本发明涉及一种富含cd41+、cd81+微囊的血小板裂解液制备方法。
背景技术：
血小板在很长时间内被看作是血液中的无功能的细胞碎片，直到1882年意大利医师bizzozero发现它们在血管损伤后的止血过程中起着重要作用，才首次提出血小板的命名也从此开启了探究血小板凝血、止血、维护毛细血管壁完整性历程。现在人们已经认识到，血小板具有重要的功能。
血小板从骨髓成熟的巨核细胞胞质裂解脱落下来的具有生物活性的小块胞质，体积小，直径为2-3微米，无细胞核。血小板具有特定的形态结构和生化组成，在正常血液中有较恒定的数量(如人的血小板数为每立方毫米10～30万)。血小板在生理状态的血小板成静息状态，其胞内溶酶体、致密颗粒和α颗粒含有大量凝血因子、细胞因子、趋化因子、粘附因子、免疫蛋白、呈现一种平衡状态。当血管受损害或破裂时，血小板受刺激，由静止相变为机能相，迅即发生变形，表面粘度增大，凝聚成团；同时在表面第ⅲ因子的作用下，使血浆内的凝血酶原变为凝血酶，从而实现病理状态的血小板激活。大量的细胞因子，包括血小板衍生生长因子(pdgf)，转化生长因子β(tgf-β)，类胰岛素生长因子(igf)，表皮生长因子(egf)，血管内皮生长因子(vegf)等150多种因子和胞外微囊，在激活的过程中从血小板α颗粒中释放出来，起到刺激细胞扩增、伤口愈合、炎症反应、血栓形成、免疫调节等作用。近20年来血小板的作用已被应用于多学科临床实践，包括颌面外科，骨科，心胸外科、神经外科，妇产科、眼科、普外整形美容科等等。
血小板内的细胞因子、胞外微囊可以通过采用胶原，凝血酶，氯化钙，机械损伤，体外裂解等多种形式从血小板中释放出来，而且释放效率和数量因方法不同而结果不同，在未来的应用效果也不尽相同，由于胞外微囊由于其载药能力、富含生长因子在临床应用前景越来越受到科学界的重视。血小板分泌的胞外微囊(ev)直径在30-500nm范围，其中30-140nm大小的也称为外泌体(exosomes)，体积150nm以上的也被成为血小板微粒(mps)，由于其富含细胞因子和有效物质细胞内外传递作用，因此二者均有组织再生修复功能，并且组织修复能力的大小和微囊含量正相关。目前常用在临床的方法为采用凝血酶和钙离子进行激活，而这种方法对血小板分泌物，特别是有再生修复能力的cd41+、cd81+微囊释放浓度低于10μg/ml，血小板裂解液中微囊的含量少，从而并未实现血小板的再生修复功能的最佳状态。
技术实现要素：
本发明的目的是为了提高血小板裂解液中cd41+、cd81+微囊的含量，提供了一种富含cd41+、cd81+微囊的血小板裂解液制备方法。
本发明一种富含cd41+、cd81+微囊的血小板裂解液制备方法按以下步骤进行：一、用聚焦式体外冲击波仪以频率15hz，能流密度0.15～0.20mj/mm2，室温下冲击富含血小板血浆或富含血小板生理盐水200-500次后，37度孵育10-15分钟；
二、再以频率15hz，能流密度0.20～0.25mj/mm2，室温下冲击700-1000次，37度孵育20-30分钟；
三、然后以频率15hz，能流密度0.25～0.30mj/mm2，室温下冲击1500-2000次，37度孵育10分钟，得到悬液；
四、将步骤三的悬液放入密封冻存管中，放入液氮冷冻20-40分钟，取出后放入水浴摇荡融解，重复操作4-6次，然后进行离心，取上清液，再用针头过滤器过滤上清液，收集滤液，得到富含cd41+、cd81+微囊的血小板裂解液。
本发明的有益效果：
本发明获得富含血小板微囊方法为物理方法，没有外源添加的凝血酶、胶原或者ca离子等生物化学成分，因此方法简便，应用过程不会因为异体蛋白引起的过敏反应，不会因为ca离子的介入改变局部ph而造成的不适反应。本发明与超声波、微波方法不同，超声波、微波方法在强大的声波和电磁波下，血小板的内外膜结构均有破坏，可以释放大量的血小板细胞因子，但是破坏了亚细胞膜结构的微囊化形成。本发明采用了多级冲击波刺激法充分血小板中的cd41+、cd81+微囊以及血小板内的细胞因子。血小板亚细胞膜结构经冲击后，释放更多的30-300nm的微囊和细胞因子，从而起到血小板内再生修复作用的内容充分物释放的作用，本发明的血小板裂解液中含有的微囊浓度为120μg/ml，微囊总蛋白为7-9μg/ml，有69.33±2.33％微囊粒径集中在30-150nm范围，15.10±3.20％微囊粒径集中在150-300nm范围，本发明获得的微囊以粒径小的外泌体为主，预期其再生修复功能会更强。
附图说明
图1为实施例一微囊的浓度nta分析图；
图2为实施例一微囊的粒径nta分析图；其中a为对照组、b为凝血酶组、c为本发明组；
图3为实施例一制备的血小板裂解液中微囊总蛋白和表面标记表达情况图；其中a为对照组、b为凝血酶组、c为本发明组；
图4为实施例一中pdgf-ab和tgf-β在血小板裂解液和微囊上的含量测定；其中a为对照组、b为凝血酶组、c为本发明组；
图5为实施例一中bfgf和vegf在血小板裂解液和微囊上的含量测定；其中a为对照组、b为凝血酶组、c为本发明组；
图6为实施例一sd大鼠注射stz建立i型糖尿病模型中伤口恢复情况。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式之间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式一种富含cd41+、cd81+微囊的血小板裂解液制备方法按以下步骤进行：
一、用聚焦式体外冲击波仪以频率15hz，能流密度0.15～0.20mj/mm2，室温下冲击富含血小板血浆或富含血小板生理盐水200-500次后，37度孵育10-15分钟；
二、再以频率15hz，能流密度0.20～0.25mj/mm2，室温下冲击700-1000次，37度孵育20-30分钟；
三、然后以频率15hz，能流密度0.25～0.30mj/mm2，室温下冲击1500-2000次，37度孵育10分钟，得到悬液；
四、将步骤一的悬液放入冻存管中，放入液氮冷冻20-40分钟，取出后放入水浴摇荡融解，重复操作4-6次，然后进行离心，取上清液，再用针头过滤器过滤上清液，收集滤液，得到富含cd41+、cd81+微囊的血小板裂解液。
本实施方式通过血小板采集机、外周血多次离心浓缩、或者外周血淋巴细胞分离液浓缩获得的富含血小板血浆或者富含血小板生理盐水。血小板来自成人的静脉血、动脉血、脐带血、胎盘血或者动物的血液。
本实施方式的有益效果：
一、本实施方式获得富含血小板微囊方法为物理方法，没有外源添加的凝血酶、胶原或者ca离子等生物化学成分，因此方法简便，应用过程不会因为异体蛋白引起的过敏反应，不会因为ca离子的介入改变局部ph而造成的不适反应。
二、本发明与超声波、微波方法不同，超声波、微波方法在强大的声波和电磁波下，血小板的内外膜结构均有破坏，可以释放大量的血小板细胞因子，但是破坏了亚细胞膜结构的微囊化形成，其再生修复能力也会减弱。
三、本实施方式采用了多级冲击波刺激法充分血小板中的cd41+、cd81+微囊以及血小板内的细胞因子。血小板亚细胞膜结构经冲击后，释放更多的30-300nm的微囊和细胞因子从而起到血小板内再生修复作用的内容充分物释放的作用。
四、本实施方式的血小板裂解液中含有的微囊浓度为120μg/ml，有69.33±2.33％微囊粒径集中在30-150nm范围，15.10±3.20％微囊粒径集中在150-300nm范围，本实施方式获得的微囊以粒径小的外泌体为主，预期其再生修复功能会更强。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中富含血小板血浆或者富含血小板生理盐水中血小板浓度为(6～15)×105个/μl。其他与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一、二和三中孵育均是在37℃的co2培养箱中进行的。与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中用聚焦式体外冲击波仪以频率15hz，能流密度0.18mj/mm2，冲击富含血小板血浆或富含血小板生理盐水400次后，孵育12分钟。其他与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二中再以频率15hz，能流密度0.22mj/mm2，冲击800次，孵育25分钟。其他与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三中以频率15hz，能流密度0.26mj/mm2，冲击1500次，孵育10分钟，得到悬液。其他与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤四中放入液氮冷冻30分钟。其他与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤四中放入38℃水浴中摇荡融解。其他与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤四中的离心是在4℃、2500xg条件下离心20min。其他与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤四中用0.22μm针头过滤器过滤上清液。其他与具体实施方式一至九之一相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一：一种富含cd41+、cd81+微囊的血小板裂解液制备方法按以下步骤进行：
一、用聚焦式体外冲击波仪以频率15hz，能流密度0.18mj/mm2，室温下冲击富含血小板血浆或富含血小板生理盐水400次后，37度孵育12分钟；
二、再以频率15hz，能流密度0.22mj/mm2，室温下冲击800次，37度孵育25分钟；
三、然后以频率15hz，能流密度0.26mj/mm2，室温下冲击1500次，37度孵育10分钟，得到悬液；
四、将步骤一的悬液放入冻存管中，放入液氮冷冻30分钟，取出后放入38℃水浴摇荡融解，重复操作5次，然后在4℃、2500xg条件下离心20min，取上清液，再用0.22um针头过滤器过滤上清液，收集滤液，得到富含cd41+、cd81+微囊的血小板裂解液。
本实施例通过血小板采集机获得的富含血小板血浆，其来源于动物的血液，步骤一中富含血小板血浆或者富含血小板生理盐水中血小板浓度为(6～15)×105个/ul。
将制备完成的富含cd41+、cd81+微囊的血小板裂解液在4℃经过600xg、12min，离心，2200xg、18min离心，清除细胞碎片和亚细胞结构的碎片，上清液在4℃、100，000xg超速离心1h获得全部微囊沉淀，沉淀经pbs悬浮后，成为收获的血小板裂解液微囊悬液。采用bca蛋白分析试剂盒(pierce)方法测定微囊总蛋白；通过纳米颗粒示踪分析方法(nta)，在638nm，40mw激光下捕捉微囊浓度和粒径分布方法；cd41、cd81表面标记的测定通过westernblot方法；细胞因子检测采用elisa各种因子相对应的试剂盒方法。
通过微囊的浓度nta分析可以看出(图一)，采用对照组和凝血酶组，其获得微囊浓度低于10μg/ml，而经过本发明组的处理血小板裂解液中含有的微囊浓度为120μg/ml，显著高于其他两组。
从(图二)获得的微囊的粒径经nta方法分析，通过本实施例和其他两组获得的微囊粒径均主要分布在20-150nm和150-300nm范围，但是采用本发明方法获得的微囊有69.33±2.33％微囊粒径集中在30-150nm范围，15.10±3.20％微囊粒径集中在150-300nm范围。而对照组和凝血酶组中分布在两个粒径范围的细胞基本接近，都是在35％-49％之间。由此可见，本发明方法获得的微囊以粒径小的外泌体为主，预期其再生修复功能会更强。
如(图三)所示，经过冲击波逐级激活后获得的血小板裂解液中含有的微囊总蛋白为平均8.73±0.22μg/ml，明显高于直接裂解对照组(5.30±0.20μg/ml)和经过传统凝血酶和cacl2激活组(4.27±0.31μg/ml)。微囊上cd41表达率是对照组的2.3倍、凝血酶组的3.1倍，微囊上cd81表达率是对照组的3.2倍、凝血酶组的4.2倍。
本实施例为了分析血小板胞外微囊和血小板细胞因子的存在情况，分析了pdgf-ab、tgf-β、bfgf、vegf四种因子在获得的血小板裂解液中存在的总含量以及其存在微囊中的含量。通过分析本实施例获得的血小板裂解液中总体的pdgf-ab(图四)、tgf-β(图四)、bfgf(图五)、vegf(图五)和微囊中的pdgf-ab(图四)、tgf-β(图四)、bfgf(图五)、vegf(图五)含量，发现本实施例组获得的相应的细胞因子总量均显著大于对照组和凝血酶组，且大部分血小板裂解液中的细胞因子都存在于微囊中，说明血小板裂解液的功能主要来自这些微囊，而通过本发明获得富含微囊的血小板裂解液就是获得了大量的细胞因子，从而可以更好地发挥其再生修复功能。
采用sd大鼠注射stz建立i型糖尿病模型进行修复功能验证，在大鼠背部两侧去毛，各剪掉1*1cm2全层皮肤，皮肤创伤外侧采用医用硅胶圈缝合，制造难那愈合皮肤创面。
1)对照组：碘伏消毒处理，医用纱布包扎，每三天消毒换一次药在伤口周围和伤口中间，每间隔3mm注射0.1ml的对照组制剂；
2)凝血酶组：难愈合伤口周围皮肤创伤处，每间隔3mm注射0.1ml凝血酶组制剂；
3)本发明组：难愈合伤口周围皮肤创伤处，每间隔3mm注射0.1ml富含cd41+cd81+微囊的本发明组制剂；
4)定期测量、拍照伤口情况与不治疗的模型组进行对比。
三组动物经制剂注射后，在3m透气透明敷料外侧用凡士林纱布进行包扎，每隔一周进行随访，每次随访中拆去包扎材料，对伤口面积以及恢复情况进行拍照。结果可见图6，在治疗7天后随访，本发明组动物伤口明显减小(0.7*0.7cm2)，而其他两组未见明显变化(接近1*1cm2)；治疗14天后随访，虽然对照组(0.5*0.5cm2)和凝血酶组(0.7*0.7cm2)动物伤口有明显的缩小，但是本发明组动物伤口缩小最为显著(0.3*0.3cm2)，因而采用含有丰富cd41+cd81+微囊的裂解液对皮肤损伤修复最为显著。
实施例二：一种富含cd41+、cd81+微囊的血小板裂解液制备方法按以下步骤进行：
一、用聚焦式体外冲击波仪以频率15hz，能流密度0.20mj/mm2，室温下冲击富含血小板血浆或富含血小板生理盐水300次后，37度孵育12分钟；
二、再以频率15hz，能流密度0.25mj/mm2，室温下冲击900次，37度孵育25分钟；
三、然后以频率15hz，能流密度0.30mj/mm2，室温下冲击1500次，37度孵育10分钟，得到悬液；
四、将步骤一的悬液放入冻存管中，放入液氮冷冻30分钟，取出后放入38℃水浴摇荡融解，重复操作5次，然后在4℃、2500xg条件下离心20min，取上清液，再用0.22um针头过滤器过滤上清液，收集滤液，得到富含cd41+、cd81+微囊的血小板裂解液。
本实施例通过血小板采集机获得的富含血小板血浆，其来源于动物的血液，步骤一中富含血小板血浆或者富含血小板生理盐水中血小板浓度为(6～15)×105个/ul。
本实施例血小板裂解液中含有的微囊浓度为120μg/ml，微囊总蛋白为8μg/ml
实施例三：一种富含cd41+、cd81+微囊的血小板裂解液制备方法按以下步骤进行：
一、用聚焦式体外冲击波仪以频率15hz，能流密度0.15mj/mm2，室温下冲击富含血小板血浆或富含血小板生理盐水500次后，37度孵育15分钟；
二、再以频率15hz，能流密度0.20mj/mm2，室温下冲击1000次，37度孵育30分钟；
三、然后以频率15hz，能流密度0.25mj/mm2，室温下冲击2000次，37度孵育10分钟，得到悬液；
四、将步骤一的悬液放入冻存管中，放入液氮冷冻30分钟，取出后放入38℃水浴摇荡融解，重复操作5次，然后在4℃、2500xg条件下离心20min，取上清液，再用0.22um针头过滤器过滤上清液，收集滤液，得到富含cd41+、cd81+微囊的血小板裂解液。
本实施例通过血小板采集机获得的富含血小板血浆，其来源于动物的血液，步骤一中富含血小板血浆或者富含血小板生理盐水中血小板浓度为(6～15)×105个/ul。
本实施例血小板裂解液中含有的微囊浓度为120μg/ml，微囊总蛋白为7μg/ml。
综上所述，本实施例采用了多级冲击波刺激法充分血小板中的cd41+、cd81+微囊以及血小板内的细胞因子。血小板亚细胞膜结构经冲击后，释放更多的30-300nm的微囊和细胞因子从而起到血小板内再生修复作用的内容充分物释放的作用。