获得无标记转基因植物的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种获得无标记转基因植物的方法。

背景技术

目前，转基因技术广泛的用于基因功能的研究，随着商业化转基因植物新品种的不断出现,人们对转基因植物安全性问题的争论和担忧日益增加。crispr/cas9技术是新兴的基因编辑工具，可以在特定位点产生dsb，借由生物体对dna的修复过程中，可能产生插入、缺失、替换等现象，从而定点获得突变体，随着基因编辑技术的不断优化，crispr/cas9技术用于基因敲除已经相当完善，但是cas9系统产生靶向敲除之后对于植物本身的生长发育并没有改善，反而是cas9的存在增加了脱靶的概率，对于商品生产来说是不稳定因素。对于一年生植物来说在生殖过程中存在一定的几率自然分离掉marker基因/cas9编码基因，但是自然发生的概率相当小不能应用于生产中，且对于多年生经济作物来说，很难得到无转基因成分植株。目前人们通过转座途径、染色体内同源重组、目标基因与标记基因共转化、位点专一性重组等措施来剔除外源基因。

本发明基于目前广泛应用的crispr/cas9技术，以特异表达启动子(愈伤组织不表达)驱动cas9表达，并且除原有敲除位点之外，在t-dna插入序列两端额外设计两个靶位点，经农杆菌介导转化后，在特异时期表达的cas9蛋白通过靶向敲除靶点在植物基因组产生突变，同时t-dna出去边界靶点，经过cas9剪切也产生dsb，使得t-dna插入序列从基因组上去除，产生非转基因突变体植株。随着基因敲除技术的广泛应用，构建突变体库用于基因研究，但是由于基因敲除得到的突变体存在一定的安全问题，国家对于转基因的界定还不明朗，对于基因敲除构建的转基因突变库的应用在生产育种中显得不太方便，并且通过转基因植物自体繁殖分离转基因成分效率低下，且对于多年生植物，以及无性繁殖的植物来说不能分离转基因成分。本发明可以经过一代获得不含cas9蛋白，标记基因等外源序列的突变体，方便快捷。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种获得无标记转基因植物的方法，以解决现有技术中，以解决现有技术中获得无标记转基因植物操作繁琐的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种获得无标记转基因植物的方法。该方法通过crispr/cas9或crispr/cpf1系统实现，crispr/cas9或crispr/cpf1系统的载体中包含基因编辑蛋白基因、靶向载体自身的sgrna和特异时空表达基因启动子，特异时空表达基因启动子在愈伤组织时期不表达，待完成遗传转化后表达基因编辑蛋白基因。

进一步地，启动子具有如loc_os07g01820所示的核苷酸序列。

进一步地，基因编辑蛋白基因为cas9基因或cpf1基因。

进一步地，载体还包含配套的cas9基因或cpf1基因的元件。

进一步地，载体为双元表达载体。

进一步地，双元表达载体为pcambia1300。

进一步地，植物包括水稻、小麦、马铃薯、红薯、杨树和柑橘。

应用本发明的技术方案，操作简单，主要针对农作物或经济植物，尤其是多年生，无性繁殖的植物，通过剪切载体本身，产生大片段转基因成分的丢失，意义重大。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了本发明的实验原理及流程示意图；

图2示出了本发明一种典型的实施方式中的载体基本元件。

图3示出了实施例1中t1代小苗根尖荧光显微镜下观察图；

图4示出了实施例1中pcr检测结果电泳图；以及

图5示出了实施例1中测序结果示意图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

本发明基于目前广泛应用的crispr/cas9技术，构建一个含有目的基因以及特异时期表达基因启动子驱动cas9系统元件的表达载体，经农杆菌介导转化后，在特异时期表达的cas9蛋白通过靶向标记基因以及通过设计靶向载体自身的sgrna，指引cas9在靶向位点产生切割cas9系统元件边界，产生双重切割，使得包括标记基因以及cas9元件在内的大片段缺失，产生无标记转基因植株。

本发明的无标记转基因系统，除产生目的敲除之外，还可以通过靶向cas9元件达到自体删除的目的。

本发明基于cas9系统改造的无标记/非转基因系统，载体构建方便快捷，无需杂交，二次转化，依靠t0代植株自交就可以得到无标记/非转基因植株。

本发明通过特异启动子驱动cas9蛋白的表达，使得cas9不在转染过程中的愈伤组织表达，使得标记基因发挥筛选功能，富集阳性细胞，得到转基因植株。根据需要设计载体结构，在想要缺失的大片段两侧设计靶位点(靶位点选择在要删除的序列两侧)，在生殖发育时期表达的cas9蛋白靶向大片段两侧，产生dsb(双链断裂)，两缺口之间的大段序列丢失。通过dna自我复制，黏连缺口，从而把非靶标序列从植物基因组中剔除。得到想要的无标记(主要针对基因过表达)、非转基因(针对基因编辑，突变等)植株。如图1所示，载体转入愈伤组织，经潮霉素筛选后获得阳性转化子，后期经过特异启动子驱动的cas9产生切割，缺失大片段从而获得无标记转基因植株，无标记转基因植株的子代仍为无标记转基因植株。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种获得无标记转基因植物的方法。该方法通过crispr/cas9或crispr/cpf1系统实现，crispr/cas9或crispr/cpf1系统的载体中包含基因编辑蛋白基因、靶向载体自身的sgrna和特异时空表达基因启动子，特异时空表达基因启动子在愈伤组织时期不表达，待完成遗传转化后表达基因编辑蛋白基因。

应用本发明的技术方案，操作简单，主要针对农作物或经济植物，尤其是多年生，无性繁殖的植物，通过剪切载体本身，产生大片段转基因成分的丢失，意义重大。

优选的，启动子具有如loc_os07g01820(seqidno：1)所示的核苷酸序列。

seqidno：1:

tccgatcgagctagtcctgtgcccgtaccatgacggagccgatcctctccattcaaagggaatatgatgagagagtagtggggaatcggtttttgcaatcaattagaggaggaaacgcatggagagacaaatcgacgtggcggtggcgctagggttcagcccgacgaaaaaaccacgaaaaaaatagagacaaaagaaagaaacccgaaaaccggtgaaagaaaaaaaagagggaacagtgaaaagaaaagaaaaaaaaggaaaacggtgaaaaataaaataaaacggaaaaagatgggaaaaaagaaaaacaggcgaaaattataggtggaagcatatgtattttttattaggtatagatttctagattctatagcttttgatccttgtaatctagatgaaaagcttacgggcctctttgatttagaggataaacataggaattttggagaattttaatcctatataaaaaaattatataaatacatttgaaacaaaagattgaatcctatcatatcctatcctattaaagtcctatggaatgaacaattctacagagattttggcggaaatttagcaagagcttcaacctcttggaaattttcctttgagtctatctctcttatccgattcgtactttttcctatggtttaatcaaatggttatttctaagatttcctgtgttttacaatcctctgttatgcacgaactccaagaagttatgtgttataaggttcacatcctctgttagtagttgactgtactattaaactataccattaatagcatagccaactattaacttcacatcatctatcaaaaactctctaaaagacagggccacatactcagggggtgtttagatccaggggtgtaaagttttggcgtgtcatatcggatattatatagggtgtcgcatggggtgtttgacactaataaaaaaactaattacagaatccgtcagtaaaccgcgagacaaatttattaagcctaattaatcagtcattagcaaaggtttactgtagtaccacattgtcaaatcatgtagcaattaggcttaaaagatttgtctcgcaaattagtcgcaatctgtgcaattagttattttttagcctatgtttaatacctcatgcatgtgttcgatatgacggggtgtaaaattttgggtgggatctaaacatggcctcattaaaaccaaccattgacaaggtctagtgtggatgtaaagtgtgtaaactagagtgctctgtatgtaaagatgactaattttatactccctccgttccaaaataagtgcagttttagcattgttcatgtccaacgtttgactgtttgtcttatttgaaatttttttataattactacttttattgttattagatgataaaacatgaatagtactttatgtgtgactaattttttttaatatttttcataattttttcaaataagacgggtggtcaaaacaatgaacacggatatctatggctgaacttattttgagacggaggtagtacaattattgtattgggtatatatatcatttgtgcaactactagtatacatacgtagtactccctccgtcccatagtgttgcaacctaggatgggatgagatacatcaaaccatcctaggactacgaatttggacatgattcgtagtcctaggatgggtctcatcccatcctaggttgcaacattatgggacggacggagtcctatatatgtaggccatgctctcggggagagagagagagagagagagagagagagagagagagaggggccaattggtgttgcgatcgaggctaggtcaggtcatgacgcaatgcaaatgttatatggaatggatcagagtgatagaggagagagctgtcgagctgggattgcagcatctccagcgccaggagcaccagttgccgtaaacaacaccacacagtttttcccaccaaatataaaagatctttcttggcacagtgcgttcaacagttgcaagcaataatattattggctaattagtactgacttttattaatattcgcctattatacaattgataccacctccgatccattcctaaatatactgaccaatgtcatatgaaaaaagaatagagagagtagtaattaatgaactatatcagtgaacattgacagacaaaaataaaatcatactagccatactgtgcaaaaagcaccatatataatttgaaaacgaccggtatagtttacactcatatatactactccatccgtttcagtttataatgcattttgactttagtcaaagttaaactgttttaagtttaactaagtttgtagacaaatataataatatttataatactaaattaattagagtcatcaaattaacaattgaatatattttcataataaatttatcttggattgaaaagtcaaaacgtaatttgactttgaccaaagtcaaaacgtcttattataatggagtaactttgtaaatcacacttgagtgtattgcgtgatttcttaggatgctacgctatctcacaagcgacttacgtactataaattaatgcagtgaacatacttagagagttgaattttaccacgatttaatttcgatggactaattaaagaaaatctcaaggtttcgaaaacgacatggtacgtcgtgcgcgtatatgtaactattgaccatgtattcatatgcacgaattggtacaaaagggtgcacaaattctgcaataactgttggaaatgtatatatattcatacatatgtgtgtacactgctctctccatctctaaaataccttatactccctccatttcatattgtaagactttctagcattgtttatatttatatagatgttaatgaatttagacacacacacacacacacacacatatatatatatatatatatatatatatatatatatatattcattaacatatatatgaatgtggccaatgctaaaaattcttacattgtgaaacggatgaagtagtatttagctggtctcagatatattagtatggttgtgaaaagacgaatatgcacttcattaagattatatgcttctattatactacatgtttagctagacttttggcatgcccaagctctaacaaatgatttttgcacctaaatcgatttcaattaggtgggcgagagtggggtttaaccaatagagataaaataaggacaataaaaacagctagtggaccacatatctccacacgtctcttaaaaaaagatttattttacaactgaatttgaagataaggtattttgtaattgagaaagtaaataccaatatactccctccggttatttatatttatatttagcgttagaaaagttaaacttagttttcccatctttaaatatatatagtgaatggatcgtatcgtaaaaaaaaagacaaccggattatagttaaataattggccatgtattgatatggtgcaaattaacaaaatttcgcagtaatgattggccatgtattcatgtgtacatttatcaatatatcaataaaaaagacaagaggataataatagtaataataaagaaatggagaaaaggagtcgaggggttgggagttcgaccgtacgaggaggtagcatagcagcagaatcgaccccaagctttccttctcacgtaacatgccgttattatattatatatattaaaataattaatccaattattttttaccagattaatattaatgtaatccgtgtgtcagcaggcttgagaggctgcaggtgggccccatgattccgggaccaatcacagctcgacagcatactgacacccgtccccaaaagcaaagaggcctctctctctctctctcgccgatccctctcctcctcctcttcttcttcttccactagctagttcgtcttcctccttcagctagcttgtagcagctaaggttaggtcggatcgagatcgggatcggccgccggcgagcggcgagcggcgagg

根据本发明一种典型的实施方式，基因编辑蛋白基因为cas9基因或cpf1基因，当然也可以是其他能够实现类似的基因编辑的蛋白基因。

优选的，载体还包含配套的cas9基因或cpf1基因的元件，方便后续操作。在本发明一种典型的实施方式中，如图2所示，载体基本元件包括潮霉素抗性元件，grna元件，mads15驱动cas9系统和gfp报告基因。

根据本发明一种典型的实施方式，载体为双元表达载体，优选为pcambia1300。

根据本发明一种典型的实施方式，用于获得无标记转基因植物的植物包括水稻、小麦、马铃薯、红薯、杨树和柑橘等。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

实施例1

1.载体构建

以pc1300-cas9为载体，bamhi/ncoi进行双酶切，线性化载体。以水稻dna为模板，引物

m15-p-f(seqidno：2):

5’-cgagctcggtaccaaggatccgaaaagcttacgggcctctttga-3’

m15-p-r(seqidno：3):

5’-tcttcttcttaggggccatggtctctatccgcttcagctgcacc-3’

扩增loc_os07g01820基因启动子区域3614bp序列，gibson连接构建pc1300-mads15p-cas9。

pmei酶切pc1300-mads15p-cas9载体，引物

cas-hgfp-f(seqidno：4)：

cgtttcccgccttcagtttaaactgccacctgacgtgagctcggta

cas-hgfp-r(seqidno：5)：

tgtcaaacactgatagtttaaaccggtgtgagggaactagttttgat

扩增2x35s驱动的gfp元件序列，t4连接，构成pc1300-mads15p-cas9-gfp载体。按照crispr-cas9系统对靶序列的要求(pam(protospaceradjacentmotif)为ngg，序列长度为22bp)，在pc1300-mads15p-cas9-gfp序列上选择特异4个靶序列，并根据grna引物设计原则，在f向引物和r向引物两端加上酶切连接碱基，设计好的引物命名为g1-f/r，g2-f/r，g3-f/r，g4-f/r。序列如下：

g1-f(seqidno：6)：ggcaacatgagcgaaaccctat

g1-r(seqidno：7)：aaacatagggtttcgctcatgt

g2-f(seqidno：8)：ggcaggcgtcggtttccactat

g2-r(seqidno：9)：aaacatagtggaaaccgacgcc

g3-f(seqidno：10)：ggcagctggcgtaatagcgaag

g3-r(seqidno：11)：aaaccttcgctattacgccagc

g4-f(seqidno：12)：ggcaacagttgcgcagcctgaa

g4-r(seqidno：13)：aaacttcaggctgcgcaactgt

将设计好的g1-f/r,g2-f/r,g3-f/r,g4-f/r引物分别在100℃条件下退火5分钟，自然冷却，将退火产物与经过aari酶切的中间载体sk-grna连接，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子的质粒，经测序证明正确，得到4个中间载体命名为sk-g1，sk-g2，sk-g3，sk-g4。以kpni/bamhi酶切sk-g1作为载体，以kpni/sali酶切sk-g2；xhoi/nhei酶切sk-g3；xbai/bglii酶切sk-g4；分别回收3个542bp目的片段，t4酶连接得到sk-g1g2g3g4-grna载体。用kpni和bglii双酶切sk-g1g2g3g4-grna，回收含grna的大小为2072bp目的片段，与经过kpni和bamhi双酶切的载体pc1300-mads15p-cas9-gfp连接，得到最终载体pc1300-g1-g2-g3-g4-mads15p-cas9-gfp。

2x35s序列seqidno:14

ccctactccaaaaatgtcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttcaacaaagggtaatttcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcgaaaggacagtagaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcattcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgacatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccacccctactccaaaaatgtcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttcaacaaagggtaatttcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcgaaaggacagtagaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcattcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgacatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacagcccaagcttgtcgacggatccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggtgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccttcacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactcacggcatggacgagctgtacaagtaacccg

sk-g1g2g3g4-grna序列seqidno:15

ctgacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattgggtaccgaggatcctctagactcgaggattatgtggaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaacttcaggctgcgcaactgttgccacggatcatctgcacaactcttttaaatcagctttgatctatgtggatagccgaggtggtactaatactagtctttgttgtcgtccaattgcgtaatgggccggcccatactgcaatacatgtcctgaaaggcttcatggcccactacgaaatgcttttctcctacagtttatcttacttcttcacatcacgtggtttccgacgtacccagtgttcccggcttccagcatttgctggtagcaccagtagaagacgcctgtcttgtgctatggtccctgactgcacatctgattcctccaagatccatgcatgcctgataactttaagttgcttcagaagaactttaagtgatctgttcgtatgtttaaagattccttaatcgtcgacgctagcagatcctctagactcgaggattatgtggaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaaccttcgctattacgccagctgccacggatcatctgcacaactcttttaaatcagctttgatctatgtggatagccgaggtggtactaatactagtctttgttgtcgtccaattgcgtaatgggccggcccatactgcaatacatgtcctgaaaggcttcatggcccactacgaaatgcttttctcctacagtttatcttacttcttcacatcacgtggtttccgacgtacccagtgttcccggcttccagcatttgctggtagcaccagtagaagacgcctgtcttgtgctatggtccctgactgcacatctgattcctccaagatccatgcatgcctgataactttaagttgcttcagaagaactttaagtgatctgttcgtatgtttaaagattccttaatcgtcgacgctagactcgaggattatgtggaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaacatagtggaaaccgacgcctgccacggatcatctgcacaactcttttaaatcagctttgatctatgtggatagccgaggtggtactaatactagtctttgttgtcgtccaattgcgtaatgggccggcccatactgcaatacatgtcctgaaaggcttcatggcccactacgaaatgcttttctcctacagtttatcttacttcttcacatcacgtggtttccgacgtacccagtgttcccggcttccagcatttgctggtagcaccagtagaagacgcctgtcttgtgctatggtccctgactgcacatctgattcctccaagatccatgcatgcctgataactttaagttgcttcagaagaactttaagtgatctgttcgtatgtttaaagattccttaatcgtcgaggattatgtggaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaacatagggtttcgctcatgttgccacggatcatctgcacaactcttttaaatcagctttgatctatgtggatagccgaggtggtactaatactagtctttgttgtcgtccaattgcgtaatgggccggcccatactgcaatacatgtcctgaaaggcttcatggcccactacgaaatgcttttctcctacagtttatcttacttcttcacatcacgtggtttccgacgtacccagtgttcccggcttccagcatttgctggtagcaccagtagaagacgcctgtcttgtgctatggtccctgactgcacatctgattcctccaagatccatgcatgcctgataactttaagttgcttcagaagaactttaagtgatctgttcgtatgtttaaagattccttaatcgtcgacgctagcagatctgcggccgccaccgcggtggagctccagcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccac

靶位点：

2、植株转化：转基因植株的获得

将上述获得的pc1300-g1-g2-g3-g4-mads15p-cas9-gfp双元载体转入根癌农杆菌eha105中，得到重组菌1。提取重组菌1的质粒送去测序，结果该质粒为pc1300-g1-g2-g3-g4-mads15p-cas9-gfp，将含有该质粒的重组菌1命名为eha105/pc1300-g1-g2-g3-g4-mads15p-cas9-gfp。

将成熟胚脱壳灭菌，接种到诱导愈伤组织的培养基中。培养3周后，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织，用作转化的受体。

将上述重组菌eha105/pc1300-g1-g2-g3-g4-mads15p-cas9-gfp转入到受体植株日本晴的愈伤组织中，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/l潮霉素的选择培养基上筛选抗性转基因植株。筛选抗性愈伤在含有50mg/l预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。大田种植t0代植株，成熟后收获种子，发苗得到t1代水稻。

3.gfp信号检测

取t1代小苗根尖在荧光显微镜下观察，结果发现转基因植株根尖绿色信号明显(图3)，表明gfp在转基因植株中成功表达。

4.无标记转基因植株检测

提取t1代植株(20棵)dna，以下述引物进行检测，如图4所示1-5，12-16样品dna通过pcr扩增未发现cas9，潮霉素抗性标记等序列，而gfp序列未受影响。测序结果如图5所示，所有t1代植株序列切除的方式一致，虚线部分表示缺失部分，被删除掉。

f1(seqidno：20)atgtactgaattaacgccgaa

f2(seqidno：21)aagaccaatgcggagcatatac

f3(seqidno：22)cctaagaagaagagaaaggtcg

f4(seqidno：23)gcccatctcttcgatgacaaggttatg

f5(seqidno：24)gggtttcgctcatgtgttgagc

f6(seqidno：25)atggtgagcaagggcgagga

r1(seqidno：26)tcacgtcaggtggcagttta

r2(seqidno：27)gacgtctgtcgagaagtttc

r3(seqidno：28)gcagatgatagattgtggggta

r4(seqidno：29)cttcgcagtggccttgccaatttc

r5(seqidno：30)cgggttacttgtacagctcg

actin-f(seqidno：31)tgctatgtacgtcgccatcca

actin-r(seqidno：32)aatgagtaaccacgctccgtc

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：

用于商品化生产的农作物多是杂合的，自交繁种后会产生分离，后代性状可能不稳定，不能用于大规模生产以及形状保持，而普通产生无标记植株的方法多需要进行杂交以达到标记分离的目的，本发明不需要通过杂交，特异启动子的选择可以达到在转基因当代(t0)就得到转基因无标记植株，值得推广应用。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国水稻研究所

<120>获得无标记转基因植物的方法

<130>pn78583sdyjs

<160>32

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3976

<212>dna

<213>水稻(oryzasativa)

<400>1

tccgatcgagctagtcctgtgcccgtaccatgacggagccgatcctctccattcaaaggg60

aatatgatgagagagtagtggggaatcggtttttgcaatcaattagaggaggaaacgcat120

ggagagacaaatcgacgtggcggtggcgctagggttcagcccgacgaaaaaaccacgaaa180

aaaatagagacaaaagaaagaaacccgaaaaccggtgaaagaaaaaaaagagggaacagt240

gaaaagaaaagaaaaaaaaggaaaacggtgaaaaataaaataaaacggaaaaagatggga300

aaaaagaaaaacaggcgaaaattataggtggaagcatatgtattttttattaggtataga360

tttctagattctatagcttttgatccttgtaatctagatgaaaagcttacgggcctcttt420

gatttagaggataaacataggaattttggagaattttaatcctatataaaaaaattatat480

aaatacatttgaaacaaaagattgaatcctatcatatcctatcctattaaagtcctatgg540

aatgaacaattctacagagattttggcggaaatttagcaagagcttcaacctcttggaaa600

ttttcctttgagtctatctctcttatccgattcgtactttttcctatggtttaatcaaat660

ggttatttctaagatttcctgtgttttacaatcctctgttatgcacgaactccaagaagt720

tatgtgttataaggttcacatcctctgttagtagttgactgtactattaaactataccat780

taatagcatagccaactattaacttcacatcatctatcaaaaactctctaaaagacaggg840

ccacatactcagggggtgtttagatccaggggtgtaaagttttggcgtgtcatatcggat900

attatatagggtgtcgcatggggtgtttgacactaataaaaaaactaattacagaatccg960

tcagtaaaccgcgagacaaatttattaagcctaattaatcagtcattagcaaaggtttac1020

tgtagtaccacattgtcaaatcatgtagcaattaggcttaaaagatttgtctcgcaaatt1080

agtcgcaatctgtgcaattagttattttttagcctatgtttaatacctcatgcatgtgtt1140

cgatatgacggggtgtaaaattttgggtgggatctaaacatggcctcattaaaaccaacc1200

attgacaaggtctagtgtggatgtaaagtgtgtaaactagagtgctctgtatgtaaagat1260

gactaattttatactccctccgttccaaaataagtgcagttttagcattgttcatgtcca1320

acgtttgactgtttgtcttatttgaaatttttttataattactacttttattgttattag1380

atgataaaacatgaatagtactttatgtgtgactaattttttttaatatttttcataatt1440

ttttcaaataagacgggtggtcaaaacaatgaacacggatatctatggctgaacttattt1500

tgagacggaggtagtacaattattgtattgggtatatatatcatttgtgcaactactagt1560

atacatacgtagtactccctccgtcccatagtgttgcaacctaggatgggatgagataca1620

tcaaaccatcctaggactacgaatttggacatgattcgtagtcctaggatgggtctcatc1680

ccatcctaggttgcaacattatgggacggacggagtcctatatatgtaggccatgctctc1740

ggggagagagagagagagagagagagagagagagagagagaggggccaattggtgttgcg1800

atcgaggctaggtcaggtcatgacgcaatgcaaatgttatatggaatggatcagagtgat1860

agaggagagagctgtcgagctgggattgcagcatctccagcgccaggagcaccagttgcc1920

gtaaacaacaccacacagtttttcccaccaaatataaaagatctttcttggcacagtgcg1980

ttcaacagttgcaagcaataatattattggctaattagtactgacttttattaatattcg2040

cctattatacaattgataccacctccgatccattcctaaatatactgaccaatgtcatat2100

gaaaaaagaatagagagagtagtaattaatgaactatatcagtgaacattgacagacaaa2160

aataaaatcatactagccatactgtgcaaaaagcaccatatataatttgaaaacgaccgg2220

tatagtttacactcatatatactactccatccgtttcagtttataatgcattttgacttt2280

agtcaaagttaaactgttttaagtttaactaagtttgtagacaaatataataatatttat2340

aatactaaattaattagagtcatcaaattaacaattgaatatattttcataataaattta2400

tcttggattgaaaagtcaaaacgtaatttgactttgaccaaagtcaaaacgtcttattat2460

aatggagtaactttgtaaatcacacttgagtgtattgcgtgatttcttaggatgctacgc2520

tatctcacaagcgacttacgtactataaattaatgcagtgaacatacttagagagttgaa2580

ttttaccacgatttaatttcgatggactaattaaagaaaatctcaaggtttcgaaaacga2640

catggtacgtcgtgcgcgtatatgtaactattgaccatgtattcatatgcacgaattggt2700

acaaaagggtgcacaaattctgcaataactgttggaaatgtatatatattcatacatatg2760

tgtgtacactgctctctccatctctaaaataccttatactccctccatttcatattgtaa2820

gactttctagcattgtttatatttatatagatgttaatgaatttagacacacacacacac2880

acacacacatatatatatatatatatatatatatatatatatatatattcattaacatat2940

atatgaatgtggccaatgctaaaaattcttacattgtgaaacggatgaagtagtatttag3000

ctggtctcagatatattagtatggttgtgaaaagacgaatatgcacttcattaagattat3060

atgcttctattatactacatgtttagctagacttttggcatgcccaagctctaacaaatg3120

atttttgcacctaaatcgatttcaattaggtgggcgagagtggggtttaaccaatagaga3180

taaaataaggacaataaaaacagctagtggaccacatatctccacacgtctcttaaaaaa3240

agatttattttacaactgaatttgaagataaggtattttgtaattgagaaagtaaatacc3300

aatatactccctccggttatttatatttatatttagcgttagaaaagttaaacttagttt3360

tcccatctttaaatatatatagtgaatggatcgtatcgtaaaaaaaaagacaaccggatt3420

atagttaaataattggccatgtattgatatggtgcaaattaacaaaatttcgcagtaatg3480

attggccatgtattcatgtgtacatttatcaatatatcaataaaaaagacaagaggataa3540

taatagtaataataaagaaatggagaaaaggagtcgaggggttgggagttcgaccgtacg3600

aggaggtagcatagcagcagaatcgaccccaagctttccttctcacgtaacatgccgtta3660

ttatattatatatattaaaataattaatccaattattttttaccagattaatattaatgt3720

aatccgtgtgtcagcaggcttgagaggctgcaggtgggccccatgattccgggaccaatc3780

acagctcgacagcatactgacacccgtccccaaaagcaaagaggcctctctctctctctc3840

tcgccgatccctctcctcctcctcttcttcttcttccactagctagttcgtcttcctcct3900

tcagctagcttgtagcagctaaggttaggtcggatcgagatcgggatcggccgccggcga3960

gcggcgagcggcgagg3976

<210>2

<211>44

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<222>(1)..(44)

<223>引物m15-p-f

<400>2

cgagctcggtaccaaggatccgaaaagcttacgggcctctttga44

<210>3

<211>44

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<222>(1)..(44)

<223>引物m15-p-r

<400>3

tcttcttcttaggggccatggtctctatccgcttcagctgcacc44

<210>4

<211>46

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<222>(1)..(46)

<223>引物cas-hgfp-f

<400>4

cgtttcccgccttcagtttaaactgccacctgacgtgagctcggta46

<210>5

<211>47

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<222>(1)..(47)

<223>引物cas-hgfp-r

<400>5

tgtcaaacactgatagtttaaaccggtgtgagggaactagttttgat47

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(22)

<223>引物g1-f

<400>6

ggcaacatgagcgaaaccctat22

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<222>(1)..(22)

<223>引物g1-r

<400>7

aaacatagggtttcgctcatgt22

<210>8

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<222>(1)..(22)

<223>引物g2-f

<400>8

ggcaggcgtcggtttccactat22

<210>9

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(22)

<223>引物g2-r

<400>9

aaacatagtggaaaccgacgcc22

<210>10

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<222>(1)..(22)

<223>引物g3-f

<400>10

ggcagctggcgtaatagcgaag22

<210>11

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<222>(1)..(22)

<223>引物g3-r

<400>11

aaaccttcgctattacgccagc22

<210>12

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<222>(1)..(22)

<223>引物g4-f

<400>12

ggcaacagttgcgcagcctgaa22

<210>13

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(22)

<223>引物g4-r

<400>13

aaacttcaggctgcgcaactgt22

<210>14

<211>1481

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(1481)

<223>2x35s序列

<400>14

ccctactccaaaaatgtcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagactttt60

caacaaagggtaatttcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttc120

atcgaaaggacagtagaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaagga180

aaggctatcattcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacg240

aggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgt300

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aacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcgaaaggacagtagaaaag480

gaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcattcaagatgcc540

tctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaa600

gacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgacatctccactgacgtaagg660

gatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcattt720

catttggagaggacagcccaagcttgtcgacggatccatggtgagcaagggcgaggagct780

gttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagtt840

cagcgtgtccggcgagggtgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcat900

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cgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgc1020

catgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaa1080

gacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaaggg1140

catcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacag1200

ccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagat1260

ccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccc1320

catcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccct1380

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cgggatcactcacggcatggacgagctgtacaagtaacccg1481

<210>15

<211>4959

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_rna

<222>(1)..(4959)

<223>sk-g1g2g3g4-grna序列

<400>15

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ccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcg120

ccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgat180

ttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtg240

ggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaata300

gtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatt360

tataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaat420

ttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttccattcgccattcaggctgcg480

caactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagg540

gggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttg600

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ctaatactagtctttgttgtcgtccaattgcgtaatgggccggcccatactgcaatacat1440

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accagtagaagacgcctgtcttgtgctatggtccctgactgcacatctgattcctccaag1620

atccatgcatgcctgataactttaagttgcttcagaagaactttaagtgatctgttcgta1680

tgtttaaagattccttaatcgtcgacgctagactcgaggattatgtggaaaaaaagcacc1740

gactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttct1800

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ttgcttcagaagaactttaagtgatctgttcgtatgtttaaagattccttaatcgtcgag2220

gattatgtggaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagc2280

cttattttaacttgctatttctagctctaaaacatagggtttcgctcatgttgccacgga2340

tcatctgcacaactcttttaaatcagctttgatctatgtggatagccgaggtggtactaa2400

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tgaaaggcttcatggcccactacgaaatgcttttctcctacagtttatcttacttcttca2520

catcacgtggtttccgacgtacccagtgttcccggcttccagcatttgctggtagcacca2580

gtagaagacgcctgtcttgtgctatggtccctgactgcacatctgattcctccaagatcc2640

atgcatgcctgataactttaagttgcttcagaagaactttaagtgatctgttcgtatgtt2700

taaagattccttaatcgtcgacgctagcagatctgcggccgccaccgcggtggagctcca2760

gcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgcttggcgtaatcatggtcatagctgt2820

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taagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagca4860

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aaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccac4959

<210>16

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<222>(1)..(21)

<223>靶位点g1

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acatgagcgaaaccctatagg21

<210>17

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<222>(1)..(21)

<223>靶位点g2

<400>17

ggcgtcggtttccactatcgg21

<210>18

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<222>(1)..(21)

<223>靶位点g3

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gctggcgtaatagcgaagagg21

<210>19

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<222>(1)..(21)

<223>靶位点g4

<400>19

acagttgcgcagcctgaatgg21

<210>20

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<222>(1)..(21)

<223>引物f1

<400>20

atgtactgaattaacgccgaa21

<210>21

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<222>(1)..(22)

<223>引物f2

<400>21

aagaccaatgcggagcatatac22

<210>22

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(22)

<223>引物f3

<400>22

cctaagaagaagagaaaggtcg22

<210>23

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<222>(1)..(27)

<223>引物f4

<400>23

gcccatctcttcgatgacaaggttatg27

<210>24

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<222>(1)..(22)

<223>引物f5

<400>24

gggtttcgctcatgtgttgagc22

<210>25

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<223>引物f6

<400>25

atggtgagcaagggcgagga20

<210>26

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<223>引物r1

<400>26

tcacgtcaggtggcagttta20

<210>27

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<223>引物r2

<400>27

gacgtctgtcgagaagtttc20

<210>28

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(22)

<223>引物r3

<400>28

gcagatgatagattgtggggta22

<210>29

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(24)

<223>引物r4

<400>29

cttcgcagtggccttgccaatttc24

<210>30

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<223>引物r5

<400>30

cgggttacttgtacagctcg20

<210>31

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(21)

<223>引物actin-f

<400>31

tgctatgtacgtcgccatcca21

<210>32

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(21)

<223>引物actin-r

<400>32

aatgagtaaccacgctccgtc21