本发明属于生物技术领域，具体涉及一种念珠菌属真菌生物被膜流动模型的制备方法。
背景技术
真菌生物被膜是指真菌附着于宿主腔道或生物材料表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等，将自身包绕其中而形成的膜样多细胞复合体。许多研究发现，各种真菌耐药程度与生物被膜形成过程有关，生物被膜越成熟，真菌的耐药性越强。
真菌在细胞体内、体外都可能形成生物被膜。体外生物被膜的形成方式主要有“静态、动态”两种，其中动态下形成的生物被膜由于形成的胞外基质更为丰富，结构更为复杂，从而使得被膜真菌有着更强的耐药性。
体外生物被膜模型包括静止和流动两种。生物被膜流动模型指真菌等微生物在流动状态下形成的生物被膜。目前常用的生物被膜流动模型大多操作比较复杂，通量相对较小，且很少用于混合生物被膜的孵育。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种念珠菌属真菌生物被膜流动模型的制备方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种念珠菌属真菌生物被膜流动模型的制备方法，包括一念珠菌属真菌生物被膜流动模型装置，该念珠菌属真菌生物被膜流动模型装置包括一个用于容纳真菌培养基的第一容器、一蠕动泵、一个分液进样器、四个用于生物被膜孵育的第二容器和一个容纳流出液的第三容器；所述分液进样器设有一个进液孔，在所述进液孔的下方设有四个出液孔；所述第二容器的顶部设有顶部孔，底部设有底部孔；所述四个用于生物被膜孵育的第二容器位于同一水平面上，所述分液进样器的进液孔通过管路与所述蠕动泵的出液口连通，所述蠕动泵的进液口通过管路与所述第一容器连通，所述分液进样器的出液孔分别通过管路与所述第二容器的底部孔连通，所述第二容器的顶部孔分别通过管路与所述第三容器连通；
所述制备方法包括下列步骤：
第一步：首先将念珠菌属真菌菌株接种于sdb培养基中进行孵育，然后离心收集菌细胞，接着用无菌pbs缓冲液清洗，收集的菌细胞重悬于rpmi-1640培养基中，再孵育12~18小时后得到真菌培养液；
第二步：对所述真菌培养液进行离心分离，收集下沉的真菌细胞，添加真菌培养基至真菌细胞浓度为4-6×106cfu/ml，得到重悬菌液；
第三步：将四个医用导管片放置到所述重悬菌液中，摇床孵育使菌体黏附到所述医用导管片上，然后取出所述医用导管片，用ph值为7.2的无菌磷酸缓冲液清洗除去黏附不牢的真菌细胞，接着将所述医用导管片分别放置到所述第二容器内，所述第二容器内容纳有真菌培养基，静置培养1.5~2.5小时后打开所述蠕动泵，流动孵育19~20小时；
第四步：将第三步得到的医用导管片先用ph值为7.2的无菌磷酸缓冲液清洗，然后放入容纳有ph值为7.2的无菌磷酸缓冲液的试管中，接着采用超声波处理至所述医用导管片上不含真菌细胞，收集得到含菌溶液；
第五步：将所述含菌溶液用ph值为7.2的无菌磷酸缓冲液稀释得到稀释液，然后将稀释液与xtt-维生素k3溶液混合于微孔板中，孵育后的菌液在492nm波长下检测其od值。
优选的技术方案为：每升所述真菌培养基含有400mg的氯化钾、6000mg的氯化钠、2000mg的葡萄糖、290.00mg的l-精氨酸、50mg的l-天冬酰胺、20mg的l-天冬氨酸、65.15mg的l-胱氨酸二盐酸盐、20mg的l-谷氨酸、10mg的甘氨酸、15mg的l-组氨酸、20mg的l-羟脯氨酸、50mg的l-异亮氨酸、50mg的l-亮氨酸、40mg的l-赖氨酸、15mg的l-甲硫氨酸、15mg的l-苯丙氨酸、20mg的l-脯氨酸、30mg的l-丝氨酸、20mg的l-苏氨酸、5mg的l-色氨酸、23.19mg的l-酪氨酸、20mg的l-缬氨酸，100ml的质量浓度为10%的胎牛血清，其余为纯化水，然后用3-(n-玛琳代)丙磺酸调整ph值至7.0。
优选的技术方案为：每升sdb培养基含有10g蛋白胨，20g琼脂粉，40g葡萄糖和0.1g氯霉素。
优选的技术方案为：所述rpmi-1640培养基的原料配方包含下列质量百分比的原料：1%的甘露醇、1%的营养肉汤、0.2%的k2hpo4和1.35%的琼脂粉。
附图说明
附图1为念珠菌属真菌生物被膜流动模型装置示意图。
附图2为生物被膜孵育管孵育24hcandidaalbicanssc5314单生物被膜流动模型的od492nm处的吸光度值。
附图3为生物被膜孵育管孵育3天candidaalbicanssc5314单生物被膜流动模型的od492nm处的吸光度值。
附图4为candidaalbicanssc5314在静止状态下孵育的单个生物被膜的扫描电子显微镜检测图。
附图5为candidaalbicanssc5314在流动状态下孵育的单个生物被膜的扫描电子显微镜检测图。
附图6为生物被膜孵育管孵育24hcandidaalbicanssc5314-candidaglabrataatcc64677混合生物被膜流动模型的od492nm处的吸光度值。
附图7为生物被膜孵育管孵育3天candidaalbicanssc5314-candidaglabrataatcc64677混合生物被膜流动模型的od492nm处的吸光度值。
附图8为candidaalbicanssc5314与candidaglabrataatcc64677在静止状态下孵育的混合生物被膜的扫描电子显微镜检测图。
附图9为candidaalbicanssc5314与candidaglabrataatcc64677在流动状态下孵育的混合生物被膜的扫描电子显微镜检测图。
以上附图中：1、第一容器；2、蠕动泵；3、分液进样器；4、第二容器；5第三容器。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发明的念珠菌属真菌生物被膜流动模型的制备方法，具有操作简易，稳定性和重现性良好的优点。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
实施例一：一种念珠菌属真菌生物被膜流动模型的制备方法
一种真菌生物被膜流动模型的制备方法，包括真菌生物被膜流动模型装置构建、真菌菌种培养、真菌生物被膜孵育、真菌生物被膜评价、扫描电子显微镜检测。具体方案如下。
（1）真菌生物被膜流动模型装置构建
真菌生物被膜流动模型装置包括一个盛培养液的烧杯、一个数显蠕动泵、一个用离心管制成的分液进样器（50ml）、四个用于生物被膜孵育的离心管（50ml/个）及其支架、一个盛流出液的烧杯。
所述的分液进样器的制备方法为：在离心管管壁的相对位置上分别打1个和一排4个2mm的孔，放置的时候1个孔在正上方为进液孔，4个孔在正下方为出液孔。
所述的生物被膜孵育离心管的制备方法为：帽子和底端会各打一个2mm的孔，每个离心管内放置一根5*1mm的医用pvc导管片。
所述的支架材料为pmma，有四层，其中第一层和第三层有4个2cm的孔，第二层和第四层有4个4cm的孔，四层的孔全部是同心孔。
所述的真菌生物被膜流动模型装置，每次使用前，所有部件需经过121℃蒸汽高温灭菌，4个生物被膜孵育管应位于同一水平面上。
所述的真菌生物被膜流动模型装置，环境温度恒定为37±1℃，操作时分液进样器会通过细绳固定在一个金属试管架上，正上方的孔经由乳胶管（3mm的外径和5mm的壁厚）与一个蠕动泵相连后插入盛有无菌培养液的烧杯中，正下方的孔经由相同尺寸的乳胶管与四个生物被膜孵育离心管的底端相连，离心管管帽上面的孔通过相同尺寸的乳胶管与盛流出液的烧杯相连。
（2）真菌菌种培养
真菌菌株接种于sdb培养基（含10g/l蛋白胨，20g/l琼脂粉，40g/l葡萄糖，0.1g/l氯霉素）中，37℃下于180rpm的摇床中孵育24h；然后菌细胞经2000rpm离心后收集，用无菌pbs清洗2次；收集的菌细胞重悬于rpmi-1640培养基（含1%甘露醇，1%营养肉汤，0.2%k2hpo4，1.35%琼脂粉）中，在37℃下再孵育12-18h。真菌菌种candidaalbicanssc5314由上海第二军医大学药学院惠赠。
（3）真菌生物被膜孵育
将步骤（2）中真菌培养液在4℃温度环境下，采用3000转/min离心5min，收集下沉的真菌细胞，添加真菌培养基调整真菌细胞浓度到4-6×106cfu/ml，得到重悬菌液。
取5cm长pvc导管片，经95%乙醇消毒后，再用ph7.2无菌磷酸缓冲液清洗。将清洗后的pvc导管片放置到重悬菌液中，在转速160rpm、温度37℃摇床中孵育2h，以便菌体黏附在导管片上。取出导管片，用ph7.2无菌磷酸缓冲液清洗除去黏附不牢的真菌细胞。然后将导管片放置于含有50ml真菌培养基的离心管中，37℃静置培养2h后，打开蠕动泵，调整流速至恒定的0.7ml/min，37℃流动孵育19-20h。
所述的真菌培养基，使用前须经过121℃饱和蒸汽灭菌15min，其配方为：400mg/l氯化钾、6000mg/l氯化钠、2000mg/l葡萄糖、290.00mg/ll-精氨酸、50mg/ll-天冬酰胺、20mg/ll-天冬氨酸、65.15mg/ll-胱氨酸二盐酸盐、20mg/ll-谷氨酸、10mg/l甘氨酸、15mg/ll-组氨酸、20mg/ll-羟脯氨酸、50mg/ll-异亮氨酸、50mg/ll-亮氨酸、40mg/ll-赖氨酸、15mg/ll-甲硫氨酸、15mg/ll-苯丙氨酸、20mg/ll-脯氨酸、30mg/ll-丝氨酸、20mg/ll-苏氨酸、5mg/ll-色氨酸、23.19mg/ll-酪氨酸、20mg/ll-缬氨酸，补加100ml的质量浓度为10%的胎牛血清，其余为纯化水，用0.165mg/l3-(n-玛琳代)丙磺酸调整ph至7.0。
（4）真菌生物被膜评价
生物被膜预处理：将步骤（3）中的导管片取出，用1mlph7.2无菌磷酸缓冲液清洗两次后，放入含有1mlph7.2无菌磷酸缓冲液的试管中，使用频率50khz、强度0.45-0.55w/cm2的超声波处理20min，至导管片上不含真菌细胞，收集超声处理的含菌溶液，以备后续操作。
所述的xtt为3,3'-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠。将50mgxtt溶解于100mlriger溶液得到xtt溶液。将17.2mg维生素k3溶解于10ml丙酮，然后取2μl加入xtt溶液中充分混匀，并通过0.22μm微孔滤膜过滤，得到xtt-维生素k3溶液。
取100μl上述超声处理后的含菌溶液，用ph7.2无菌磷酸缓冲液稀释20倍；然后，从中取200μl稀释液与50μlxtt-维生素k3溶液混合于96孔聚苯乙烯微孔板中，于37℃下孵育2h。孵育后的菌液在492nm波长下检测其od值。
（5）扫描电子显微镜检测。
预先清洗的生物被膜经2.5%戊二醛4℃过夜固定，再用0.1%四氧化锇固定1h，然后经30%、50%、70%、90%、95%and100%乙醇逐级脱水，每个梯度处理10min。经过充分干燥后，样品在真空蒸发器中覆盖金属金，使用3000倍放大倍数扫描电镜观察生物被膜形态。
如图2所示，在流动态下，用xtt法检测四个生物被膜孵育管孵育24hcandidaalbicanssc5314单生物被膜后流动模型装置的稳定性。发现四个孵育管中导管片上解离下来的菌细胞od值（492nm）分别为0.6507±0.1711，0.6875±0.0756，0.7092±0.0239，0.7202±0.0357，两两之间对比无显著差异。
如图3所示，在流动态下，用xtt法检测同一根生物被膜孵育离心管连续孵育3天candidaalbicanssc5314单生物被膜后流动模型装置的稳定性。发现同一根生物被膜孵育离心管连续孵育3天后，导管片上解离下来的菌细胞od值（492nm）分别为0.7214±0.0500，0.7143±0.0900，0.6401±0.1066，两两之间对比无显著差异。
如图4所示，这是candidaalbicanssc5314在静止状态下孵育的单个生物被膜，能看到较多的菌丝和酵母体。
如图5所示，这是candidaalbicanssc5314在流动状态下孵育的单个生物被膜，能看到大量的菌丝体几乎占据了整个视野，盘根错节的菌丝体之间只有少量的酵母体。
实施例二：一种念珠菌属真菌生物被膜流动模型的制备方法
与实施例一区别之处在于：菌种为candidaalbicanssc5314和candidaglabrataatcc64677。candidaalbicanssc5314由上海第二军医大学药学院惠赠，candidaglabrataatcc64677由安徽医科大学第一附属医院提供。
如图6所示，在流动态下，用xtt法检测四个生物被膜孵育管孵育24hcandidaalbicanssc5314-candidaglabrataatcc64677混合生物被膜后流动模型装置的稳定性。我们发现四个孵育管中导管片上解离下来的菌细胞od值（492nm）分别为0.9633±0.1829，0.9827±0.0460，0.9223±0.0801，0.9710±0.0370，两两之间对比无显著差异。
如图7所示，在流动态下，用xtt法检测同一根生物被膜孵育离心管连续孵育3天candidaalbicanssc5314-candidaglabrataatcc64677混合生物被膜后流动模型装置的稳定性。发现同一根生物被膜孵育离心管连续孵育3天后，导管片上解离下来的菌细胞od值（492nm）分别为0.9993±0.1117，0.9723±0.0393，0.9080±0.1053，两两之间对比无显著差异。
如图8所示，这是candidaalbicanssc5314与candidaglabrataatcc64677在静止状态下孵育的混合生物被膜，整个视野中既有菌丝体也有酵母体。
如图9所示，这是candidaalbicanssc5314与candidaglabrataatcc64677在流动状态下孵育的混合生物被膜，整个视野几乎只有菌丝体，已经看不到酵母体。
实施例三：一种念珠菌属真菌生物被膜流动模型的制备方法
一种念珠菌属真菌生物被膜流动模型的制备方法，包括一念珠菌属真菌生物被膜流动模型装置，如图1所示，该念珠菌属真菌生物被膜流动模型装置包括一个用于容纳真菌培养基的第一容器1、一蠕动泵2、一个分液进样器3、四个用于生物被膜孵育的第二容器4和一个容纳流出液的第三容器5；所述分液进样器设有一个进液孔，在所述进液孔的下方设有四个出液孔；所述第二容器的顶部设有顶部孔，底部设有底部孔；所述四个用于生物被膜孵育的第二容器位于同一水平面上，所述分液进样器的进液孔通过管路与所述蠕动泵的出液口连通，所述蠕动泵的进液口通过管路与所述第一容器连通，所述分液进样器的出液孔分别通过管路与所述第二容器的底部孔连通，所述第二容器的顶部孔分别通过管路与所述第三容器连通；
所述制备方法包括下列步骤：
第一步：首先将念珠菌属真菌菌株接种于sdb培养基中进行孵育，然后离心收集菌细胞，接着用无菌pbs缓冲液清洗，收集的菌细胞重悬于rpmi-1640培养基中，再孵育16小时后得到真菌培养液；
第二步：对所述真菌培养液进行离心分离，收集下沉的真菌细胞，添加真菌培养基至真菌细胞浓度为4-6×106cfu/ml，得到重悬菌液；
第三步：将四个医用导管片放置到所述重悬菌液中，摇床孵育使菌体黏附到所述医用导管片上，然后取出所述医用导管片，用ph值为7.2的无菌磷酸缓冲液清洗除去黏附不牢的真菌细胞，接着将所述医用导管片分别放置到所述第二容器内，所述第二容器内容纳有真菌培养基，静置培养2小时后打开所述蠕动泵，流动孵育19小时；
第四步：将第三步得到的医用导管片先用ph值为7.2的无菌磷酸缓冲液清洗，然后放入容纳有ph值为7.2的无菌磷酸缓冲液的试管中，接着采用超声波处理至所述医用导管片上不含真菌细胞，收集得到含菌溶液；
第五步：将所述含菌溶液用ph值为7.2的无菌磷酸缓冲液稀释得到稀释液，然后将稀释液与xtt-维生素k3溶液混合于微孔板中，孵育后的菌液在492nm波长下检测其od值。
优选的实施方式为：每升所述真菌培养基含有400mg的氯化钾、6000mg的氯化钠、2000mg的葡萄糖、290.00mg的l-精氨酸、50mg的l-天冬酰胺、20mg的l-天冬氨酸、65.15mg的l-胱氨酸二盐酸盐、20mg的l-谷氨酸、10mg的甘氨酸、15mg的l-组氨酸、20mg的l-羟脯氨酸、50mg的l-异亮氨酸、50mg的l-亮氨酸、40mg的l-赖氨酸、15mg的l-甲硫氨酸、15mg的l-苯丙氨酸、20mg的l-脯氨酸、30mg的l-丝氨酸、20mg的l-苏氨酸、5mg的l-色氨酸、23.19mg的l-酪氨酸、20mg的l-缬氨酸，100ml的质量浓度为10%的胎牛血清，其余为纯化水，然后用3-(n-玛琳代)丙磺酸调整ph值至7.0。
优选的实施方式为：每升sdb培养基含有10g蛋白胨，20g琼脂粉，40g葡萄糖和0.1g氯霉素。
优选的实施方式为：所述rpmi-1640培养基的原料配方包含下列质量百分比的原料：1%的甘露醇、1%的营养肉汤、0.2%的k2hpo4和1.35%的琼脂粉。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。