本发明属于动物病毒学和分子生物学技术领域，具体为针对猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型一步法三重pcr的检测引物组、检测试剂盒及应用。
背景技术
猪圆环病毒（porcinecircovirus，pcv）为一种共价闭合、单股环状dna病毒，是迄今发现最小动物病毒。2015年前，全球范围内仅发现pcv1和pcv2两个基因型。其中，pcv1被认为是猪肾细胞pk-15污染物，但不产生细胞病变效应，对猪无致病性。pcv2能引起猪圆环病毒相关疾病（pcvad），主要有断奶仔猪多系统衰竭综合征（pmws）、猪皮炎和肾病综合征（pdns）、猪呼吸道疾病综合征（prdc）、繁殖障碍、增生性坏死性肺炎（pnp）和肠炎等。临床上pcv2常与猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪细小病毒(ppv)和猪肺炎支原体(m.hyo)等病原体混合感染。同时，感染pcv2后还容易继发细菌感染，给养猪业造成巨大经济损失。近年来pcv2流行毒株由pcv2a向pcv2b，继而向pcv2d的转变，病毒的致病力逐渐变强，对养猪业的危害加重。
2015年6月，美国北卡罗来纳州某商品化猪场暴发pdns疫情。患病母猪厌食、皮肤呈现多灶性丘疹、斑点和浅表性皮炎，所产胎儿(包括弱胎、死胎、木乃伊胎)具有相似临床症状。palinski等借助新一代测序(ngs)技术，从患病母猪及流产胎儿体内首次鉴定出一种新病毒，该病毒与圆环病毒科病毒具有类似基因组结构和遗传相似性，但与其他圆环病毒衣壳蛋自氨基酸序列同源性低于70%，根据国际病毒分类委员会(ictv)圆环病毒分类标准圈，将其归类为一种新型圆环病毒，命名为pcv3。作为新动物病原体，pcv3对猪致病性和在pcvad中作用以及现有商品化pcv2疫苗对其免疫效果等有待进一步研究。目前已有pcv3在美国、韩国、巴西、意大利、波兰以及中国的华南、华中和华北多省市流行。
自20世纪90年代以来，pcv2便一直威胁着养猪业的发展，且近年来pcv2逐渐呈现出多亚型共同流行的趋势，使pcv2防控更加困难。同时，pcv3的出现使猪圆环病毒病更加复杂化。pcv1虽然不产生病变,但广泛存在于猪体内及猪的传代细胞中，其存在可能会影响pcv2和pcv3的增殖及致病性。因此，研究建立一种特异、快速的pcv1/2/3多重pcr检测方法，了解pcv1/2/3的流行情况，从而有效防控猪圆环病毒病的发生与流行，具有重要现实意义。
技术实现要素：
本发明的目的是解决上述技术问题，提供一种快速区分pcv1、pcv2和pcv3的多重pcr检测引物组及试剂盒，该试剂盒能够快速区分pcv1、pcv2和pcv3，灵敏感高、特异性强，从而有效防控猪圆环病毒病的发生和流行。为实现本发明目的所使用的技术方案为：
一种快速区分pcv1、pcv2和pcv3的多重pcr检测引物组，所述多重pcr检测引物组包括pcv1检测引物组、pcv2检测引物组和pcv3检测引物组；
所述pcv1检测引物组由具有seqidno:1所示核苷酸序列的上游引物和具有seqidno:2所示核苷酸序列的下游引物组成；
所述pcv2检测引物组由具有seqidno:3所示核苷酸序列的上游引物和具有seqidno:4所示核苷酸序列的下游引物组成；
所述pcv3检测引物组由具有seqidno:5所示核苷酸序列的上游引物和具有seqidno:6所示核苷酸序列的下游引物组成。
优选的，所述pcv1检测引物组是依据pcv1的全基因保守区域进行设计，扩增的目的片段大小为409bp；所述pcv2检测引物组是依据pcv2的全基因保守区域进行设计，扩增的目的片段大小为1173bp；所述pcv3检测引物组是依据pcv3的全基因保守区域进行设计，扩增的目的片段大小为669bp。
优选的，所述多重pcr检测引物组的退火温度为56.1℃。
优选的，所述多重pcr检测引物组在制备猪圆环病毒分型检测试剂盒的应用。
本发明提供一种如以上所述快速区分pcv1、pcv2和pcv3的多重pcr检测试剂盒，包括具有seqidno:1、seqidno:3和seqidno:5所示核苷酸序列的上游引物以及具有seqidno:2、seqidno:4和seqidno:6所示核苷酸序列的下游引物。
优选的，还包括2×f8fastlongpcrmastermix、cdna模板和灭菌水。
优选的，所述的多重pcr检测试剂盒中pcr反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性10s，56.1℃复性10s，72℃延伸10s，30个循环；最后72℃延伸3min。
优选的，所述pcr检测试剂盒的seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6所示引物使用浓度为25μmol/l。
本发明的有益效果为：
本发明提供的pcv1、pcv2和pcv3的多重pcr检测试剂盒采用多重pcr扩增，三种病变相似且同为dna病毒的病毒一次检测，检测总时间控制在2小时左右，其检测方法易于操作、方便快捷，能达到快速检测的目的。本发明能彻底解决pcv1、pcv2和pcv3引起的类似症状但病原不同的诊断问题，适合猪场快速检测，亦适用于流行病学调查。
本发明提供了三对针对pcv1、pcv2和pcv3的特异性引物组，pcv1-p1/pcv1-p2为猪圆环病毒1型特异性扩增引物组，pcv2-p1/pcv2-p2为猪圆环病毒2型特异性扩增引物组，pcv3-p1/pcv3-p2为猪圆环病毒3型特异性扩增引物组，利用其制成的多重试剂盒能快速、特异的检测出猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型中的单一病毒以及三者的混合病毒，猪圆环病毒1型出现409bp一个条带，猪圆环病毒2型出现1173bp一个条带，猪圆环病毒3型出现669bp一个条带，猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型两种病毒混合样品出现409bp、1173bp、669bp三个条带。
本发明的pcv1、pcv2和pcv3的多重pcr检测试剂盒对pcv1、pcv2、pcv3的检测极限分别为1.10×10-5µg/μl、1.37×10-5µg/μl和3.67×10-6µg/μl，表明本发明的猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型和3型的多重pcr检测试剂盒在检测猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、3型时具有较高的灵敏度。本发明的pcv1、pcv2和pcv3的多重pcr检测试剂盒既能缩短诊断时间、节约诊断试剂，又能降低使用成本。
本发明提供的pcv1、pcv2和pcv3的多重pcr检测试剂盒在6个月内检测结果一致，表明本发明pcv1、pcv2和pcv3的多重pcr检测试剂盒具有很高的稳定性。田间试验证明本发明所得的pcv1、pcv2和pcv3的多重pcr检测试剂盒实用性和适用性良好。
附图说明
图1是本发明试剂盒目的基因的pcr扩增结果，其中m：dna分子质量标准；1：pcv1、pcv2、pcv3三阳性组织样本；2：pcv1阳性组织样本；3：pcv2阳性组织样本；4：pcv3阳性组织样本；5：阴性对照。
图2是本发明试剂盒pcr的不同退火温度结果，其中m：dna分子质量标准；1：50.0℃；2：50.7℃；3：51.9℃；4：53.8℃；5：56.1℃；6：58.0℃；7：59.2℃；8：60.0℃。
图3是本发明试剂盒多重pcr的敏感性试验结果，其中m：dna分子质量标准；
1：1.10×100µg/µl、1.37×100µg/µl和3.67×100µg/µl；
2：1.10×10-1µg/µl、1.37×10-1µg/µl和3.67×10-1µg/µl；
3：1.10×10-2µg/µl、1.37×10-2µg/µl和3.67×10-2µg/µl；
4：1.10×10-3µg/µl、1.37×10-3µg/µl和3.67×10-3µg/µl；
5：1.10×10-4µg/µl、1.37×10-4µg/µl和3.67×10-4µg/µl；
6：1.10×10-5µg/µl、1.37×10-5µg/µl和3.67×10-5µg/µl；
7：1.10×10-6µg/µl、1.37×10-6µg/µl和3.67×10-6µg/µl；
8：1.10×10-7µg/µl、1.37×10-7µg/µl和3.67×10-7µg/µl。
图4是本发明试剂盒多重pcr的特异性试验结果，其中m：dna分子质量标准；1：pcv1、pcv2、pcv3三阳性组织样本；2：pcv1阳性组织样本；3：pcv2阳性组织样本；4：pcv3阳性组织样本；5：猪细小病毒；6：猪伪狂犬病毒；7：大肠杆菌；8：金黄色葡萄球菌；9：副猪嗜血杆菌；10：胸膜肺炎放线杆菌；11：阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1材料与方法
1.1病毒及临床样品
猪细小病毒(ppv)、猪伪狂犬病病毒（prv）、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌毒株或菌株均由本实验室保存提供。临床样品采自广西各地养猪场疑似感染圆环病毒的濒死猪、病死猪或剖杀猪主要脏器（淋巴结、脾脏、肺脏和肾脏等），剪取组织样品约0.5g～1.0g，置于灭菌研钵中，充分研磨成匀浆，加入灭菌的1mol/lpbs溶液配成1：5乳悬液，反复冻融3次。10000r/min离心5min，收集上清液，转入1.5ml离心管中编号供dna抽提或者-20℃保存备用。
1.2主要试剂
pmd18-tvector、bamhⅰ、hindⅲ、dl600dnamarker、dl2000dnamarker、dna凝胶回收试剂盒（dnagelextractionkit）均为大连宝生物工程有限公司产品；2×f8fastlongpcrmastermix为北京艾德莱生物科技公司产品；病毒基因组dna/rna快速抽提试剂盒为axygen生物科技有限公司产品；质粒小量抽提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；e.colidh5α菌种，由本实验室保存。
1.3引物的设计与合成
根据genbank上登录的pcv1、pcv2和pcv3的全基因组序列，利用megalign(dnastar)，primerpremier7.0软件针对pcv1、pcv2和pcv3的保守区域分别设计一对特异性引物pcv1-p1/pcv1-p2、pcv2-p1/pcv2-p2和pcv3-p1/pcv3-p2。pcv1上游引物pcv1-p1：5’-ggaaccgaccagcagaataaa-3’，pcv1下游引物pcv1-p2：5’-cccaaggtaaccagccataaa-3’，pcr扩增目的片段大小为409bp。pcv2上游引物pcv2-p1：5’-cgcggatccaatttccgcgggctggctg-3’，pcv2下游引物pcv2-p2：5’-cccaagcttcccgccaccgttaccgctg-3’，pcr扩增目的片段大小为1173bp。pcv3上游引物pcv3-p1：5’-cgcggatccttttcacttagagaacggacttg-3’；pcv3下游引物pcv3-p2：5’-ccggaattctgagacacagagctatattcag-3’，pcr扩增目的片段大小为669bp。引物由大连宝生物工程有限公司合成。
1.4病毒/细菌dna的提取
将prv、ppv病毒液、大肠杆菌菌液、金黄色葡萄球菌菌液、副嗜血杆菌菌液、胸膜肺炎放线杆菌菌液及处理好的组织病料，按照axyprepbodyfluidviraldna/rnaminiprepkit使用说明书进行dna提取，所获得的dna用于下一步的pcr反应。
1.5聚合酶链式反应（pcr）
pcr反应体系25µl，灭菌水6.5µl，2×f8fastlongpcrmastermix12.5µl，25µmol/lpcv1、pcv2和pcv3上下游引物各0.5µl，模板3.0µl。按照下列条件进行扩增：94℃预变性2min；94℃变性10s，56.1℃复性10s，72℃延伸10s，30个循环；最后72℃延伸3min，pcr总反应时间约为50分钟。取扩增产物10µl于10g/l琼脂糖凝胶中电泳，并观察结果。
1.6特异性试验
以提取的猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌dna以及pcv1、pcv2、pcv3、pcv1/pcv2/pcv3混合阳性材料dna为模板，用所建立的方法进行扩增，以验证该方法的特异性。
1.7敏感性试验
1.7.1pcv1、pcv2、pcv3阳性模板的制备
将pcv1、pcv2和pcv3pcr产物进行胶回收纯化后，克隆至pmd18-tvector中，转化dh5a感受态细胞中，取100µl菌液均匀的涂布于la平板上，12-18h后挑阳性菌落进la液体培养基进行扩大培养，抽提质粒并酶切鉴定正确后，将阳性菌液送往上海生物工程有限公司测序，将测序结果放在ncbi上进行blast确定为pcv1、pcv2和pcv3特异性片段。最后，测定阳性质粒浓度，按照1：1：1将三种质粒混合。
1.7.2多重pcr敏感性试验
将经测定并混合后的三种质粒做连续10倍系列稀释后，将各稀释后的不同浓度的混合质粒作为pcr反应模板，在相同条件下进行pcr反应，测定所建立的多重pcr检测方法的敏感性。
1.8多重pcr重复性试验
以建立的多重pcr检测方法，对pcv1、pcv2和pcv3三阳性样品重复检测3次，以验证结果的可靠性。
2结果
2.1pcr扩增
以pcv1阳性dna、pcv2阳性dna、pcv3阳性dna、pcv1、pcv2及pcv3阳性混合dna为模板，按照1.5中的反应体系和反应程序进行多重pcr反应。电泳结果显示（见图1），所建立的多重pcr方法能够检测出pcv1阳性、pcv2阳性、pcv3阳性及pcv1/pcv2/pcv3三阳性材料，扩增出pcv1目的基因约409bp，扩增出pcv2目的基因约1173bp，扩增出pcv3目的基因约669bp，均与预期目的片段大小相符。
2.2最佳退火温度
为获得该反应最佳扩增效果，在50-60℃的温度范围内设8个温度梯度进行多重pcr扩增，发现56.1℃时三个条带均最明显，确定了最佳退火温度为56.1℃（见图2）。
2.3敏感性试验
经测定pmd18-t-pcv1、pmd18-t-pcv2和pmd18-t-pcv3质粒的浓度分别为3.3×100µg/µl、4.1×100µg/µl和1.1×10µg/µl，将三种质粒按照1：1：1进行混匀，混匀后三种质粒的浓度分别为1.10×100µg/µl、1.37×100µg/µl和3.67×100µg/µl。将混合后的质粒作为起始浓度进行连续10倍稀释，然后按照建立的pcr方法进行检测。结果显示，该多重pcr检测方法对pcv1、pcv2、pcv3的检测极限分别为1.10×10-5µg/μl、1.37×10-5µg/μl和3.67×10-6µg/μl（见图3）。
2.4特异性试验结果
试验结果显示（见图4），本研究建立的pcr鉴别诊断方法能特异地检测出pcv1、pcv2、pcv3或者同时检测出pcv1、pcv2和pcv3，而对猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌的检测结果均无条带，表明所建立的方法具有较好的特异性。
2.5多重pcr重复性试验结果
以建立的多重pcr检测方法，重复3次，结果在409bp，1173bp和669bp处，均得到了清晰可见的目的条带，说明建立的多重pcr检测方法具有很好的稳定性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
序列表
<110>广西壮族自治区兽医研究所
<120>一种快速区分pcv1、pcv2和pcv3的多重pcr检测引物组及试剂盒
<141>2018-05-22
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequencelatin)
<400>1
ggaaccgaccagcagaataaa21
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequencelatin)
<400>2
cccaaggtaaccagccataaa21
<210>3
<211>28
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequencelatin)
<400>3
cgcggatccaatttccgcgggctggctg28
<210>4
<211>28
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequencelatin)
<400>4
cccaagcttcccgccaccgttaccgctg28
<210>5
<211>32
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequencelatin)
<400>5
cgcggatccttttcacttagagaacggacttg32
<210>6
<211>31
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequencelatin)
<400>6
ccggaattctgagacacagagctatattcag31