一种生物酶法从小龙虾壳中提取N-乙酰氨基葡萄糖与虾青素的方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种生物酶法从小龙虾壳中提取n-乙酰氨基葡萄糖与虾青素的方法。

背景技术：

n-乙酰-d-氨基葡萄糖是生物细胞内许多重要多糖的基本组成单位，尤其在海洋甲壳类动物的外骨骼含量最高。n-乙酰-d-氨基葡萄糖及其衍生物的应用十分广泛，在临床医药上它是目前治疗风湿性及类风湿性关节炎的药物，此外，还具有增强人体免疫系统的功能，通过抑制癌细胞或纤维细胞的过度生长，可对癌症和恶性肿癌起到抑制和治疗作用。食品行业里它也可以作为食品抗氧化剂、婴幼儿食品添加剂及糖尿病患者甜味剂。

虾青素(astaxanthin)又名龙虾壳色素，分子结构中有两个β-紫罗兰酮环，11个共轭双键。虾青素广泛存在于自然界，如大多数甲壳类动物和鲑科鱼类体内，植物的叶、花、果，以及火烈鸟的羽毛中等。虾青素具有多种生理功效，如在抗氧化性、抗肿瘤、预防癌症、增强免疫力、改善视力等方面都有一定的效果。

我国虾类资源极为丰富，小龙虾（procambarusclarkii），原产于美国东南部，又名克氏螯虾，是最具食用价值的淡水龙虾品种，年产量占整个淡水龙虾产量的70-80%。随着夏季的到来，各地都会对食用小龙虾狂热至极，每只小龙虾的可食比率为20-30%，还有70-80%的部分(主要为虾头和虾壳)被废弃。南京人每年要消费掉1000-2000吨龙虾和800吨螃蟹，扔掉龙虾蟹壳1500吨;每年避免不了的产生了大量虾壳垃圾，而虾壳中含有大量具有高附价值的物质如几丁质和虾青素。虾头、虾壳中几丁质含量达10-20%，蛋白质含量达到20-40%，钙含量达到30-40%。

目前国内有关虾壳的处理工艺虽多，但是多数存在过程工艺不够完善。如申请号为cn02122565.6一种用鲜虾壳生产甲壳素、虾青素和蛋白质的方法专利中，处理虾壳时采用的酸碱溶液会造成环境的严重污染。cn104140474a专利开发了一种综合利用废弃虾蟹皮有用物质的方法，对各个物质进行了提取，同时对几丁质进行了酶法降解得到n-乙酰氨基葡萄糖，存在周期过长，工艺较为复杂。同时，几丁质降解产物既可以作为菌体利用的碳源，又可作为氮源。转化过程难以控制，极易染菌，会使发酵产物n-乙酰氨基葡萄糖被所染杂菌迅速消耗，影响产品质量水平。

目前工业应用上常用的防止染菌措施主要利用紫外灭菌器，超声波灭菌器，高压灭菌器等，例如专利一种降低染菌概率的连续发酵扩培装置（cn201220624316.4）中利用蒸汽湿热灭菌达到抑菌效果，并通过合并管道减少开口数量，并减少阀门数量，降低连续发酵扩培过程的染菌概率。尽管上述技术比较成熟，但是存在着设备昂贵，操作危险的缺点，限制了生物制糖业的发展。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种生物酶法从小龙虾壳中提取n-乙酰氨基葡萄糖与虾青素的方法，该方法操作简单易行，绿色污染，对设备要求低，原料利用率高，同时提取两种物质，不仅缩短了反应周期，且生产过程产物被污染风险低，产品质量高。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种生物酶法从小龙虾壳中提取n-乙酰氨基葡萄糖与虾青素的方法，包括以下步骤：

步骤1，小龙虾虾壳预处理

将小龙虾虾壳经过清洗、煮沸、烘干后，粉碎得到小龙虾虾壳粉；

步骤2，粗纯酶液的制备

取产几丁质酶微生物为供试菌，将供试菌接种至种子培养基上培养得种子液，再将种子液转移至发酵培养基中发酵后，提纯得粗纯酶液；

步骤3，无菌酶解小龙虾虾壳

取小龙虾虾壳粉置于反应釜中，依次加入粗纯酶液和有机试剂，避光下边搅拌边恒温加热至20-37℃得酶解液；

步骤4，将步骤3中的酶解液静止20min-1h分层后，倒出上层液，避光下回收有机试剂和富含虾青素的虾油，再离心下层液，用吸附树脂经吸附、洗脱后，将洗脱液经低温浓缩、醇洗、结晶、干燥得n-乙酰氨基葡萄糖。

作为改进的是，步骤1中小龙虾虾壳粉的目数为50目。

作为改进的是，步骤2中产几丁质酶微生物为chitinolyticbactermeiyuanensissybc-h1或chitinibactersp.gc72；种子培养温度为37℃，转速为200rpm，初始ph为6-8；发酵温度为培养温度为30℃，转速为200rpm，初始ph为6-8，通气量为1vvm。

作为改进的是，步骤3中所述有机试剂为乙醚、正己烷、环己烷、正辛烷、二氯甲烷或石油醚中的一种或多种混合，且有机试剂占总体系的体积份数为10-70%，搅拌速度为50-500rpm。

作为上述技术方案的优选，所述的步骤（2）中粗纯酶是以吸附降解法获得，胶体几丁质作为吸附载体对几丁质酶的进行特异性吸附，然后进行降解，除去未降解的固体，上清即为酶液。

有益效果

与现有技术相比，本发明的优势在于：

（1）本发明利用小龙虾虾壳为原料，充分利用了废弃生物质资源，成本低，安全性高；

（2）本发明同时提取n-乙酰氨基葡萄糖和虾青素，缩短了生产周期，采用有机试剂使两种产物分两相生产，且有机试剂可回收，同时避免了产物被微生物降解的风险，提取过程无菌，产率高。

附图说明

图1为虾壳虾青素样品液相图谱；

图2为虾青素标准品液相图谱；

图3为n-乙酰氨基葡萄糖样品液相图谱；

图4为n-乙酰氨基葡萄糖准品图谱。

具体实施方式

实施例1

一种生物酶法从小龙虾壳中提取n-乙酰氨基葡萄糖与虾青素的方法，包括以下步骤：

步骤1，小龙虾虾壳预处理

将50g小龙虾虾壳经过超声清洗3次，一次30min除掉大部分颗粒杂质，煮沸除去食用油脂，然后烘干后，粉碎（50目）得到小龙虾虾壳粉；

步骤2，粗纯酶液的制备

取产几丁质酶微生物为供试菌，将供试菌接种至种子培养基上，在37℃，200rpm，初始ph为7的条件下培养得种子液，再将种子液转移至发酵培养基中30℃，200rpm，初始ph为7，通气量1vvm的条件下发酵后，提纯得粗纯酶液；

步骤3，无菌酶解小龙虾虾壳

取10g小龙虾虾壳粉置于反应釜中，依次加入粗纯酶液和30%（v/v）正己烷，总体系为100ml，避光下以300rpm的速度搅拌边恒温加热至35℃，24小时后得酶解液；

步骤4，将步骤3中的酶解液静止20min分层后，倒出上层液，避光下回收有机试剂和富含虾青素的虾油，提取率约为60%，再离心下层液，用吸附树脂经吸附、洗脱后，将洗脱液经低温浓缩、醇洗、结晶、干燥得1.7gn-乙酰氨基葡萄糖。

实施例2

一种生物酶法从小龙虾壳中提取n-乙酰氨基葡萄糖与虾青素的方法，包括以下步骤：

步骤1，小龙虾虾壳预处理

将500g小龙虾虾壳经过超声清洗3次，一次40min除掉大部分颗粒杂质，煮沸除去食用油脂，然后烘干后，粉碎（50目）得到小龙虾虾壳粉；

步骤2，粗纯酶液的制备

取产几丁质酶微生物为供试菌，将供试菌接种至种子培养基上，在37℃，200rpm，初始ph为7的条件下培养得种子液，再将种子液转移至发酵培养基中30℃，200rpm，初始ph为6.8，通气量1vvm的条件下发酵后，提纯得粗纯酶液；

步骤3，无菌酶解小龙虾虾壳

取10g小龙虾虾壳粉置于反应釜中，依次加入粗纯酶液和40%（v/v）正辛烷，总体系为2l，避光下以400rpm的速度搅拌边恒温加热至37℃，24小时后得酶解液；

步骤4，将步骤3中的酶解液静止40min分层后，倒出上层液，避光下回收有机试剂和富含虾青素的虾油，提取率约为73%，再离心下层液，用吸附树脂经吸附、洗脱后，将洗脱液经低温浓缩、醇洗、结晶、干燥得35gn-乙酰氨基葡萄糖。

从上述结果可以看出，本发明利用了废弃生物质资源，成本低，安全性高，同时提取n-乙酰氨基葡萄糖和虾青素，缩短了生产周期，采用有机试剂使两种产物分两相生产，且有机试剂可回收，同时避免了产物被微生物降解的风险，提取过程无菌，产率高。