变性40sec；3)55℃退火50sec；4)72℃延伸50s；循环步骤2)～4)30次；5)72℃延伸8min。进一步的，对步骤3中pcr反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，与阳性对照相比，若待检样品的扩增条带长度与阳性对照一致，则待检样品呈阳性，表明样品中含有蟹爪兰x病毒。更进一步的，将步骤3中待检样品的pcr扩增产物直接连于pmd18-t载体，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆进行菌液pcr初步鉴定，对鉴定为阳性的菌株进一步测序，依据测序结果进行比对，确定是否感染蟹爪兰x病毒。最后，本发明还提出了该pcr引物对在检测火龙果、仙人掌及蟹爪兰是否存在蟹爪兰x病毒的侵染中的应用。本发明的技术方案可以解决蟹爪兰x病毒的检测问题，从而为该病毒的防治提供技术依据。本发明所提供的pcr引物具有一定的schvx检测通用性，不仅可以检测火龙果上的schvx病毒，还可以检测仙人掌、蟹爪兰中的schvx病毒。经应用表明，该检测方法具有较高检测灵敏度，且操作较为简单。附图说明图1是rna电泳图；图2是schvx检测结果图；图3是待检样品检测结果图。具体实施方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。参照图1-图3：本发明采取的详细技术方案如下：检测蟹爪兰x病毒所用pcr引物对，包括上游引物schvxcp-f：5’-ggtcatcaccggaaactgt-3’，下游引物schvxcp-r：5’-ctttgggctttcagatcctt-3’。该pcr引物对能在检测火龙果、仙人掌、蟹爪兰是否存在蟹爪兰x病毒的侵染中得到应用。具体检测方法步骤如下：1.提取待检火龙果样品的总rna，采用宝生物工程(大连)有限公司(货号9769)植物柱式rna提取试剂盒，按照试剂盒提供方法操作，提取总rna；2.逆转录采用宝生物工程(大连)有限公司(货号6110a)试剂盒,按照试剂盒提供方法操作：rt引物50um1uldntpmix(10mmeach)1ul总rna8ul65℃保温5min，冰上迅速冷却。按照下表配制20ul的反应液。上述变性后反应液10ul5xprimescriptbuffer4ulrnaseinhibitor(40u)0.5ul(20u)primescriptrtase(200u/ul)1ul(200u)无rna酶去离子水upto20ul混匀；按下列条件进行反转录反应：42℃，60min；95℃保温5min；冰上放置。同样操作，设置阳性对照，所述阳性对照为受蟹爪兰x病毒感染的火龙果样品。3.pcr扩增(1)pcr反应体系配制如下：25μl扩增反应体系如下：10×pcr缓冲液，2.5μl；25mmol/lmgcl2，1.5μl；2.5mmol/ldntp，2.0μl；上游引物schvxcp-f，2.0μl；下游引物schvxcp-r，2.0μl；模板cdna(1ng/μl)，2.0μl(总rna以质量用量计，1μg)；taqdna聚合酶，0.2μl；无rna酶去离子水，12.8μl。(2)pcr反应条件在pcr热循环仪上设置程序，按程序设置的条件进行扩增：1)94℃预变性5min；2)94℃变性40sec；3)55℃退火50sec；4)72℃延伸50s；循环步骤2)～4)30次；5)72℃延伸8min。4.对步骤3中pcr反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，与阳性对照相比，若待检样品的扩增条带的长度为400bp左右，与阳性对照一致，则待检样品呈阳性，表明样品中含有蟹爪兰x病毒；5.为进一步确定是否受蟹爪兰x病毒侵染，优选情况下，可将步骤3中待检样品的pcr扩增产物直接连于pmd18-t载体，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆进行菌液pcr初步鉴定，对鉴定为阳性的菌株进一步测序，依据测序结果进行比对，确定是否感染蟹爪兰x病毒。以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。序列表<110>贵州省果树科学研究所<120>检测蟹爪兰x病毒所用pcr引物对、检测方法及其应用<130>nm:<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>rna<213>蟹爪兰(zygocactustruncatushaw.k.schum.)<400>1ggtcatcaccggaaactgt19<210>2<211>20<212>rna<213>蟹爪兰(zygocactustruncatushaw.k.schum.)<400>2ctttgggctttcagatcctt20当前第1页12