本发明属于动物医学
技术领域：
：，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5基因修饰的重组蛋白及其应用。
背景技术：
：：猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,prrs)是由prrsv引起的致妊娠母猪早产、流产、产死胎、木乃伊胎和仔猪呼吸困难的传染病。本病最早暴发于美国，目前呈世界范围内流行，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。prrsv属动脉炎病毒科,为单股正链rna病毒,基因组大小约为15kb，根据基因型可分为以lv毒株为代表的欧洲型和以vr2332为代表的美洲型，我国主要流行株为美洲型。prrsv有9个不分节段的开放阅读框，编码多种非结构蛋白和8个结构蛋白，其中gp5和m蛋白是病毒的主要结构蛋白，gp5蛋白又称为e蛋白，由orf5编码，是一种跨膜糖蛋白，位于病毒粒子的包膜上，为糖基化的囊膜蛋白。gp5蛋白具有较好的免疫原性，可诱导产生中和抗体，能在体外中和病毒的感染性，动物机体在中和抗体出现之后，抗血清主要识别gp5蛋白。本研究将高致病性prrsvbb0907毒株，在分析gp5抗原性、信号肽及跨膜区等特性基础上，首次通过删除跨膜区基因片段和大肠杆菌偏嗜性密码子基因修饰，人工合成基因片段，构建了原核表达载体，成功获得高效表达的gp5重组蛋白，兔体免疫试验证明，该蛋白具有较好免疫特性。成功建立间接elisa抗体检测方法用于prrsv抗体检测，该方法特异性和敏感性均达90％以上，与idexx公司prrsvelisa抗体检测试剂盒符合率为91.567％，具有重要应用前景。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种密码子优化的猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5蛋白编码基因及其应用。本发明的目的可以通过以下技术方案实现：一种密码子优化的猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5蛋白编码基因，是如下(1)～(3)中的任一种dna分子：(1)由序列表中seqidno.3所示的dna分子；(2)在严格条件下与(1)限定的dna序列杂交且编码猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5蛋白的dna分子；(3)与(1)限定的dna序列至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5蛋白的dna分子。含有上述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。上述重组载体为将所述的编码基因插入原核表达载体得到的载体；所述原核表达载体具体为大肠杆菌表达质粒pet-28a(+)。上述重组菌为将所述重组载体导入目的菌中得到的重组菌，所述目的菌具体为大肠杆菌；所述的大肠杆菌进一步具体为大肠杆菌bl21。上述的编码基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备gp5重组蛋白中的应用。一种制备gp5重组蛋白的方法，为发酵上述的重组菌，收集发酵产物并进行纯化，即得到gp5重组蛋白。采用上述的方法制备的gp5重组蛋白。上述方法制备的gp5重组蛋白在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗或建立prrsvgp5间接elisa抗体检测试剂盒中的应用。一种猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗或prrsvgp5间接elisa抗体检测试剂盒，包含上述方法制备的gp5重组蛋白。一种prrsvgp5间接elisa抗体检测方法，用抗原包被液稀释上述方法制备的gp5重组蛋白，包被浓度为10μg/ml，37℃/2h+4℃过夜(37℃包被2h，然后4℃过夜)；5％脱脂乳37℃封闭1h；加入1:100倍稀释的待检血清，同时设定prrsv阴性血清和阳性血清(1:100)，37℃反应1h；以hrp-spa(1:15000)为二抗，37℃作用45min，以tmb为显色底物进行常规elisa检测，计算s/p值，即s/p＝(样品测定孔od450nm值—阴性对照孔平均od450nm值)/(阳性对照孔平均od450nm值—阴性对照孔平均od450nm值)；当s/p≥0.383时判为阳性，s/p<0.347时为阴性，介于0.347和0.383之间时判为可疑。本发明的有益效果：猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)是影响世界养猪业的一种重要病原，引起妊娠母猪早产、流产、产死胎、木乃伊胎和仔猪呼吸道疾病和死亡，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。目前，该病抗体检测有elisa、ifa和ipma等方法，商品化的抗体检测试剂盒主要是prrsvn蛋白elisa抗体检测试剂盒和纯化的全病毒抗原elisa抗体检测试剂盒，但不能用于判定猪群免疫保护水平，也不能用于鉴别感染和免疫抗体。gp5是prrsv重要免疫保护蛋白，是研制prrsv基因工程亚单位疫苗重要候选靶向分子。该蛋白基因大小为600bp，编码200个氨基酸，具有两个跨膜区，不能采用原核表达系统获得有效表达。本研究将高致病性prrsvbb0907毒株，在分析gp5抗原性、信号肽及跨膜区等特性基础上，首次通过删除跨膜区基因片段和大肠杆菌偏嗜性密码子基因修饰，人工合成基因片段，成功构建了高效表达的gp5重组蛋白的原核表达载体pet-28a-gp5/3m。通过iptg诱导表达条件优化，成功获得高效表达的gp5重组蛋白。采用包涵体纯化方法，制备获得纯化重组蛋白，采用弗氏佐剂混合乳化制备疫苗，兔体免疫试验证明，该蛋白具有较好免疫特性。免疫兔血清prrsvelisa抗体效价达1:51200。westernblot证实该多抗能与prrsv和杆状病毒表达的gp5蛋白发生特异性反应，间接免疫荧光试验(ifa)证实该抗体能特异性识别细胞中prrsv，并且能够中和prrsv。采用该蛋白建立间接elisa抗体检测方法，其最佳抗原包被浓度为10μg/ml，血清的最佳稀释度为1:100。与猪圆环病毒2型(pcv2)、猪瘟病毒(csfv)、伪狂犬病毒(prv)、口蹄疫病毒(fmdv)、脑心肌炎病毒(emcv)和副猪嗜血杆菌(hps)等7种猪病原无交叉反应。相对idexx公司prrsvelisa抗体检测试剂盒，该方法相对敏感性和相对特异性为90.56％和92.86％，两种符合率为91.567％。该研究首次设计了prrsvgp5优化密码子基因并制备获得了抗原性优良的重组蛋白，制备了特异的gp5蛋白抗体，具有多种血清学反应特性，并用于建立prrsvgp5elisa抗体检测方法，具有重要应用前景。附图说明图1为prrsvgp5基因原核表达分子设计策略图其中，a.gp5蛋白跨膜区分析：经tmhmmserver,v2.0软件分析，gp5蛋白有两个跨膜区。b.gp5及其新设计分子基因组成。gp5基因和gp5/3基因：与a图相对应，红色为跨膜区，粉红色为胞外区，蓝色为胞内区，gp5/3由胞外区和胞内区基因组成。gp5/3m基因：以gp5/3为基础，按大肠杆菌偏嗜性密码子基因进行了优化。图2为prrsvgp5基因重组质粒原核表达产物sds-page其中，m：proteinmarker；1.pet-28a-gp5/3m；2.pet-28a-gp5/3；3.pet-28a-gp5；图3为prrsvgp5原核表达产物sds-page(左)和westernblot(右)鉴定其中，m：蛋白质marker；1.诱导表达菌体裂解产物的沉淀；2.诱导表达菌体裂解产物的离心上清物；3.纯化包涵体目的蛋白图4为westernblot检测兔抗血清的特异性其中，m：蛋白质marker；1：杆状病毒表达gp5蛋白；2：sf9空白对照；3：纯化的prrsv；4：marc-145细胞对照；图5为兔抗血清ifa检测marc145细胞感染的prrsv(×200)其中，a～c：1:10稀释的gp5m抗血清；b：1:50稀释的gp5m抗血清；c：1:100倍稀释的gp5m抗血清；d：prrsvn蛋白单克隆抗体阳性对照；e：兔阴性血清对照具体实施方式一、材料与方法1.质粒、菌株、病毒pet-28a(+)、大肠杆菌bl21、marc-145细胞、prrsvbb0907(genbank登录号:hq315835)毒株均由本实验室保存。gp5单抗由中国农业科学院上海兽医研究所童光志老师惠赠，hrp标记山羊抗小鼠igg、hrp标记山羊抗兔igg抗体均购自碧云天公司，限制内切酶ecori和xhoi购自takara公司，supersignalwestpico超灵敏ecl化学发光试剂盒购自pierce公司，其它试剂均为国产分析纯。2.目的基因重组质粒的构建与鉴定从ncbi上查找prrsvbb0907毒株gp5基因序列，采用tmhmmserver,v.2.0网站软件分析该蛋白跨膜区(图1a)，将跨膜区的基因序列删除后，剩余片段由aaa氨基酸连接，合成获得gp5/3基因片段，再对其密码子优化为大肠杆菌偏嗜性密码子基因，合成获得gp5/3m基因片段(图1b)。采用pcr方法通过ecori和xhoi两个酶切位点，将目的基因片段分别克隆至大肠杆菌表达质粒pet-28a(+)，构建获得重组质粒pet-28a-gp5、pet-28a-gp5/3和pet-28a-gp5/3m，由金斯瑞生物技术有限公司进行目的基因测序，证明目的基因序列正确。3.重组蛋白iptg诱导表达及纯化将重组质粒pet-28a-gp5、pet-28a-gp5/3和pet-28a-gp5/3m分别转化至大肠杆菌bl21，涂抹于含卡那霉素的lb平板上，挑选单个菌落，于lb营养液中培养，加终浓度为1mmiptg于37℃诱导4h，将菌样于4℃、12000r·min-1离心10min，收集沉淀，用pbs重悬菌体，超声裂解后，进行sds-page，比较目的蛋白表达效果。取pet-28a-gp5/3m大肠杆菌诱导表达产物，超声裂解后离心，收集沉淀。按包涵体蛋白纯化方法进行，制备获得纯化的目的蛋白。采用westernblot方法进行鉴定。4.sds-page及westernblot按常规方法进行。制备12％(w/v，g/100ml)聚丙烯酰胺凝胶，进行sds-page电泳，电泳后将蛋白转印至nc膜，将nc膜放入含10％(w/v，g/100ml)脱脂乳的pbst(10mmna2hpo4、2mmkh2po4、137mmnacl、2.7mmkcl、0.5％(v/v)吐温-20)封闭液中，4℃封闭过夜。用pbst洗涤3次，然后与gp5单抗(1：1000稀释)室温孵育2h，用pbst洗涤nc膜5次。用pbst按1:1000稀释二抗(羊抗鼠lgg-hrp)，室温(25℃)作用1h，洗涤后将ecl发光液(a液,b液)等量混匀后均匀涂抹于nc膜上，置于曝光仪中进行梯度曝光并保存照片。5.重组蛋白免疫特性测定采用纯化蛋白gp5/3m，浓度为2mg/ml，与等体积的弗氏佐剂混合乳化。取1.5kg体重家兔2只，背部皮肤多点皮内注射，总剂量为1ml/只，间隔3周加强免疫。首次免疫用弗氏完全佐剂，第2和第3次免疫用弗氏不完全佐剂。免疫后3周耳缘静脉采血，用纯化prrsv抗原间接elisa方法检测抗体效价。当抗体效价达到1:10000以上，采集兔心脏血液，经5000r·min-1离心10min，收集血清，-20℃保存，并进行以下鉴定。5.1间接elisa抗体效价测定将纯化的prrsvbb0907病毒液用0.05mol/l碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(ph9.6)稀释至2mg/ml包被酶标板，100μl/孔，37℃孵育2h，用5％脱脂乳封闭，加入2倍比稀释的兔多抗血清，用阴性兔血清作对照，二抗是1:250稀释的hrp标记山羊抗兔igg，tmb显色，酶标仪读取od450nm吸光度值。5.2westernblot检测多抗特异性采用prrsv浓缩抗原、gp5蛋白重组杆状病毒(fanetal.,plusone2015)和gp5/3m蛋白及sf9细胞对照物进行。一抗为1:1000稀释制备好的兔多抗血清，二抗为1:1000稀释的羊抗兔lgg-hrp，其余步骤同方法4。5.3间接免疫荧光试验(ifa)按常规方法进行。取prrsvbb0907(moi＝0.01)感染36h的marc-145细胞96孔板，用pbs清洗后，每孔加入100μl1:1(v:v)甲醇：丙酮细胞固定液，固定细胞30min。固定后的细胞用pbs洗三次。加入pbs1:10、1:50和1:100稀释的兔多抗血清，同时设立prrsvn蛋白单抗(1:100稀释)为阳性对照，阴性兔血清为阴性对照，37℃作用1h。洗涤后加入1:200稀释的fitc标记的羊抗兔二抗，阳性对照组加入1:200稀释的fitc标记的羊抗鼠二抗，37℃作用1h。用pbs洗涤三次。置倒置荧光显微镜下观察，并拍照保存。5.4病毒中和试验将生长状态良好的marc-145细胞接种96孔细胞培养板,100μl孔,待细胞铺满单层。用细胞生长维持液(含2％(v/v)fbs的dmem培养液)稀释prrsvbb0907病毒至200tcid50/ml,与等体积倍比稀释的兔多抗血清充分混匀后,置37℃水浴中作用1h，加入96孔细胞培养板，100μl/孔,再补加细胞维持液100μl孔,放入37℃,5％co2细胞培养箱中培养3天，逐日观察细胞病变，以完全中和病毒细胞病变的最高血清稀释倍数，判为中和抗体效价。6.prrsvgp5间接elisa抗体检测方法的建立6.1elisa反应条件的优化用方阵滴定法检测抗原的最适工作浓度和血清最佳稀释度。用0.05mol/l碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(ph9.6)对gp5m蛋白(0.2mg/ml)进行倍比稀释，每孔100μl，37℃2h，或37℃2h+4℃过夜包被酶标反应板；5％脱脂乳37℃封闭1h、或37℃封闭2h；分别加入1:100、1:150、1:200和1:250倍稀释的prrsv阴性血清和阳性血清，37℃反应1h；以hrp-spa(1:10000或1:15000)为二抗，37℃作用45min，以tmb为显色底物进行常规elisa检测。计算s/p值。即s/p＝(样品测定孔od450nm值-阴性对照孔平均od450nm值)/(阳性对照孔平均od450nm值-阴性对照孔平均od450nm值)。6.2临界值的确定用建立的间接elisa方法检测60份来自于未免疫prrsv疫苗，并经idexx公司prrsv抗体检测试剂盒检测为抗体阴性的猪血清样品，计算出30份阴性血清的s/p值{s/p＝(样品测定孔od450nm值-阴性对照孔平均od450nm值)/(阳性对照孔平均od450nm值-阴性对照孔平均od450nm值)}的平均值和标准差(sd)。s/p值≥时为阳性，s/p值<时为阴性；两者之间为可疑，需重新检测样本，重检时s/p值≥时为阳性，s/p值<时为阴性。6.3特异性试验以建立的判断标准同时检测猪圆环病毒2型(pcv2)、猪瘟病毒(csfv)、伪狂犬病毒(prv)、口蹄疫病毒(fmdv)、脑心肌炎病毒(emcv)和副猪嗜血杆菌(hps)等7种猪病原的阳性血清，同时设prrsv标准阴、阳性对照，确定抗原与其他常见猪病阳性血清是否发生交叉反应。6.4敏感性、特异性和符合率分析用建立的elisa检测方法检测320份不同抗体效价的血清样本，与idexx公司prrsvelisa抗体检测试剂盒的检测结果相比，分析该方法的敏感性、特异性和符合率。相对敏感性(％)＝{阳性数/(阳性数+假阴性数)}×100％相对特异性(％)＝{阴性数/(阴性数+假阳性数)}×100％总符合率(％)＝{(阳性数+阴性数)/检测总数}×100％二、结果2.1目的基因原核表达质粒构建及表达效果的检测将gp5基因(如seqidno.1所示)和合成的gp5/3(如seqidno.2所示)及gp5/3m(如seqidno.3所示)目的基因片段分别克隆至pet-28a载体，获得重组质粒pet-28a-gp5、pet-28a-gp5/3和pet-28a-gp5/3m，基因测序结果均符合设计，gp5/3及gp5/3m目的基因大小均为456bp。将3个重组质粒pet-28a-gp5、pet-28a-gp5/3和pet-28a-gp5/3m分别转化至大肠杆菌bl21，经过iptg诱导表达，sds-page结果显示，pet-28a-gp5质粒不能表达，pet-28a-gp5/3m表达目的效率明显高于pet-28a-gp5/3表达质粒，目的蛋白大小约16kda(图2)，并以包涵体纯化的形式进行表达。2.2gp5/3m原核表达重组蛋白纯化与鉴定将pet-28a-gp5/3m转化至大肠杆菌bl21，经过iptg诱导表达，sds-page鉴定，证明其以包涵体纯化的形式表达。westernblot结果显示，该蛋白与gp5单抗具有较好反应特性。采用包涵体纯化方法提取目的蛋白，大小约16kda，纯度达90％以上(图3)。2.3兔体试验结果2.3.1prrsvelisa抗体效价采用纯化的gp5m重组蛋白免疫家兔，第3次免疫前elisa抗体效价为1:12800，再次免疫后10天心脏采血，分离血清，测定elisa抗体效价，结果为1:51200(表1)。表1间接elisa检测兔抗prrsv血清抗体效价table1determinationoftheantibodytiterofrabbitserumbyindirectelisa2.3.2westernblot反应特性结果见图4，该血清与prrsv浓缩抗原和gp5蛋白重组杆状病毒具有较好反应特性，在相应位置均能曝出条带，而与sf9细胞对照物不反应。2.3.3ifa反应特性取1:10、1:50和1:100三个稀释度的兔抗血清检测prrsv感染marc-145细胞，结果均出现特异性荧光反应(图5)，证明该抗体具有ifa特性。2.3.4病毒中和特性测定将兔抗血清倍比稀释后与200tcid50的prrsvbb0907毒株等量混合，用阴性兔血清作为对照，37作用1h后接种marc-145细胞，观察72h，结果显示，该血清对prrsvbb0907毒株具有中和活性，中和抗体效价为1:8。2.4prrsvgp5间接elisa抗体检测方法的建立2.4.1反应条件的优化通过方阵滴定试验确定了重组gp5m蛋白包被浓度和待检血清稀释倍数，在此基础上对间接elisa各个反应条件进行优化，结果为：用0.05mol/l碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(ph9.6)稀释抗原，包被浓度为10μg/ml，37℃/2h+4℃过夜；5％脱脂乳37℃封闭1h；加入1:100稀释的待检血清，同时设定prrsv阴性血清和阳性血清(1:100倍稀释)，37℃反应1h；以hrp-spa(1:15000)为二抗，37℃作用45min，用tmb显色液，避光37℃/10min，加入硫酸终止液，最后测定od450nm值。2.4.2临界值的确定采用本研究建立的间接elisa方法检测60份来自于未免疫prrsv疫苗，并经idexx公司prrsv抗体检测试剂盒检测为阴性的猪血清，计算得出30份阴性血清s/p值的平均值和标准差分别为sd＝0.036。根据统计学原理，s/p(样本)≥时为阳性，s/p(样本)<时为阴性，介于两者之间时判为可疑。结果显示：当s/p≥0.383时判为阳性，s/p<0.347时为阴性，介于0.347和0.383之间时判为可疑。2.4.3特异性试验用上述方法检测6种猪病原阳性血清，结果均为阴性(表2)，表明该抗原与pcv2、猪瘟csfv、prv、fmdv、emcv和副猪嗜血杆菌抗体均无交叉方法，该方法具有较高特异性。表2特异性试验结果table3resultsofspecificityofindirectelisa2.4.4敏感性采集120份prrsv感染和免疫猪血清，用idexx公司prrsvelisa抗体检测试剂盒的检测结果为阳性，用该方法检测，结果109份为阳性，该方法敏感性为90.83％。2.4.5重复性采用3批抗原按上述方法，同时检测10份prrsv抗体阳性血清和10份阴性血清，结果一致，s/p值差异范围为1.5％～9.5％，均小于10％。2.4.6符合率用本研究建立的elisa方法和idexx公司prrsvelisa抗体检测试剂盒同时检测320份临床猪血清样本，结果见表4，两种方法符合率为91.567％。相对idexx公司prrsvelisa抗体检测试剂盒，该方法相对敏感性和相对特异性为90.56％和92.86％。表3本研究建立的间接elisa检测方法与商品化试剂盒的检测结果比较table4comparisonoftheestablishedindirectelisawithcommercialdetectionkitgp5基因序列1：atgttggggaagtgcttgaccgcgtgctgttgctcgcgattgctttttttgtggtgtatcgtgccgttctatcttgctgtgctcgccaacgccagcaacagcaacagctctcatattcagttgatttataacttaacgctatgtgagctgaatggcacagattggctggcacaaaaatttgactgggcagtggagacttttgtcatcttccccgtgttgactcacattgtttcctatggagcactcaccaccagccatttccttgacacagttggtctagccactgtgtccaccgccggatattatcacgggcggtatgtcttgagtagcatttacgcagtctgtgctctggctgcgctgatttgctttgtcattaggcttgcgaagaactgcatgtcctggcgctactcttgtaccagatataccaacttccttctggacactaagggcagactctatcgttggcggtcacccgtcattgtggagaaagggggtaaggttgaggtcgaaggtcacctgatcgacctcaagagagttgtgcttgatggttccgcggcaacccctttaaccagagtttcagcggaacaatggggtcgtctctaggp5/3基因序列2：agcaacagcaacagctctcatattcagttgatttataacttaacgctatgtgagctgaatggcacagattggctggcacaaaaatttgactgggcagtggagacttttgtcatcttccccgtgttgactcacattgtttcctatggagcactcaccaccagccatttccttgacacagttggtctagccactgtgtccaccgccggatattatcacgggcggggatctaagaactgcatgtcctggcgctactcttgtaccagatataccaacttccttctggacactaagggcagactctatcgttggcggtcacccgtcattgtggagaaagggggtaaggttgaggtcgaaggtcacctgatcgacctcaagagagttgtgcttgatggttccgcggcaacccctttaaccagagtttcagcggaacaatggggtcgtctcgp5/3m基因序列3agcaacagcaacagcagccacatccagctgatttacaacctgaccctgtgcgagctgaacggtaccgactggctggcgcaaaagttcgattgggcggtggaaaccttcgttatctttccggtgctgacccacattgttagctatggcgcgctgaccaccagccactttctggacaccgttggtctggcgaccgtgagcaccgcgggttactatcacggtcgtggatctaagaactgcatgagctggcgttacagctgcacccgttataccaacttcctgctggataccaaaggtcgtctgtaccgttggcgtagcccggtgatcgttgagaagggtggcaaagttgaggtggaaggtcacctgattgacctgaaacgtgttgttctggatggtagcgcggcgaccccgctgacccgtgtgagcgcggaacagtggggccgtctg序列表<110>南京农业大学<120>一种猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5基因修饰的重组蛋白及其应用<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>603<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atgttggggaagtgcttgaccgcgtgctgttgctcgcgattgctttttttgtggtgtatc60gtgccgttctatcttgctgtgctcgccaacgccagcaacagcaacagctctcatattcag120ttgatttataacttaacgctatgtgagctgaatggcacagattggctggcacaaaaattt180gactgggcagtggagacttttgtcatcttccccgtgttgactcacattgtttcctatgga240gcactcaccaccagccatttccttgacacagttggtctagccactgtgtccaccgccgga300tattatcacgggcggtatgtcttgagtagcatttacgcagtctgtgctctggctgcgctg360atttgctttgtcattaggcttgcgaagaactgcatgtcctggcgctactcttgtaccaga420tataccaacttccttctggacactaagggcagactctatcgttggcggtcacccgtcatt480gtggagaaagggggtaaggttgaggtcgaaggtcacctgatcgacctcaagagagttgtg540cttgatggttccgcggcaacccctttaaccagagtttcagcggaacaatggggtcgtctc600tag603<210>2<211>444<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2agcaacagcaacagctctcatattcagttgatttataacttaacgctatgtgagctgaat60ggcacagattggctggcacaaaaatttgactgggcagtggagacttttgtcatcttcccc120gtgttgactcacattgtttcctatggagcactcaccaccagccatttccttgacacagtt180ggtctagccactgtgtccaccgccggatattatcacgggcggggatctaagaactgcatg240tcctggcgctactcttgtaccagatataccaacttccttctggacactaagggcagactc300tatcgttggcggtcacccgtcattgtggagaaagggggtaaggttgaggtcgaaggtcac360ctgatcgacctcaagagagttgtgcttgatggttccgcggcaacccctttaaccagagtt420tcagcggaacaatggggtcgtctc444<210>3<211>444<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3agcaacagcaacagcagccacatccagctgatttacaacctgaccctgtgcgagctgaac60ggtaccgactggctggcgcaaaagttcgattgggcggtggaaaccttcgttatctttccg120gtgctgacccacattgttagctatggcgcgctgaccaccagccactttctggacaccgtt180ggtctggcgaccgtgagcaccgcgggttactatcacggtcgtggatctaagaactgcatg240agctggcgttacagctgcacccgttataccaacttcctgctggataccaaaggtcgtctg300taccgttggcgtagcccggtgatcgttgagaagggtggcaaagttgaggtggaaggtcac360ctgattgacctgaaacgtgttgttctggatggtagcgcggcgaccccgctgacccgtgtg420agcgcggaacagtggggccgtctg444当前第1页12当前第1页12