本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种可以提高基因表达效率的增强元件。
背景技术：
：：随着分子生物学技术的飞速发展，利用细菌获得有科研或商业价值的蛋白质已成为最廉价且简捷的生产方法。在众多的表达体系中，大肠杆菌(escherichiacoli)因其安全性好、生长周期短、生理及遗传学特征明确和操作简单等特点，应用最为广泛。但是，在利用大肠杆菌表达异源蛋白时，会出现不表达或是以不溶性包涵体的形式存在等问题，大大制约了蛋白质的进一步研究和应用。目前，包涵体形式的蛋白主要采用一系列变性复性的方法得到可溶性的活性蛋白，但是，蛋白质复性后仍可能出现错误折叠的现象。近年来，越来越多的研究倾向于直接在大肠杆菌中获得表达量高且具有活性的蛋白质。目前常见的优化技术包括：(1)采用不同的启动子；(2)优化异源蛋白基因的密码子；(3)构建融合蛋白；(4)优化大肠杆菌的生长条件以减缓蛋白质的合成速率等。虽然这些方法能够改善蛋白质的可溶性，但仍然有大量的蛋白质在大肠杆菌的表达系统中无法达到理想的预期产量，甚至根本不表达。因此，构建一个更为有效且广谱的高表达质粒显得尤为重要。为了提高基因的表达效率，发明人基于前期的工作，构建了一种基因表达增强元件，将该元件用于大肠杆菌中外源基因的表达，不仅能够提高基因的表达量，还能够使得蛋白的可溶性表达形式增加，为利用大肠杆菌表达外源蛋白提供了新的思路。技术实现要素：：本发明一方面提供了一种基因表达增强元件ee，该增强元件ee的核酸序列如seqidno.1所示。另一方面，本发明提供了含有增强元件ee的表达盒，所述表达盒包括5’到3’依次连接的启动子和增强元件ee；优选的，在启动子和增强元件ee之间还连接有核糖体结合位点；更优选的，在增强元件ee的3’端连接有多克隆位点区域；优选的，在增强元件ee的3’端连接有目的基因；优选的，目的基因置于多克隆位点区域。在一个实施方式中，本发明所述的启动子选自lac启动子、trp启动子、tac启动子、trc启动子、ipl启动子和t7启动子中的一种或任意组合。另一方面，本发明提供了含有所述基因表达增强元件的重组载体，所述初始载体优选pet表达载体，优选，pet21a、pet11a、pet22b、pet28a、pet29a、petm-11，更优选，petm-11。在一个实施方式中，所述初始载体为petm-11，所述增强元件置于载体t7启动子和多克隆位点之间；优选的，置于核糖体结合位点和多克隆位点之间；更优选的，置于核糖体结合位点和组氨酸标签之间。另一方面，本发明提供了含有基因表达增强元件或所述重组载体的宿主细胞，所述宿主细胞优选原核细胞，更优选，大肠杆菌，更优选，大肠杆菌jm101、jm105、jm109、jm110、bl21、bl21(de3)、bl21(de3)plyss、dh5α，dh5αλpir，top10、rosettalblue(de3)、rosetta(de3)、rosetta(de5)、rosetta(de3)plyss、orgami(de3)、orgamib(de3)、orgami(de3)plyss、rosetta-gami2(de3)plyss、rosetta-gami(de3)、rosetta-gamib(de3)、rosetta-gamib(de3)plyss。另一方面，本发明还提供了seqidno.1所述基因表达增强元件、包含增强元件的表达盒、重组载体或宿主细胞的用途，所述用途为进行基因的表达，所述宿主细胞优选大肠杆菌；在一个实施方式中，所述用途为提高基因的表达效率，优选的，所述表达效率为提高目的蛋白的表达量和/或促进蛋白的可溶性表达；优选的，所述基因为外源基因，更优选的，所述基因为gfp和esed基因。本文所述的“促进蛋白的可溶性表达”是指，更多的重组蛋白以可溶性的形式进行表达，表达得到的总重组蛋白包含沉淀中的重组蛋白和可溶性组分中的重组蛋白。促进蛋白的可溶性表达，意味着，可溶性的重组蛋白占总重组蛋白的比例增多。另一方面，本发明还提供了利用seqidno.1所述基因表达增强元件、包含增强元件的表达盒、载体或宿主细胞表达基因的方法；所述方法包括将目的基因置于seqidno.1所述基因表达增强元件的3’端组成基因表达盒的步骤；优选的，所述方法还包括，将所述基因表达盒连接到表达载体上得到重组表达载体的步骤；更优选的，还包括将所述重组表达载体转化到宿主细胞中进行表达的步骤；更优选的，所述表达载体为pet表达载体；更优选的，所述pet表达载体选自pet21a、pet11a、pet22b、pet28a、pet29a或petm-11；更优选的，所述pet表达载体为petm-11；更优选的，所述宿主细胞为原核细胞；更优选的，所述原核细胞为大肠杆菌；更优选的，所述大肠杆菌为大肠杆菌jm101、jm105、jm109、jm110、bl21、bl21(de3)、bl21(de3)plyss、dh5α，dh5αλpir，top10、rosettalblue(de3)、rosetta(de3)、rosetta(de5)、rosetta(de3)plyss、orgami(de3)、orgamib(de3)、orgami(de3)plyss、rosetta-gami2(de3)plyss、rosetta-gami(de3)、rosetta-gamib(de3)或rosetta-gamib(de3)plyss。优选的，所述基因对于宿主细胞来说是外源基因。另一方面，本发明还提供了重组载体的构建方法，所述方法包括将基因表达增强元件或包含增强元件的表达盒连接到表达载体的步骤；所述连接选择酶切连接和/或pcr融合；优选的，基因表达增强元件置于载体的启动子之后，更优选的，置于启动子和多克隆位点之间，更优选的，置于核糖体结合位点和多克隆位点之间。附图说明：图1：质粒plyj及相关质粒构建示意图。a，质粒plyj构建示意图，其中，rbs：核糖体结合位点；mcs：多克隆位点；ee：基因表达增强元件；b，质粒plyj194和plyj163构建示意图；c，对照组质粒petm-11+gfp和petm-11+esed的构建示意图。图2：gfp和esed在不同质粒中的相对表达水平；其中，gfp采用荧光强度检测，esed采用蛋白量检测。图3：对照组petm-11和实验组plyj中esed表达和纯化电泳图，箭头处为重组蛋白esed的电泳位置，实验组和对照组所采用的表达、纯化、电泳、上样量的条件参数均相同。a，诱导表达后的菌体总蛋白(含可溶性组分以及沉淀不溶组分)，对照组：petm-11，实验组：plyj，采用质粒plyj表达的菌体总蛋白量明显增多，并且，esed的表达量也明显增多。b，诱导表达后的不溶性蛋白，对照组：petm-11，实验组：plyj，采用质粒plyj表达的esed蛋白量明显增多。c，对照质粒petm-11蛋白表达纯化电泳图；d，实验组plyj蛋白表达纯化电泳图；上清：超声破碎后的可溶性总蛋白样品；穿透峰样品：未与镍柱结合的蛋白质样品；纯化样品：最终纯化得到的蛋白质样品；采用质粒plyj表达的可溶性总蛋白量明显增多，并且纯化得到的重组esed蛋白量明显增多。具体实施方式：为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的保护范围。实施例1重组表达质粒的构建1.1基因表达增强元件ee的pcr扩增采用引物ee-1和ee-2扩增基因表达增强元件ee，引物序列见表1，其中，下划线的区域为与质粒petm-11重叠的overlap区域，pcr反应体系如下；扩增基因表达增强元件ee时不需要加入模板，直接利用引物ee-1和ee-2即可实现目的片段的扩增融合，扩增得到的基因表达增强元件ee的5’和3’端分别带有与质粒petm-11重叠的overlap区域。1.2线性质粒petm-11的pcr扩增采用引物petm-11-1和petm-11-2扩增质粒petm-11，引物序列见表1，其中，下划线的区域为与基因表达增强元件ee重叠的overlap区域，pcr反应体系如下，扩增得到的线性petm-11的5’和3’端分别带有与基因表达增强元件ee重叠的overlap区域。表1引物名称和序列1.3基因表达增强元件ee和线性质粒petm-11的连接将1.1.1和1.1.2得到的pcr扩增产物采用sosoocloningkit(tsingeke，北京)进行连接，由于上述pcr产物含有overlap区域，可以在sosoo酶的作用下连接，连接体系如下：连接条件为50℃，30min。连接产物转化后挑取单克隆，筛选并获得正确的重组质粒，命名为plyj，该重组质粒示意图见图1a。由图1a可知，基因增强元件ee连接在了petm-11的rbs(核糖体结合位点)区域和histag区域之间。1.4重组表达质粒的构建将plyj采用ncoi和xhoi双酶切后，分别与目的基因gfp和esed(编码迟缓爱德华氏菌edwardsiellatarda三型分泌系统相关蛋白)连接，构建得到重组质粒分别命名为plyj194、plyj163，重组质粒示意图见图1b。实施例2重组基因的表达2.1重组质粒的转化和表达将重组质粒plyj194和plyj163，对照组质粒(petm-11+gfp和petm-11+esed，分别连接gfp和esed基因的petm-11质粒，重组质粒示意图见图1c)分别转入表达菌株e.colirosetta(de3)，分别得到重组宿主菌如表2所示。表2重组宿主菌以及转入的质粒重组菌转入的质粒e-194plyj194(plyj+gfp)e-163plyj163(plyj+esed)e-gfppetm-11+gfpe-esedpetm-11+esed将活化的单克隆按1/100转培养后，37℃摇床培养至od600nm0.6，向其中加入100μmiptg，20℃诱导20h。2.2重组蛋白的表达检测2.2.1荧光蛋白gfp表达水平检测将诱导后重组菌e-194和e-gfp的1ml菌液于4℃，6000rpm离心5min，弃上清。用1mlpbsbuffer重悬细胞，4℃，6000rpm离心5min，重复该步骤。测定od600nm值和荧光强度，发射光485nm，激发光535nm。2.2.2三型分泌系统蛋白esed表达水平检测将诱导后重组菌e-163和e-esed的100ml菌液于4℃，6500rpm离心15min，弃上清。用20mltrisbuffer(20mmtris,150mmnacl,ph8.0)重悬细胞，4℃，超声破碎后，4℃，6500rpm离心15min。ni-nta纯化蛋白后，测定蛋白质浓度。重组菌e-163和e-esed中重组蛋白esed的纯化步骤如下：用10mltrisbuffer(20mmtris,150mmnacl,ph8.0)与500μl镍柱轻轻轻混后匀，600rpm离心5min，弃上清。重复以上步骤2次。将蛋白样品与镍柱于4℃结合20min后，600rpm离心3min，弃上清。10mlwashbuffer(20mmtris,150mmnacl,20mmimidazole,ph8.0)与镍柱混匀，轻轻震荡10min，离心600rpm3min，弃上清。重复以上步骤2次。用1mlelutionbuffer(20mmtris,150mmnacl,200mmimidazole,ph8.0)冲洗镍柱，收集样品，共收集4管。如图2所示，不管是gfp还是esed，采用plyj质粒的表达量均高于对照组，表达量提高近50％，表明基因增强元件ee(enhancedelement)对于基因的表达具有增强效果，可以提高外源基因的表达量。由图3可知，plyj163与petm-11+esed相比，采用plyj163表达得到的总esed蛋白明显增加；不管是可溶性组分中的esed，还是沉淀组分中的esed，plyj163表达得到的重组蛋白esed量均明显提高；另外，针对可溶性组分进行镍柱纯化，采用plyj163进行表达、纯化，可以得到更多的重组蛋白esed。另外，通过bandscan计算，采用plyj163表达得到的总的重组蛋白esed(含沉淀+可溶性组分)中，可溶性的重组蛋白esed占比为15.9％；而，采用petm-11+esed表达得到的总的重组蛋白esed(含沉淀+可溶性组分)中，可溶性的重组蛋白esed占比为8.5％；也就是说，基因表达增强元件ee不仅能够提高重组蛋白的总表达量，还能促进重组蛋白以可溶性的形式进行表达，提高可溶性重组蛋白在总重组蛋白中的占比。序列表<120>一种基因表达增强元件及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>60<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atataccatgaaagcaattttcgtactgaaacatcttaatcatgcacaggagactttcta60当前第1页12