本发明属于分子生物学领域，涉及一种三元穿梭载体及利用其构建clbv侵染性克隆的方法。
背景技术：
：：柑桔叶斑驳病毒(citrusleafblotchvirus，clbv)属乙型线形病毒科(betaflexiviridae)柑桔病毒属(citrivirus)的代表成员，可以通过嫁接侵染大多数的柑桔品种，还可以通过种子传播，具有一定的传播流行风险。构建clbv侵染性克隆将有助于了解其分子特性及致病机理，对于clbv的流行防控也具有重要作用。另外，clbv在多数柑桔品种上不会引起明显的病毒感染症状，有望开发成为具有广泛应用前景的病毒载体。clbv基因组大小约为8.7kb，包含三个开放阅读框(openreadingframe，orf)，分别编码复制相关蛋白、运动蛋白及外壳蛋白，其中运动蛋白为沉默抑制子，5’-端有甲基化帽子结构，3’-端有polya尾巴。侵染性克隆不仅为病毒研究提供背景单一而可靠的遗传材料，还可用于研究病毒的移动、复制及其致病机理，同时还为深入研究病毒与寄主互作机制、进行病毒载体化改造和应用奠定坚实的基础。然而，病毒全长cdna侵染性克隆的构建技术性较强，构建工作难度大。有研究表明，利用大肠杆菌构建较大基因组rna病毒全长cdna克隆时，由于其自身编码的病毒蛋白可能会对宿主菌产生毒性作用，从而导致非特异性重组，出现不稳定现象。这成为病毒侵染性克隆构建面临的最大困难和挑战。病毒全长基因组克隆在e.coli中存在的不稳定现象的机制仍不清楚。通常利用以下几个方法解决：将病毒序列分段克隆，侵染前再短暂的连接；或利用拷贝数目较低的载体；或是调控细菌生长的环境(如降低培养温度等)来减少毒性；也有利用插入内含子到病毒全基因组序列中来避免产生具有毒性的蛋白。但这些方法均耗时耗力且成功率低。酵母转化伴随的同源重组(tar)是一种利用酵母高效同源重组系统来实现多个相互存在同源序列的dna片段组装方法。youssef等(yousseff,maraisa,faurec,gentitp,candresset.strategiestofacilitatethedevelopmentofunclonedorclonedinfectiousfull-lengthviralcdnas:applechloroticleafspotvirusasacasestudy.virologyjournal,2011,8(1):1-12)在构建苹果褪绿叶斑病毒(applechloroticleafspotvirus,aclsv)时，从36个经限制性内切酶酶切正确的e.coli克隆中仅鉴定出1个有侵染性的克隆，表明aclsv克隆在e.coli细胞存在着不稳定性，但经酵母tar技术获重组克隆后，直接通过农杆菌介导接种获得了稳定的aclsv的侵染性克隆。庹德财等(庹德财,沈文涛,言普,黎小瑛,周鹏.一种e.coli-free的酵母同源重组系统稳定快速构建pldmv侵染性克隆的新方法.热带作物学报,2017,38(8):1492-1500)在构建番木瓜畸形花叶病毒(papayaleafdistortionmosaicvirus,pldmv)时，发现pldmv在大肠杆菌中也存在不稳定现象，而当在pldmv的p3基因中插入内含子时，经酵母重组后转化e.coli能获得测序正确的稳定的侵染性克隆。由于clbv基因组较大，采用传统的酶切连接法构建其侵染性克隆，费时费力且成功率低。在前期的尝试中，利用大肠杆菌作宿主很难获得clbv的侵染性克隆，猜测可能与前述不稳定性有关。技术实现要素：本发明的目的在于针对上述技术问题，提供一种三元穿梭载体及利用其构建clbv侵染性克隆的方法。本发明实现其目的的技术方案为：一种三元穿梭载体pcy，其核苷酸序列如seqidno:17所示。一种构建clbv侵染性克隆的方法，包括如下步骤：(1)提取感染clbv植株的总rna，反转录后以cdna作为模板，采用两对特异引物pcy-clbv1f、clbv1r与clbv2f、pcy-clbv2r分别进行pcr扩增，得到覆盖clbv基因组全长的两个特异片段clbv1、clbv2；所述引物pcy-clbv1f、clbv1r、clbv2f、pcy-clbv2r的序列分别如seqidno:3～6所示；(2)采用限制性内切酶stui、smai酶切如seqidno:17所示的三元穿梭载体pcy，得到pcy线性化的载体；(3)tar克隆：采用醋酸锂转化法将clbv1、clbv2和线性化三元穿梭载体pcy共转化酵母菌yph501，通过同源重组获得clbv基因组全长cdna克隆pcy-clbv；(4)侵染性克隆鉴定：将pcy-clbv质粒通过电击转化农杆菌c58c1，接种柑桔或本生烟，筛选获得clbv侵染性克隆。在上述技术方案中，步骤(2)中所述的三元穿梭载体pcy的构建方法为：a、采用限制性内切酶sacii单酶切双元载体质粒dk1317-2，得到线性化的载体；b、以pyes1lvector为模板，以seqidno:1～2所示pyes2117f、pyes2117r为引物进行pcr扩增，然后回收目的片段；c、将线性化dk1317-2载体和步骤b得到的回收片段进行重组融合，转化大肠杆菌jm109，挑选阳性克隆，即得。本发明的有益效果是：本发明构建的三元穿梭载体pcy，不仅可以在酵母细胞中通过同源重组快速克隆病毒全长cdna，而且可以经农杆菌介导直接接种寄主植物，还可以在大肠杆菌中复制扩增；本发明利用基于pcy的酵母高效同源重组系统来构建clbv基因组全长cdna克隆，有效克服了传统酶切链接法中酶切位点的限制，整个重组过程仅需一次酵母转化即可，2周内即可获得病毒全长cdna克隆，速度快、效率高；该发明通过tar技术将覆盖病毒基因组全长cdna的片段与三元穿梭表达载体pcy同源重组后，不转化大肠杆菌，而是直接转化农杆菌，从而获得病毒侵染性克隆，有效克服了病毒基因组全长cdna在大肠杆菌中产生毒性或不稳定导致克隆失败的现象，侵染性克隆获得率显著提高，可达70％左右。附图说明图1是穿梭载体pcy的质粒图谱。图2是clbv全基因组核苷酸的系统进化树。图3是clbv侵染本生烟的rt-pcr检测结果，其中，m：dna分子标准，1：水，2：阴性对照，3-18：pcy-clbv1～16接种本生烟，19：阳性对照。图4是northernblot分析clbv基因组rna，其中，1：健康对照，2-6：农杆菌介导的pcy-clbv1、2、3、14、15侵染本生烟样品。图5是农杆菌介导pcy-pvx接种本生烟后的症状图。图6为pvx的rt-pcr检测结果，其中，m：dl2000dnamarker；1～2：样品；3：阳性对照；4：阴性对照。具体实施方式本发明所用材料和试剂来源如下：酵母菌株yph501、农杆菌菌株c58c1由法国thierrycandresse教授惠赠。限制性内切酶sacii、stui、smai购自北京neb公司；lataqase、primerstarmaxpremix、in-fusionhdcloningkit、primescripttmii1ststrandcdnasynthesiskit、jm109购自大连takara公司；trizol试剂、pyes1lvector购自美国invitrogen公司。根据ncbi中已报道clbv全基因组序列(genbank登录号为aj318061)，利用primerpriemer5.0软件设计扩增clbv基因序列的特异引物。pcy-clbv1f与clbv1r、clbv2f与pcy-clbv2r两对特异引物分别用于扩增覆盖clbv基因组全长的两个特异片段clbv1、clbv2；pyes2117f和pyes2117r用于扩增包含酵母复制起始位点的片段；pcy-pvx-f和pcy-pvx-r用于扩增pvx全长以验证穿梭载体的有效性。在引物设计时，clbv1r与clbv2f、pcy-clbv1f与酶切后的pcy载体、pcy-clbv2r与酶切后的pcy载体、pcy-pvx-r与酶切后的pcy载体、pcy-pvx-f与酶切后的pcy载体之间都分别有25～30bp的重叠序列，以便于在酵母中完成同源重组。引物均由英骏(上海)生物技术有限公司合成(表1)。表1引物设计及其序列注：方框内为sacii限制性内切酶识别序列，下划线部分是与pcy载体同源的30bp。实施例1构建三元穿梭载体pcy首先构建双元载体质粒dk1317-2：用质粒pcmbia1301及pxt1改造得到，pcmbia1301从市场上购买得到，pxt1载体由南京农业大学陶小荣教授惠赠。以pxt1载体为模板，用引物tl1310f/tl1310r扩增包含pxt1基因表达组件(lb-2x35s-mcs-hdvrz-nos-rb)的片段。pcambia1301质粒用pvui消化。然后用凝胶提取试剂盒对包含预期片段的扩增和酶切产物进行提纯和融合重组。所获融合质粒用vspi酶切，大的片段重新连接起来以构建pcambi-2x35s-mcs-hdvrz-nos，即dk1317-2。采用限制性内切酶sacii单酶切双元载体质粒dk1317-2，得到线性化的载体。酶切反应体系：质粒dk1317-212μl，限制性内切酶sacii2.5μl，10×nebbuffer5μl，双蒸水23μl。酶切反应条件：37℃反应0.5h。以pyes1lvector为模板，pyes2117f、pyes2117r为引物扩增含有酵母相关复制起始位点的片段pyes1l-2117：反应体积为25μl，包括双蒸水8.5μl，primerstarmaxpremix(2×)12.5μl，特异性上下游引物各1μl，模板pyes1lvector1μl。反应条件：98℃1min，98℃10s，58℃15s，72℃2min，30个循环；72℃5min，4℃保存。然后利用dna凝胶纯化试剂盒回收目的片段，命名为pyes1l-2117。采用in-fusionhdcloningkit进行重组，其体系包括：线性化dk1317-2载体加2μl，插入片段pyes1l-2117加4μl，in-fusionenzyme加2μl，ddh2o补齐至10μl。50℃，水浴30min，4℃保存。转化大肠杆菌jm109，37℃过夜培养，挑选阳性克隆，获得可以在酵母-农杆菌-大肠杆菌中生长的三元穿梭载体pcy(其质粒图谱见图1)。pcy含有酵母(ars4/cen5)，根癌土壤杆菌(pvs1或iv)和大肠杆菌(pbr322ori)的复制元件，基因表达盒2x35s-mcs-hdvrz-nos位于t-dna插入元件左臂和右臂之间。因此，载体pcy可以用于酵母细胞中dna片段的同源组装以及随后将重组dna分子转化到农杆菌或大肠杆菌中。此外，当病毒全长cdna克隆到pcy的stui和smai限制性酶切位点之间时，基因表达盒2x35s-mcs-hdvrz-nos将确保病毒基因组的精确起始和终止。三元穿梭载体pcy的核苷酸序列见seqidno:17。实施例2构建clbv的侵染性克隆一、感病叶片总rna的提取与clbv的分段扩增按照trizol试剂说明书提取感病叶片的总rna，通过琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性。以所提取的总rna为模版，使用primescripttmii1ststrandcdnasynthesiskit，合成cdna的第一链。以该cdna为模板，用两对特异引物pcy-clbv1f、clbv1r与clbv2f、pcy-clbv2r对分别进行pcr扩增，得到覆盖clbv基因组全长的两个特异片段clbv1、clbv2，大小分别为4500bp和4247bp。pcr反应体系为25μl包括：双蒸水8.5μl，primerstarmaxpremix(2×)12.5μl，特异性上下游引物各1μl，模板1μl。反应条件：98℃1min，98℃10s，55℃15s，72℃2min，35个循环；72℃5min，4℃保存。然后利用dna凝胶纯化试剂盒回收目的片段clbv1和clbv2。二、酵母同源重组构建clbv基因组全长cdna克隆1)采用限制性内切酶stui、smai酶切质粒pcy，得到pcy线性化的载体。反应体系：质粒pcy13μl，限制性内切酶smai1.0μl，10×nebbuffer5μl，双蒸水31μl。酶切反应条件：25℃反应0.5h，然后再加入stui1.0μl，37℃孵育0.5h。2)利用醋酸锂转化法转化酵母及菌落pcr参照赵光远(tuod,shenw,yanp,lix,zhoup.rapidconstructionofstableinfectiousfull-lengthcdnacloneofpapayaleafdistortionmosaicvirususingin-fusioncloning.viruses,2015,7(12):6241-6250)和thierrycandresse(yousseff,maraisa,faurec,gentitp,candresset.strategiestofacilitatethedevelopmentofunclonedorclonedinfectiousfull-lengthviralcdnas:applechloroticleafspotvirusasacasestudy.virologyjournal,2011,8(1):1-12)采用的醋酸锂转化法，取制备好的酵母感受态细胞yph501100μl至2ml的离心管中，按顺序加入以下试剂：peg4000(50％w/v)240μl，1mol/l的liac36μl、10mg/ml的鲑鱼精dna25μl和pcy线性化的载体200ng、clbv1、clbv2各100ng，震荡使转化体系中的组分充分混匀，在30℃摇床中250r/min摇菌30min，42℃水浴热激15min；6000r/min离心3min，弃去上清液，使用300μlddh2o重悬细胞，均匀涂布在trp缺陷型筛选平板上，于30℃培养2～4d。挑取单克隆菌落，利用特异引物clbv1f、clbv5r进行菌落pcr鉴定。结果表明，挑取的24个菌落中22个为pcr阳性。3)clbv基因组全长cdna克隆鉴定提取前述pcr阳性菌落的酵母质粒，利用pcy-clbv1f、clbv1r与clbv2f、pcy-clbv2r分别进行pcr检测以鉴定clbv全长cdna克隆，结果从22个中鉴定出16个全长质粒，clbv全长cdna克隆阳性率71.4％。随机选1个全长cdna克隆测序，结果表明：clbv全长大小8747bp，包含3个开放阅读框，orf1为5889nt、orf2为1089nt、orf3为1092nt，5'末端有甲基化帽子结构，3'末端具有poly(a)。序列比对结果显示，该序列与genbank已登录的其它clbv全长序列的核苷酸一致性为79％～98％，其中与柑桔来源的eu857540一致性最高，为98％，与猕猴桃来源的jn983454、jn983455、jn983456和jn900477的一致性均为79％。在利用mega6软件构建的系统发育树上，该序列与柑桔来源的clbv分离株聚为一簇(图2)。三、clbv基因组全长cdna克隆的侵染性鉴定1)转化农杆菌及接种提取clbv基因组全长cdna克隆质粒，通过电击转化农杆菌c58c1。挑取clbv阳性单克隆接种含20mg·l-1rif，50mg·l-1kan的lb液体培养基，200r·min-1，28℃振荡培养12～16h。同时，接种hc-pro或p19表达质粒的农杆菌单克隆。离心收集菌体，用含有10mmol·l-1mgcl2，10mmol·l-1mes，200μmol·l-1as的接种缓冲液悬浮，使其od600分别为0.8～1.2和0.2～0.5。静置2h后通过注射接种4～6叶期的本生烟叶片，并通过真空浸润接种5～7天大的锦橙幼苗。同时，以pcy空载质粒的农杆菌作为阴性对照。2)rt-pcr法检测clbv接种20d后，提取接种烟草上位叶片或新生锦橙叶片的总rna，用特异引物clbv1f、clbv5r进行rt-pcr扩增检测。pcr反应体系如下：先后在pcr管中加入模板1μl和ddh2o1μl，94℃解链3min后置于冰上，加入ddh2o2.3μl，2×1stepbuffer5μl，clbv1f0.2μl，clbv5r0.2μl，primescript1stepenzymemix0.3μl。反应程序：50℃30min，94℃2min，94℃30s，50℃30s，72℃45s，35个循环，72℃5min，4℃停止。结果表明，pcy-clbv1、2、3、5、8、9、12、13、14、15、16接种植株检测出clbv特异性条带(如图3所示)。初步说明，clbv侵染性克隆构建成功。3)northernblot法检测clbv有报道表明，本生烟接种clbv并不表现明显症状。为进一步确定所构建克隆的侵染性，将rt-pcr检测阳性的本生烟样本随机选取5个进行northernblot杂交验证。探针的制备与标记：采用pcr制备探针，体系如下：pcrbufferwithmgcl25μl，pcrdigprobesynthesismix5μl，01018-f0.5μl，01018-r0.5μl，enzymemix0.75μl，模板为样品clbv反转录cdna1μl，h2oto50μl。反应程序：预变性94℃5min，变性94℃30s，，退火53℃30s，延伸72℃30s，35个循环；再延伸72℃5min，琼脂糖凝胶电泳检测结果，胶回收之后保存备用。膜制备、杂交及信号检测：制备1％甲醛变性凝胶电泳，25v恒压、4℃、电泳过夜。再将凝胶中的dna转至尼龙膜。预杂交：取10.0mldigeasyhyb，加入杂交管中，50℃杂交炉中预杂交2h；排尽预杂交液，在10.0mldigeasyhyb加入新变性好的探针，混匀，50℃杂交仪中杂交过夜。然后洗膜，最后用凝胶成像系统扫描尼龙膜检测northernblot杂交信号。结果显示：pcy-clbv1、2、3、14、15接本生烟可以检测到clbv特异性条带，而对照样本未检测到任何条带(见图4)，表明pcy-clbv1、2、3、14、15为侵染性克隆。此外，随机选取5个侵染本生烟呈阳性的单克隆采用真空浸润法接种锦橙(c.sinensis)幼苗。接种40天后，利用rt-pcr均可以在新发叶片中检测到clbv特异性条带，这进一步确认clbv侵染性克隆构建成功。实施例3穿梭载体pcy用于pvx侵染性克隆构建参照实施例2的方法将本发明的穿梭载体pcy用于pvx(potatovirusx)侵染性克隆构建，pvx全长cdna的扩增采用引物pcy-pvxf、pcy-pvxr，酵母菌落pcr检测采用引物pvx-f、pvx-r。将验证为阳性的pcy-pvx质粒转化农杆菌c58c1并通过农杆菌注射浸润本生烟，接种10天后的观察结果显示：注射pcy-pvx的烟草症状和阳性对照的完全一样，与阴性对照形成明显的对比(如图5所示)。这说明pvx得到了高效表达，基于三元穿梭载体pcy的酵母重组克隆体系构建成功，可用于其他病毒的侵染性克隆构建。采集接种10天后的本生烟嫩叶，利用plus法抽提叶片总核酸进行普通rt-pcr检测。结果显示，pcy-pvx接种的上位叶片扩增出与预期大小相符的目的条带(如图6所示)，这说明基于三元穿梭载体pcy的酵母重组克隆体系构建成功。实施例4穿梭载体pcy用于cyvcv侵染性克隆构建参照实施例2的方法将本发明的穿梭载体pcy用于cyvcv(柑桔黄化脉明病毒，citrusyellowclearingveinvirus)侵染性克隆构建。通过tar技术将其全长cdna克隆至三元载体pcy，成功获得柑桔黄化脉明病毒四川安岳分离物基因组全长cdna克隆，测序结果表明cyvcv-ay基因组为7529bp，包含6个开放阅读框，与目前已报道的cyvcv分离株一致。序列比对结果显示，随机选取的4个cyvcv-ay基因组全长cdna克隆的核苷酸序列相似性均在99％以上；在系统进化树上，cyvcv-ay的4个克隆均与柑桔来源的cyvcv分离株聚为一簇。通过tar克隆在国内外首次获得了cyvcv的侵染性cdna克隆，症状观察及rt-pcr检测结果表明，所获得的pcy-cyvcv具有侵染性。序列表<110>西南大学<120>三元穿梭载体及利用其构建clbv侵染性克隆的方法<160>17<210>1<211>39<212>dna<213>人工序列<223>pyes2117f<400>1gccgattttgaaaccgcggagtcagtgagcgaggaagcg39<210>2<211>39<212>dna<213>人工序列<223>pyes2117r<400>2ctgcctgtgatcaccgcggcatcttttactttcaccagc39<210>3<211>59<212>dna<213>人工序列<223>pcy-clbv1f<400>3atataaggaagttcatttcatttggagaggagaaaagcaacgaaagcaacctacacaac59<210>4<211>30<212>dna<213>人工序列<223>clbv1r<400>4aaagggtcaccctccaacctttcctcccta30<210>5<211>30<212>dna<213>人工序列<223>clbv2f<400>5tagggaggaaaggttggagggtgacccttt30<210>6<211>57<212>dna<213>人工序列<223>pcy-clbv2r<400>6cgcgaggaggtggagatgccatgccgacccttttttttttttttttttttgtctaaa57<210>7<211>56<212>dna<213>人工序列<223>pcy-pvx-f<400>7atataaggaagttcatttcatttggagaggagaaaactaaaccatacaccaccaac56<210>8<211>99<212>dna<213>人工序列<223>pcy-pvx-r<400>8cgcgaggaggtggagatgccatgccgacccgggttttttttttttttttttttttttttt60tttttttttttttttttttttttttttttttttatttat99<210>9<211>22<212>dna<213>人工序列<223>clbv1f<400>9agccatagttgaaccattcctc22<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<223>clbv5r<400>10gcagatcattcaccacatgc20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<223>pvx-f<400>11atgtcagcaccagctagcac20<210>12<211>23<212>dna<213>人工序列<223>pvx-r<400>12ggatccttatggtggtggtagag23<210>13<211>18<212>dna<213>人工序列<223>01018-f<400>13aggtcttcttcgccattt18<210>14<211>18<212>dna<213>人工序列<223>01018-r<400>14cccttcttcctccagttt18<210>15<211>41<212>dna<213>人工序列<223>tl1310f<400>15aactcgagcttgtcgattaatgcatgcctgcagtcaacatg41<210>16<211>33<212>dna<213>人工序列<223>tl1310r<400>16aaatgtttgaacgatcggggaaattcgagctct33<210>17<211>10347<212>dna<213>人工序列<223>三元穿梭载体pcy<400>17attaatgcatgcctgcagtcaacatggtggagcacgacactct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