本发明属于流行病学诊断防治领域，涉及一种诊断登革热和登革出血热的brca2基因及其应用。
背景技术：
从公元2世纪的antonine瘟疫(shrapr,lotkaaj.aprobleminagedistribution[j].philosophicalmagazine,1911,21:35-438)开始，传染病就一直危害人类的健康，给社会稳定带来了巨大的影响。近年来，登革热传染病的发病率迅速增长，已经成为世界公共卫生问题，而且作为一种疾病记录在新修订的国际卫生条例(2005)的附录ii中。登革热(denguefever)是登革热病毒引起，伊蚊传播的一种急性传染病。开始,人们根据它的症状将其命名为关节热和骨折热(monath,t.p.dengue:therisktodevelopedanddevelopingcountries:proc.nat.acad.sci.usa91(1994),2395-2400)。1869年由英国伦敦皇家内科学会将其命名为登革热(m.g.guzman,g.p.kouri,l.valdes,j.bravo,m.alvares,s.vasquez,i.delgadoands.b.halstead,epidemiologicstudiesondengueinsantiagodecuba.am.j.epidemiol,152(2000),793-799)。登革热是一种流行于热带和亚热带地区的传染病，临床表明，登革热早在200多年前已经被发现，最早于1779年在埃及开罗，印度尼西亚雅加达及美国费城被发现，但它的病因只到1944年才被发现。登革热的传染物是黄病毒科中的一种，此后，于1979，1980，1985年的小流行中分离出ⅰ，ⅱ，ⅲ型病株(centersfordiseasecontrolandprevention,23,(2010),129-145)。1978年登革热在我国广东流行，并分离出第ⅳ型登革热病株(rico-hesse,r.harrison,l.m.salas,r.a.tovar,d.nisalak,a.ramos,c.boshell,j.demesa,t.r.nogheira,m.r.tavassosdarosa,originsofdenguetype2virusesassociatedwithincreasedpathogenicityintheamericas.journalofclinicalvirol-ogy,230(1997),244-251)。
登革出血热是登革热的一种严重临床类型。起病类似典型登革热，发热2～5天后病情突然加重，发生多器官较大量的出血和休克，出现血液浓缩、血小板减少、白细胞增多、肝大。多见于青少年患者，病死率较高。
登革热和登革出血热的发病机理迄今尚未完全阐明，近年来的研究有如下看法。
(1)免疫机理halstead等认为初次感染登革病毒的人，临床上表现为典型登革热，不发生出血和休克；再次感染异型登革病毒时，病毒在血液中与原有的抗体结合，形成免疫复合物，激活补体，引起组织免疫病理损伤，临床上呈现出血和休克。
(2)病毒的变异
hammon认为登革热和登革出血热的不同临床表现与病毒的变异有关。通过塔希堤、斐济等太平洋岛屿的流行病学观察，发现不少初次感染的登革热病人也出现登革出血热临床经过，病人的血清反应也属初次感染类型，且儿童占多数。有人认为登革病毒感染的临床病情轻重与病毒的毒力有关。登革病毒通过变异产生毒力更强的病毒株可能是登革出血热发生的重要原因。
(3)病理变化
a、登革热本病肝、肾、心和脑均有退行性变。心内膜、心包、胸膜、腹膜、胃肠粘膜、肌肉，皮肤及中枢神经系统有不同程度的出血。皮疹中小血管内皮肿胀、血管周围水肿及单核细胞浸润。瘀斑中广泛血管外溢血。
b、登革出血热本病的主要病变为全身血管损害引起的血管扩张、充血，导致出血和血浆外渗。消化道、心内膜下、皮下、肝包膜下、肺及软组织出血。内脏小血管及毛细血管周围出血、水肿及淋巴细胞浸润，肝脾及淋巴结中的淋巴细胞及浆细胞增生，吞噬现象活跃，肺充血及出血，间质细胞增多，肝实质脂肪变并有灶性坏死，汇管区有淋巴细胞、组织细胞及浆细胞浸润。肾上腺毛细血管扩张、充血及灶性出血，球状带脂肪消失，有灶性坏死。骨髓示巨核细胞成熟障碍。
登革热病毒感染的临床表现十分复杂，而且多数症状与疟病、伤寒以及基孔肯亚热等疾病难以区分，单纯依据患者的流行病资料和临床表现很难明确诊断，因此需要实验室检测进一步确诊。目前常用的实验室检测包括：
(1)一般常规检查
a、周围血象登革热患者的白细胞总数起病时即有减少，至出疹期尤为明显；中性粒细胞百分比也见降低，并有明显核左移现象，有异常淋巴细胞，退热后1周血象恢复正常。登革出血热患者的白细胞总数正常或增多，后者见于严重病例及有继发感染者，一般在1万/mm3以上。血小板减少，最低可达1万/mm3以下。
b、尿常规可有少量蛋白、红细胞、白细胞，有时有管型。
(2)病毒分离取早期病人血液，接种于白纹伊蚊细胞株(c6/36)、分离病毒后须经型特异性中和试验或血凝抑制试验加以鉴定。
(3)血清免疫学检查取双份血清作补体结合试验、中和试验或血凝抑制试验，以血凝抑制试验的灵敏性较高，而以补体结合试验最具特异性。恢复期单份标本补体结合抗体效价达到1∶32以上有诊断意义；双份血清效价递升4倍以上可确诊。
(4)其他在登革出血热病例中尚可见血液浓缩，出、凝血时间延长，血清谷草转氨酶升高，凝血酶原时间延长，电解质紊乱，血白蛋白降低，代谢性酸中毒等。各种凝血因子轻度降低，纤维蛋白原减少，纤维蛋白原降解物轻至中度增加。半数以上的休克病例有dic表现。
但是上述常规实验室检测方法的敏感度低，因此开发一种敏感性高、有效检测登革热和登革出血热的方法是亟待解决的问题。
本申请对登革热患者、登革出血热患者以及正常对照组血液样本高通量转录组数据进行多中心、多样本的数据整合分析，获得登革出血热疾病发生发展中关键的mrna、可能的登革出血热早期诊断的生物标志物。深入研究登革出血热和登革热疾病相关基因的调控机制，以及随着登革热疾病的严重程度，基因表达水平的变化情况，为登革出血热和登革热的诊疗提供理论依据。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种通过检测brca2基因或蛋白表达差异来诊断登革热和/或登革出血热的方法。
本发明的目的之二在于提供一种利用上述方法实现诊断目的的诊断试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了检测brca2基因或brca2蛋白的产品在制备登革热和/或登革出血热诊断工具中的用途。
进一步，所述检测brca2基因或brca2蛋白的产品包括检测brca2基因或brca2蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合brca2基因的核酸或者能够结合brca2蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测brca2基因的表达水平；所述物质能够检测brca2蛋白的表达水平。
本发明的检测brca2基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如pcr、如southern杂交、northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(fish)、dna微阵列、aso法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
进一步，所述pcr方法为已知方法，例如，arms(amplificationrefractorymutationsystem，扩增不应突变系统)法、rt-pcr(逆转录酶-pcr)法、嵌套pcr法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(spr法)、pcr-rflp法、原位rt-pcr法、pcr-sso(序列特异性寡核苷酸)法、pcr-ssp法、ampflp(可扩增片段长度多态性)法、mvr-pcr法、和pcr-sscp(单链构象多态性)法来检测。
上面所述的核酸包括扩增brca2基因的引物，产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
在本发明的具体实施方案中，所述核酸为反转录pcr实验中使用的扩增引物，所述引物的序列如seqidno.1(上游序列)和seqidno.2(下游序列)所示。
上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
本发明的检测brca2蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括elisa、放射免疫测定法、免疫组织化学法、western印迹等。
本发明的检测brca2蛋白的产品包括特异性结合brca2蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括f(ab′)2、fab′、fab、单链fv(scfv)、二硫化物键合的fv(dsfv)或其聚合物、二聚化v区(双抗体)、或含有cdr的肽。本发明的检测brca2蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的brca2蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对brca2蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用dmso、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-nh2、生物素标记试剂盒-sh(dojindolaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-nh2、碱性磷酸酶标记试剂盒-sh(dojindolaboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-nh2、过氧化物酶标记试剂盒-nh2(dojindolaboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-nh2、藻胆蛋白标记试剂盒-sh、b-藻红蛋白标记试剂盒-nh2，b-藻红蛋白标记试剂盒-sh、r-藻红蛋白标记试剂盒-nh2、r-藻红蛋白标记试剂盒sh(dojindolaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-nh2、hilytefluor(tm)555标记试剂盒-nh2、hilytefluor(tm)647标记试剂盒-nh2(dojindolaboratories)；及dylight547和dylight647(technochemicalcorp.)、zenon(tm)、alexafluor(tm)抗体标记试剂盒、qdot(tm)抗体标记试剂盒(invitrogencorporation)和ez-标记物蛋白质标记试剂盒(funakoshicorporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
进一步，所述检测brca2基因或brca2蛋白的产品可以是检测brca2基因或brca2蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
利用前面所述的检测产品检测受试者样本中的brca2基因或brca2蛋白的表达水平，与正常人相比，受试者样本中的brca2基因或brca2蛋白的表达水平升高，则诊断受试者为登革热或登革出血热；与登革热患者相比，如果受试者样本中的brca2基因或brca2蛋白的表达水平升高，则诊断该受试者为登革出血热。
作为依照本发明的检测产品的样本，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。
在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的血液。
本发明还提供了一种诊断登革热和/或登革出血热的工具，所述工具能够检测受试者样本中brca2基因或brca2蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合brca2基因的核酸或者能够结合brca2蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测brca2基因的表达水平；所述物质能够检测brca2蛋白的表达水平。
进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
进一步，所述诊断登革热和/或登革出血热的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断登革热和/或登革出血热的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知brca2基因的异常与登革热和/或登革出血热相关也属于brca2基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗brca2抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合brca2即可。当抗体作为治疗药物时，优选的是它能够识别尽可能多的氨基酸，只要它能抑制brca2功能。抗体或其片段识别的氨基酸的数目是至少一个，更优选至少三个。抗体的免疫球蛋白类别不受限制，可以是igg、igm、iga、ige、igd或igy。
本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗brca2抗体的其他性质同前面所述。
进一步，所述受试者样本可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的血液。
本发明还提供了一种诊断登革热和/或登革出血热的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取受试者的样品；
(2)检测受试者样品中brca2基因或蛋白的表达水平；
(3)将测得的brca2基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
(4)与正常对照组织相比，brca2基因或蛋白的表达水平升高，则该受试者被诊断为登革热或登革出血热；与登革热患者相比，受试者样本中的brca2基因或brca2蛋白的表达水平升高，则诊断该受试者为登革出血热。
在本发明的上下文中，“brca2基因”包括brca2基因(chromosome13,nc_000013.11(32315480..32399672))以及brca2基因的任何功能等同物的多核苷酸。brca2基因包括与目前国际公共核酸序列数据库genebank中brca2基因(chromosome13,nc_000013.11(32315480..32399672))dna序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna序列。
在本发明的上下文中，“brca2蛋白”包括brca2蛋白以及brca2蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括brca2蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与brca2的dna杂交的dna所编码的蛋白质。
在本发明的上下文中，“诊断登革热和/或登革出血热”既包括判断受试者是否已经患有登革热和/或登革出血热、也包括判断受试者是否存在患有登革热和/或登革出血热的风险。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现并证实brca2基因表达与登革热和/或登革出血热的密切相关性，验证的样本量多，结果准确。该相关性的提出为登革热和/或登革出血热的诊断与治疗提供了新的途径。
本发明发现了一种既可以诊断登革热又可以诊断登革出血热的分子标志物，该分子标志物不仅可以区分正常人和登革热患者，还可以有效区分登革出血热患者和登革热患者。
本发明开发出了适合于进行登革热和/或登革出血热检测的试剂或试剂盒，检测灵敏度和特异性良好。
附图说明
图1显示利用反转录pcr检测brca2基因mrna在登革热和/或登革出血热患者和正常人中的表达差异。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选登革热和/或登革出血热患者和正常人中差异表达的基因
1、研究对象：
疾病组：收集5名登革热患者，5名登革出血热患者，所有患者根据“who/tdr.dengue-guidelinesfordiagnosis，treatment，preventionandcontrol.2009；http：//www.who.int/tdr/publications/training-guideline-publications/dengue-diagnosis-treatment/en/index.html.dateofaccess:12/05/2015.2009”进行确诊。
正常组：选取健康志愿者4例。
两组之间年龄、性别差异无统计学意义(p>0.10)，具有可比性。
所有研究对象对本研究均知情并签署了知情同意书。
2、血液中总rna的提取
(1)新鲜全血，红细胞裂解液(1：1)，颠倒混匀数次，静置5min。10000g，4℃，10min。此时可见白细胞沉淀和上层亮红色的液体。
(2)加入trizol(106-107细胞加500μl)，反复抽吸，直至有大量泡沫产生(细胞裂解的标志之一)，常温孵育5min。
(3)加入氯仿(氯仿：trizol＝1：5)，剧烈混匀15s,室温静置10min。
(4)离心，12,000g15min，4℃。
(5)小心吸取上清液，转移到新ep管中,加入异丙醇(异丙醇：trizol＝1:2),充分混匀(8-10次),室温孵育10min。
(6)离心，12,000g10min，4℃。
(7)可见管底有凝胶状沉淀，弃去上清液，加入75％乙醇(乙醇：trizol＝1:1)，温和混匀，7500g，5min。
(8)弃尽上清液，倒扣在滤纸片上(放在玻璃皿中)室温干燥5min(不要干透，即rna略微出现透明时)，加入60μldepc水溶解沉淀。
3、高通量转录组测序
(1)rna-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用tophatv1.3.1将清洁片段与ucsch.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，h.sapiensucschg19版的预先构建的索引从tophat主页下载，并作为参考基因组，利用tophat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。tophat根据外显子区域和gt-ag剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用tophat方法的系统默认参数。
(2)转录丰度评估
匹配上的读段文件通过cufflinksv1.0.3处理，cufflinksv1.0.3将rna-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。fpkm值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算fpkm估计值的置信区间。cufflinks使用的参考的gtf注释文件从ensembl数据库下载(homo_sapiens.grch37.63.gtf)。
(3)差异表达基因的检测
将下载的ensemblgtf文件和通过tophat匹配的原始文件传输到cuffdiff，cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算gtf文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
4、结果
rna-seq结果显示，登革热患者和正常人之间、登革出血热患者和正常人之间、登革热患者和登革出血热患者之间均存在的差异表达基因共有1789个，差异均具有统计学意义(p<0.05)。
实施例2反转录pcr实验验证登革热和/或登革出血热患者和正常人中差异表达的基因
选择实施例1筛选出来的差异表达基因-brca2基因进行大样本验证。
1、研究对象：
疾病组：收集30名登革热患者，25名登革出血热患者，所有患者根据“who/tdr.dengue-guidelinesfordiagnosis，treatment，preventionandcontrol.2009；http：//www.who.int/tdr/publications/training-guideline-publications/dengue-diagnosis-treatment/en/index.html.dateofaccess:12/05/2015.2009”进行确诊。
正常组：选取健康志愿者30例。
两组之间年龄、性别差异无统计学意义(p>0.10)，具有可比性。
所有研究对象对本研究均知情并签署了知情同意书。
2、血液中总rna的提取
使用a&dpure全血总rna提取试剂盒(产品组成见表1)提取外周血样本中的总rna。
表1产品组成
按照试剂盒的说明书记载的步骤进行总rna提取，步骤大致如下描述：
1)在1.5ml离心管中加入1mlbufferl9，再加入500μl全血，漩涡振荡30秒混合均匀。
2)13000rpm离心10分钟。在一个洁净的1.5ml离心管中加入400μl无水乙醇备用。
3)吸取700μl离心上清转移到装有无水乙醇的1.5ml离心管中，勿弃吸头，直接用吸头吸注两次混匀，吸取混合液进入步骤4)的操作。
4)转移550μl步骤3)中的混合液转移到核酸纯化柱(核酸纯化柱置于2ml离心管中)中，盖上管盖，12000rpm离心30秒。
5)弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，将1.5ml离心管中剩余的液体全部倒入核酸纯化柱中，盖上管盖，12000rpm离心30秒。
6)弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入500μlbufferwa,盖上管盖，12000rpm离心30秒。
7)弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入700μlbufferwbr，盖上管盖，12000rpm离心30秒。
8)弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，14000rpm离心1分钟。
9)弃2ml离心管，将核酸纯化柱置于一个rnase-free的1.5ml离心管中，在纯化柱中加入50μlbufferte，盖上管盖，室温静置1分钟，12000rpm离心30秒。
10)弃纯化柱，洗脱的rna可立即用于各种分子生物学实验；或者将rna储存于-70℃备用。
3、反转录pcr(reversetranscription，rt-pcr)
3.1逆转录
cdna第一链的合成(reversetranscription)：使用gibicol公司提供的superscripttmpreamplificationsystemforfirststrandcdnasynthesis试剂盒完成：
a、在0.5ml微量离心管中，加入总rna1-5μg，补充适量的depch2o使总体积达11μl。在管中加10μmoligo(dt)12-181μl，轻轻混匀、离心。
b、70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。
然后加入下列试剂的混合物：
10×pcrbuffer2μl
25mmmgcl22μl
10mmdntpmix1μl
0.1mdtt2μl
轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min。
c、加入superscriptⅱ1μl，在42℃水浴中孵育50min。
d、于70℃加热15min以终止反应。
e、将管插入冰中，加入rnaseh1μl，37℃孵育20min，降解残留的rna。-20℃保存备用。
3.2pcr
(1)取0.5mlpcr管，依次加入下列试剂：
第一链cdna2μl
上游引物(10pm)2μl
下游引物(10pm)2μl
dntp(2mm)4μl
10×pcrbuffer5μl
taq酶(2u/μl)1μl
(2)加入适量的ddh2o，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心。
(3)设定pcr程序：
95℃5min预变性
94℃30s变性
50℃40s退火
72℃30s延伸
72℃7min终末延伸
28个循环，4℃保温。
为了保证实验结果的可靠与准确，可在pcr扩增目的基因时，加入一对内参(如gapdh)的特异性引物，同时扩增内参dna，作为对照。
(4)电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
(5)密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描，电泳条带的密度值大小代表基因mrna表达水平高低。
引物设计
根据genbank中brca2基因和gapdh基因的编码序列设计rt-pcr扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
brca2基因：
上游引物为5’-gacttaggaaggaatgtt-3’(seqidno.1)；
下游引物为5’-taccactgacttatctct-3’(seqidno.2)，
gapdh基因：
上游引物为5’-tcaagatcatcagcaatg-3’(seqidno.3)；
下游引物为5’-cgataccaaagttgtcat-3’(seqidno.4)。
5、统计学方法
结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。
6、结果
经检测，与正常人相比，30例登革热患者中有29例患者血液中brca2基因mrna表达水平显著升高；25例登革出血热患者中有25例患者血液中brca2基因mrna表达水平显著升高。以正常人血液中brca2基因的表达水平设为基准为1，结果如图1所示，与正常人相比，登革热和/或登革出血热患者血液中brca2基因的mrna水平显著升高，差异具有统计学意义(p<0.05)，其中，与登革热患者相比，登革出血热患者血液中brca2基因的mrna水平升高，差异具有统计学意义(p<0.05)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110>北京泱深生物信息技术有限公司
<120>登革热和登革出血热诊断区分标志物
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gacttaggaaggaatgtt18
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
taccactgacttatctct18
<210>3
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
tcaagatcatcagcaatg18
<210>4
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
cgataccaaagttgtcat18