本发明属于分子生物学领域，具体涉及鉴定簇毛麦1v染色体的分子标记引物，1vs染色体检测及其pcr方法。
二、
背景技术：
随着社会经济发展和生活水平的提高，人们对各种面食品的品质要求越来越高，因此小麦的品质改良也日益受到重视。由于普通小麦种内遗传基础狭窄，在普通小麦中发现编码优质蛋白基因种类并不多，这限制了小麦种内品质的进一步改良。为了寻找新的优质基因资源，对小麦近缘种属优质蛋白基因的挖掘与利用已成为小麦品质改良研究的热点(yan等，2004；李巧云等，2007；yan等，2009；)。
簇毛麦属小麦族，簇毛麦属(dasypyrum，又名为haynaldiavillosa.l)，为一年生或多年生异株授粉二倍体植物(2n＝2x＝14，vv)。起源于地中海的东北部，是一种杂草类植物，生长在恶劣、干旱的环境中。和普通栽培小麦相比，具有高抗白粉病、锈病、全蚀病等多种病害，抗旱、耐寒、分蘖力强、小穗数多和籽粒蛋白质含量高等多种优良性状。可作为改良小麦的优良基因源，应用于小麦品种改良。
将簇毛麦携带的优异基因，导入栽培小麦，将推动小麦育种取得突破性进展。簇毛麦hmw-gs具有极其丰富变异类型，zhong和qualset(1993)在14个簇毛麦种群的982个植株中发现了glu-v1的14个等位基因分别编码无、1或2个高分子量蛋白亚基，这是迄今所报道的hmw-gs等位基因多态性最高的二倍体植物。簇毛麦中编码醇溶蛋白基因的三个位点gli-v1，gli-v2，gli-v3分别位于1v，6v和4v上，簇毛麦可为小麦品质改良与育种提供优质外源基因。
簇毛麦属于远缘材料，在生产上不能直接作为亲本与小麦杂交而转育其优异基因到普通小麦。创建出小麦-簇毛麦新种质，将簇毛麦的优异基因转育到普通小麦中以提高小麦的适应性、抗性等，对于定向的改良小麦具有重要的意义。因此，各类异染色材料的创建成为利用簇毛麦优异基因的前提基础。小麦-簇毛麦易位染色体是利用簇毛麦优良基因改良小麦品种的重要环节，为簇毛麦优异基因转育到小麦中提供了基础材料。因此，准确快速鉴定小麦背景中的簇毛麦染色体是必须的，尤其是鉴定小麦-簇毛麦易位染色体，继续发掘簇毛麦染色体上的特异分子标记，对于在小麦育种研究过程中快速有效地跟踪、检测和鉴定导入到小麦中的簇毛麦染色体臂及其片段具有极为重要的意义。
三、
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种簇毛麦1vs染色体特异性分子标记引物及其应用，利用该分子标记引物可特异检测小麦背景中是否存在簇毛麦1vs染色体，能准确快速鉴定小麦背景中的簇毛麦1vs染色体。
本发明另外一个目的是提供克隆簇毛麦醇溶蛋白的两对引物，利用该引物可以分离簇毛麦醇溶蛋白基因，为小麦利用簇毛麦1vs染色体上的醇溶蛋白基因进行品质改良提供外源基因。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种簇毛麦1vs染色体特异性分子标记引物，其特征在于：所述特异性分子标记引物由1vs-f2/1vs-r3、1vs-f8/1vs-r3构成，1vs-f2分子标记引物具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列，1vs-r3具有如序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列，1vs-f8具有如序列表中seqidno.3所示的核苷酸序列。
簇毛麦1vs染色体特异性分子标记引物1vs-f2/1vs-r3、1vs-f8/1vs-r3在簇毛麦1vs染色体检测中的应用。
簇毛麦1vs染色体特异性分子标记引物1vs-f2/1vs-r3、1vs-f8/1vs-r3在簇毛麦1vs染色体上醇溶蛋白基因的克隆与分离中的应用。
簇毛麦1vs染色体特异性分子标记引物1vs-f2/1vs-r3、1vs-f8/1vs-r3在特异检测小麦背景中是否存在簇毛麦1vs染色体的应用。
簇毛麦1vs染色体特异性分子标记引物1vs-f2/1vs-r3、1vs-f8/1vs-r3在一年生簇毛麦ta10245、普通小麦-簇毛麦t1ds·1vl易位系、普通小麦-簇毛麦t1dl·1vs易位系中簇毛麦1vs染色体的检测中的应用。
簇毛麦1vs染色体特异性分子标记引物1vs-f2/1vs-r3、1vs-f8/1vs-r3在利用簇毛麦1vs染色体上的醇溶蛋白基因进行品质改良提供外源基因中的应用。
一种检测簇毛麦1v染色体的pcr方法，其特征在于：其反应体系包括：待检样品dna、引物1vs-f2/1vs-r3、1vs-f8/1vs-r3、estaqmastermix和双蒸水；
引物1vs-f2/1vs-r3扩增程序包括：
步骤(1)：95℃保持5分钟；
步骤(2)：94℃保持45秒；
步骤(3)：61℃保持30秒；
步骤(4)：72℃保持90秒；
步骤(5)：重复步骤(2)至步骤(4)34个循环；
步骤(6)：72℃保持8分钟；
引物1vs-f8/1vs-r3扩增程序包括：
步骤(1)：95℃保持5分钟；
步骤(2)：94℃保持45秒；
步骤(3)：58.3℃保持30秒；
步骤(4)：72℃保持90秒；
步骤(5)：重复步骤(2)至步骤(4)34个循环；
步骤(6)：72℃保持8分钟。
所述反应体系为：待检样品dna模板1微升、引物1vs-f21微升、1vs-r31微升；1vs-f81微升、1vs-r31微升；estaqmastermix12.5微升、双蒸水9.5微升。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：
1、小麦是世界上最重要的粮食作物之一，小麦的加工品质主要由种子贮藏蛋白的质与量决定，贮藏蛋白由谷蛋白和醇溶蛋白组成，醇溶蛋白一般对面筋的延展性起着主要作用。簇毛麦携带的优质蛋白基因为小麦品质改良提供了基因源，分离鉴定簇毛麦醇溶蛋白基因有重要的意义。本发明提供两对分子标记可准确快速鉴定小麦背景中的簇毛麦1vs染色体及其醇溶蛋白基因。
2、本发明的簇毛麦1vs染色体特异性标记，是基于琼脂糖电泳的标记，检测方法较为简单，可使用新型的核酸染料进行染色，更加安全！也为小麦-簇毛麦t1dl·1vs易位系在小麦品质改良与新品种培育中的应用提供一种新型实用高效的分子标记辅助选择技术，并为簇毛麦1vs染色体上的醇溶蛋白基因克隆提供引物与方法。对于充分挖掘簇毛麦优异外源基因资源，促进小麦品质育种具有重要意义。
3、本发明提供的分子标记可用于在分子标记辅助选择育种过程中快速有效地追踪簇毛麦的1v染色体，有利于加快簇毛麦1v染色体，尤其是小麦-簇毛麦t1dl·1vs易位染色体的材料上所携带的优良性状向受体品种的转移与利用，可加速育种进程，提高小麦新品种选育的效率。
四、附图说明：
图1为本发明基于簇毛麦1vs染色体醇溶蛋白特异性分子标记引物1vs-f2/1vs-r3的pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。图中箭头所指部分为引物1vs-f2/1vs-r3扩增的簇毛麦1vs染色体醇溶蛋白特异的目标片段。图中，1.中国春；2.t1ds·1vl；3.ta10245、4.t1dl·1vs。
图2.为本发明基于簇毛麦1vs染色体醇溶蛋白特异性分子标记引物1vs-f8/1vs-r3的pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。图中箭头所指部分为引物1vs-f8/1vs-r3扩增的簇毛麦1vs染色体醇溶蛋白特异的目标片段。图中，1.中国春；2.t1ds·1vl；3.ta10245；4.t1dl·1vs。
五、具体实施方式：
本发明中所使用的术语，除非有另外说明，本领域普通技术人员一般都能理解，下面结合具体的实施例，对本发明进一步详细地描述。给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的使用范围。
本发明簇毛麦1vs染色体上特异性分子标记引物为1vs-f2/1vs-r3、1vs-f8/1vs-r3，分子标记引物序列为：1vs-f2：5’-gtttccaccacaacaaccttat-3’(seqidno.1)，1vs-r3：5’-tgcagtgctaagttccttatctg-3’(seqidno.2)；1vs-f8：5’-cttcctcatctttgtcctcctt-3’(seqidno.3)。
本发明簇毛麦1vs染色体特异性分子标记引物1vs-f2/1vs-r3、1vs-f8/1vs-r3在追踪簇毛麦1vs染色体及克隆分离1vs染色体醇溶蛋白基因序列的应用。
本发明簇毛麦1vs染色体特异性分子标记引物1vs-f2/1vs-r3、1vs-f8/1vs-r3在小麦背景中区分小麦-簇毛麦易位系t1dl·1vs中的1vs染色体中的应用，在检测一年生二倍体簇毛麦1v染色体中的应用，以及分离克隆簇毛麦1vs染色体醇溶蛋白基因序列中的应用。所述用途为鉴定小麦-簇毛麦异源材料中是否含有1v染色体及克隆分离定位簇毛麦1v染色体醇溶蛋白基因的用途。
本发明根据数据库中已知的一年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因序列设计通用引物，筛选簇毛麦1vs染色体特异性标记，为小麦-簇毛麦t1dl·1vs易位系在小麦品质改良与新品种培育中的应用提供一种新型实用高效的分子标记辅助选择技术。并为簇毛麦1vs染色体上的醇溶蛋白基因克隆提供引物与方法。
本发明还公开了所述的簇毛麦1vs染色体特异的分子标记1vs-f2/1vs-r3、1vs-f8/1vs-r3在追踪小麦-簇毛麦t1dl·1vs易位染色体中的用途。
本发明用所述的簇毛麦1vs染色体特异的分子标记t1dl·1vs追踪小麦-簇毛麦t1dl·1vs易位染色体的方法，是用引物对待测材料进行pcr扩增，标记引物1vs-f2/1vs-r3能扩增出约450bp的特异性条带，标记引物1vs-f8/1vs-r3能扩增出约750bp的特异性条带的材料，为含有簇毛麦1vs染色体，小麦-簇毛麦t1dl·1vs易位染色体的材料。
本发明检测簇毛麦1v染色体的pcr方法，其反应体系包括：待检样品dna、引物1vs-f2/1vs-r3、1vs-f8/1vs-r3、estaqmastermix和双蒸水。
引物1vs-f2/1vs-r3扩增程序包括：
步骤(1)：95℃保持5分钟；
步骤(2)：94℃保持45秒；
步骤(3)：61℃保持30秒；
步骤(4)：72℃保持90秒；
步骤(5)：重复步骤(2)至步骤(4)34个循环；
步骤(6)：72℃保持8分钟。
引物1vs-f8/1vs-r3扩增程序包括：
步骤(1)：95℃保持5分钟；
步骤(2)：94℃保持45秒；
步骤(3)：58.3℃保持30秒；
步骤(4)：72℃保持90秒；
步骤(5)：重复步骤(2)至步骤(4)34个循环；
步骤(6)：72℃保持8分钟。
所述反应体系为：待检样品dna模板1微升、引物1vs-f21微升、1vs-r31微升；1vs-f81微升、1vs-r31微升；estaqmastermix12.5微升、双蒸水9.5微升。
实施例:
若未特别指明，以下实施例均按照常规实验条件操作技术，按照制造厂商所建议的实验条件进行，所用试剂、原料均为市售商品，均可从商业途径得到。
一、簇毛麦1vs染色体上醇溶蛋白特异性分子标记1vs-f2/1vs-r3、1vs-f8/1vs-r3引物的合成。
簇毛麦1vs染色体上醇溶蛋白特异性引物序列1vs-f2：5’-gtttccaccacaacaaccttat-3’(seqidno.1)，1vs-r3：5’-tgcagtgctaagttccttatctg-3’(seqidno.2)；1vs-f8：5’-cttcctcatctttgtcctcctt-3’(seqidno.3)。按照本领域常规方法，由引物合成公司合成。
二、检测簇毛麦1vs染色体的pcr方法：
检测簇毛麦1v染色体的方法包括如下步骤：
1、微量ctab法提取基因组dna
以检测材料植株(种子在温室内培养2～3周)嫩叶为材料，采用微量ctab法提取基因组dna。
(1)取检测植株干净幼叶，塞入2.0ml离心管中，并迅速用液氮冷冻，用研磨棒对样品进行研磨破碎。
(2)向离心管中加入500μl65℃的ctab提取液(参照分子克隆实验指南(第三版)中说明配制)并上下翻转使其混匀，然后将离心管在65℃水浴锅中水浴1h，期间缓慢上下颠倒数次；
(3)取出离心管并冷却，随后在4℃下9300g离心10min。吸取上清液至新离心管中(此过程应避免吸到下层物质)并加入500μl氯仿/异戊醇(体积比为24：1)混合液，反复颠倒若干次后在4℃下9300g离心10min；
(4)小心将上清液转移到新离心管中并加入500μl的异丙醇(已在4℃下预冷)，缓慢颠倒数次，随后离心管中出现dna絮状沉淀；静置10min，然后在4℃下9300g离心10min；
(5)弃上清，用70％的乙醇溶液洗涤3次(每次洗涤后均在4℃下9300g离心3min)随后将dna沉淀置于通风橱将其风干；
(6)加入200μl双蒸水(ddh2o)使dna溶解，经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后置于4℃冰箱中保存备用。
2、簇毛麦1vs染色体上特异性分子标记1vs-f2/1vs-r3的pcr扩增反应体系如下：
待检样品dna模板1微升、引物1vs-f21微升、1vs-r31微升、estaqmastermix12.5微升、双蒸水9.5微升。
pcr反应程序：步骤(1)95℃保持5分钟；步骤(2)94℃保持45秒；步骤(3)61℃保持30秒；步骤(4)72℃保持90秒；步骤(5)重复步骤(2)至步骤(4)34个循环；步骤(6)72℃保持8分钟。
扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分离，100v恒定电压电泳40分钟后，染色检测如图1所示，含有1vs染色体的ta10245、t1dl·1vs材料能扩增出约450bp的特异性条带。而在普通小麦(如本例中的中国春)、小麦-簇毛麦t1ds·1vl易位系中则不能扩增出该片段。
3、簇毛麦1vs染色体上特异性分子标记1vs-f8/1vs-r3的pcr扩增反应体系如下：
待检样品dna模板1微升、引物1vs-f81微升、1vs-r31微升、estaqmastermix12.5微升、双蒸水9.5微升。
pcr反应程序：步骤(1)95℃保持5分钟；步骤(2)94℃保持45秒；步骤(3)58.3℃保持30秒；步骤(4)72℃保持90秒；步骤(5)重复步骤(2)至步骤(4)34个循环；步骤(6)72℃保持8分钟。
扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分离，100v恒定电压电泳40分钟后，染色检测如图2所示，含有1vs染色体的ta10245、t1dl·1vs材料能扩增出约750bp的特异性条带。而在普通小麦(如本例中的中国春)、小麦-簇毛麦t1ds·1vl易位系中则不能扩增出该片段。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围，凡是利用本发明的说明书及附图内容所做的等同结构变化，均应包含在本发明的专利保护范围内。
sequencelisting
<110>西北农林科技大学
<120>簇毛麦1vs染色体特异性分子标记引物及其应用
<130>2018
<160>3
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>22
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<213>人工序列
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