本发明涉及检测多硫化氢(h2sn,n>1)的荧光探针，具体地说，是一种基于花菁荧光团检测多硫化氢的荧光探针合成及其应用。
背景技术：
作为硫化氢的直接氧化形式，多硫化氢(h2sn,n>1)抗氧化性，细胞保护性以及氧化还原性。多硫化氢通过细胞内一系列的氧化还原信号来调节细胞功能。除此之外，越来越多由硫化氢参与的生理性活动其实际上是由多硫化氢介导的。因此，合理的推断，硫化氢只是多硫化氢生理性活动中所释放的标志物，而多硫化氢可能是实际的信号分子。详尽的了解多硫化氢在正常和疾病状态下的产生、分布和生理功能对阐明细胞信号转导机制有着重要的意义。
由于生物体内环境的多样性和复杂性，因此发展一种选择性好和灵敏度高的分析方法是很有必要的。荧光生物成像技术支撑的可视化研究，在生命分域中扮演非常重要的角色。利用荧光探针高灵敏度、可控开关操作、选择性好、响应时间短等优点，易实现实时原位检测和观察。
liuc.等公开了一种用以检测h2sn的荧光探针dsp-3(结构见图1，liu,c.etal.j.am.chem.soc.2014,136,7257-7260)，与h2sn作用后探针的荧光增强从而检测h2sn的存在。xian,m.等公开了一种基于加成先反应的h2sn的荧光探针1(结构见图1，xian,m.etal.angew.chem.,int.ed.2011,50,10327-10329)，与h2sn作用后探针的荧光增强从而检测h2sn的存在。chen,w.等公开了两种检测总硫烷硫水平的荧光探针ssp1和ssp2，该探针对h2sn检测选择性差(结构见图1，chen,w.etal.chem.sci.2013,4,2892-2896)。但是上述探针合成方法复杂，产率低，耗时耗力。而且这类荧光探针激发发射波长短，检测信号受检测背景干扰严重。不能用于精确地检测活体内的h2sn的存在。因此，开发易于合成、具有良好选择性，激发发射波长处于近红外荧光区的h2sn荧光探针已经成为环境和生命体系中h2sn分析研究必不可少的工具。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种基于花菁荧光团检测多硫化氢的荧光探针合成及其应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种检测多硫化氢(h2sn,n>1)的有机化合物，化合物为基于花菁的有机化合物，结构式如式ⅰ所示，
所述中间体为通式ⅰ所示化合物检测多硫化氢(h2sn,n>1)的中间体，其为式ii所示化合物，
一种检测多硫化氢的有机化合物的应用，所述式ⅰ所示化合物在检测h2sn中的应用。
所述式ⅰ所示化合物作为检测h2sn荧光探针的中的应用。
一种检测多硫化氢的荧光探针，检测h2sn的荧光探针为式ⅰ所示化合物，
所述式ⅰ所示探针用于检测环境、生理条件下、细胞以及活体内的h2sn。
所述荧光探针定性/定量检测h2sn具体为：
将式ⅰ应用于检测h2sn时，其是与测h2sn作用后，生成具有式ii结构的化合物，从而导致荧光强度的改变；
向浓度呈梯度变化的h2sn水溶液中分别加入式ⅰ的hepes缓冲溶液中，而后分别测定加入h2sn前后体系的荧光强度，然后以h2sn溶液的浓度和最大发射波长处的荧光强度值为横坐标、纵坐标作图，根据荧光强度值，即可从图中读出溶液中h2sn的含量。
本发明的有益效果：
本发明化合物采用花菁染料作为荧光母体，该荧光团拥有高量子产率，并且发射波长处于近红外区，可以最大限度地提高组织穿透力，同时最大限度地减少血红蛋白和肌红蛋白中的血红素，水和脂类的吸收。考虑到吸电子基团能猝灭荧光团的荧光，选择含有双亲电位点的2-氟-5-硝基苯甲酸作为光诱导电子转移过程的调制基团，这能够高选择性和高灵敏性的响应h2sn。通过引入酯键将荧光团与识别配体连接。通过光诱导电子转移过程来操纵荧光发射以实现选择性地检测h2sn；利用检测到h2sn后释放荧光团前后导致化合物荧光性质的改变，对整个化合物荧光强度的影响作为识别的检测信号，并将化合物用于检测细胞内h2sn的荧光成像。
本发明化合物可作为用于选择性检测模拟生理环境和细胞内h2sn的荧光探针，此探针可以选择性地与h2sn作用，作用后荧光强度发生明显改变，可实现对h2sn的检测。
本发明化合物用作h2sn荧光探针，在h2sn存在下荧光强度发生变化，可用于h2sn的定性定量检测，提高检测灵敏度。尤其是，这类化合物用作荧光探针，可用于细胞、组织以及活体中h2sn的检测，这对深入研究h2sn在生物体内的产生、输送及累积等过程的动力学机理，进一步了解过h2sn的生理和毒理作用具有重要意义。
附图说明
图1为背景技术中所举的已公开的h2sn荧光探针结构示意图；
图2为本发明探针检测原理示意图；
图3为本发明实施例提供的合成探针bcy-fn的合成路线；
图4为本发明实施例提供的荧光探针对h2sn的选择性示意图；
图5为本发明实施例提供的探针在加入h2sn前后的紫外吸收光谱图；
图6为本发明实施例提供的荧光探针bcy-fn荧光强度随h2sn浓度变化的示意图，插图表示728nm处荧光变化图；
图7为本发明实施例提供的荧光探针bcy-fn用于检测raw264.7细胞外源性h2sn的共聚焦显微镜照片。
具体实施方式
下面结合附图及实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。
本发明化合物如结构式ⅰ所示，以所述化合物作为h2sn的荧光探针。本发明提供了一种可用于选择性检测细胞内h2sn的荧光探针,在h2sn存在下荧光强度发生明显降低,可用于h2sn的检测，并可大大降低外部检测条件的干扰，提高检测精度。这类化合物作为荧光探针可用于细胞内外h2sn水平的检测，这对深入研究h2sn在生物体内的产生、输送及累积等过程的动力学机理，具有重要的生物医学意义。
下述实施例中一些试验条件烦请描述清楚。
实施例1
式ⅰ化合物(探针bcy-fn的合成)：如图3所示，取250ml圆底烧瓶，向其中加入2-氟-5-硝基苯甲酸(185mg,1mmol)和草酰氯(381mg,3mmol)于25ml二氯甲烷中反应4小时，旋干后加入25ml二氯甲烷和式ii化合物(844mg，1mmol)反应12小时。二氯甲烷萃取后有机相旋干，硅胶柱纯化得到式ⅰ所示的化合物bcy-fn。产率43％。
1hnmr(dmso-d6,500mhz)δ(ppm)：8.48-8.42(m,2h),8.07-8.05(m,1h),7.87-7.78(m,7h),7.51-7.50(m,2h),7.38-7.36(m,3h),7.22-7.09(m,3h),6.83-6.82(d,2h),6.24-6.23(d,2h),3.58-3.55(q,2h),3.44-3.42(q,2h),1.37(s,12h),1.26-1.23(t,6h).lc-ms(esi+):m/zc49h44fn3o42+calcd.757.3,found[m]2+378.7.
式ii所示化合物新型荧光团bcy＝o的合成：
如图3所示，取250ml圆底烧瓶，向其中加入乙基苯并吲哚(238.35mg，1mmol)和2-羟基间苯二甲醛(75mg，0.5mmol)，100ml溶剂为甲苯:正丁醇＝1:1(v/v)回流3小时后旋干二氯甲烷萃取，所得粗产物用柱层析色谱分离纯化得式ii所示化合物，所用硅胶为200-300目。(产率76％)1h-nmr：8.53-8.50(d,1h),8.45-8.43(d,1h),8.32-8.12(m,6h),7.86-7.82(m,3h),7.60-7.57(d,1h),7.45-7.42(m,1h),7.25-7.14(m,4h),6.91-6.89(d,1h),6.09-6.07(d,1h),4.87-4.83(q,2h),3.37-3.33(q,2h),2.04(s,6h),1.58(s,3h),1.54-1.51(t,3h),1.29(s,3h),1.19-1.16(t,3h).1c-nmr：182.14,162.76,159.33,153.24,144.89,138.67,138.60,133.89,133.56,131.53,130.73,130.51,130.13,129.85,129.46,129.17,128.89,127.61,127.54,127.30,127.00,124.85,123.55,121.89,121.38,121.16,119.53,116.28,113.52,110.55,109.65,107.67,55.42,54.19,54.06,42.62,37.80,26.12,21.45,14.86,14.36.lc-ms:589.3.
实施例2(bcy-fn对多硫化氢的选择性)：
于10ml比色管中加入10.0μmbcy-fn，再加入10mmhepesph7.4到5ml，摇匀，然后加入各种待测物，最后用ph7.4的hepes定容到10ml。摇匀溶液，平衡10min，将上述溶液倒进荧光皿测定荧光光谱(参见图4)。bcy-fn对多硫化氢的选择性如图4所示,待测物工作液依次为：(1)过硫化钠、(2)四硫化钠、(3)半胱氨酸、(4)同型半胱氨酸、(5)还原型谷胱甘肽、(6)氧化型谷胱甘肽、(7)斜方硫、(8)硫氢化钠、(9)硫代硫酸钠。
由图4的实验结果可以得出，式ⅰ化合物bcy-fn作为探针对多硫化氢有选择性响应，不受其他生物硫醇和含硫化合物的干扰。因此，化合物式ⅰ在生理ph条件下能对多硫化氢有很好的选择性。
实施例3(bcy-fn对多硫化氢的光谱响应)：
测定荧光光谱的条件为：
加入式ⅰ化合物(1mm)到10ml的比色管，用10mmhepes缓冲溶液(ph7.4)稀释到10.0ml，摇匀溶液平衡10min后取1ml于紫外吸收皿中测定400nm-800nm处的紫外吸收光谱。将1ml多硫化氢(100μm)加入上述比色管中配至10ml，摇匀溶液平衡10min后，将比色管中工作液吸取1ml到紫外吸收皿中测定紫外吸收光谱，在400nm-800nm处测定紫外吸收如图5所示。上述式ⅰ化合物可用于实现生物体内多硫化氢的检测，探针与多硫化氢反应后得到式ii化合物。由图5可见多硫化氢的加入引起体系紫外吸收的变化情况，表明多硫化氢浓度的增加，探针的紫外吸收有明显变化。
实施例4(bcy-fn对多硫化氢的定量检测)：
于10ml比色管中加入bcy-fn(加入量)，再加入10mmhepesph7.4到5ml，摇匀，然后加入不同浓度多硫化氢，最后用ph7.4的hepes定容到10ml。定容后多硫化氢浓度：0,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20μm。摇匀溶液，平衡10min，将工作液倒进荧光皿测定荧光光谱(参见图6)。
图6表示随多硫化氢浓度的变化体系荧光强度的变化，表明随多硫化氢浓度的增加，体系728nm荧光强度降低，插图表示在728nm处的荧光强度的随多硫化氢浓度变化的线性拟合曲线，线性拟合曲线的线性回归常数为0.9903，表明探针能定量的测定多硫化氢的浓度。
实施例5(bcy-fn用于细胞外源性多硫化氢检测)：
用5μmbcy-fn孵育正常的raw264.7细胞15min作为对照组，在荧光728nm处的成像结果，如图7a所示；
加入20μm的多硫化氢，以提供外源性多硫化氢。在培养箱中孵育1h，用dmem清洗3遍，随后加入5μmbcy-fn，再在培养箱中孵育15min，再用dmem清洗3遍，进行共聚焦成像，如图7b所示。
如图7a所示，细胞几乎没有荧光；图7b所示，细胞内荧光显著增强。可见bcy-fn能够用于检测细胞中外源性的多硫化氢。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。