本发明属于基因检测领域，具体涉及基于荧光标记多糖的染料编码方法及其用途。
背景技术
液体芯片，又称悬浮阵列，该技术的核心是将聚苯乙烯微球用荧光染色的方法进行编码，然后将每种颜色的微球(或称为荧光编码微球)共价交联上针对特定核酸的探针。应用时，将检测样本与多种连有特定核酸探针的微球同时进行杂交反应，反应完成后，仪器通过两束激光分别识别编码微球和检测微球上报告分子的荧光强度，从而对靶核酸进行定量检测。由于整个反应在液相中完成，反应速度快，杂交效率高，并可以在一个微量反应体系中同时检测多达上百条靶序列。然而，近年研究结果显示，液体芯片技术尚存在灵敏度较低、重复性较差等不足，其原因主要是不同荧光标记物的发射光谱在液相中广泛重叠，导致大量假阳性结果产生，限制了液体芯片技术的进一步推广应用。因此，寻找一种能以不同颜色分别标记探针，且发光强度高，不易淬灭，光谱之间重叠少的荧光标记物是提高液体芯片检测灵敏度和重复性的关键。
技术实现要素：
为此，本发明要解决的技术问题是提供一种以不同颜色分别标记探针且发光强度高，不易淬灭，光谱之间重叠少的荧光标记多糖的染料编码方法以及液相芯片。
为此，本发明提供了一种基于荧光标记多糖的染料编码方法，包括标签序列；以糖链序列为标签序列，沿着所述糖链序列延伸方向，将所述标签序列分为至少两个荧光区域，每个荧光区域中的单糖或多糖分子至少连接一种荧光染料或量子点，相邻两个荧光区域间隔至少3个单糖或多糖分子。
优选的，所述标签序列分为至少四个荧光区域，所述荧光区域中糖链序列的长度为10-15个单糖或多糖分子。
优选的，任意两个所述荧光区域内的荧光染料或量子点不相同。
优选的，每个所述荧光区域内只有一种单糖或多糖分子连接荧光染料或量子点，且同一个荧光区域内的荧光染料或量子点相同。
优选的，所述荧光染料包括bodipy、fitc、罗丹明、香豆素、呫吨、花青素、芘或酞菁；所述量子点选自mgs、mgse、mgte、cas、case、cate、zno、zns、znse、znte、srs、srse、sete、cds、cdse、cdte、bas、base、bate、hgs、hgse、hgte、pbse、caas、inp、inas、incaas、zns/cds、zns/cds/zns、zns/hgs/zns/cds、cds/zns、cds/ag2s、cds/hgs、cds/hgs/cds、cds/pbs、cds/cd(oh)2、cdse/cuse、cdse/zns、cdse/znse、cdse/cds、cdse/hgse、cdse/hgse/cdse、cdse/hgte、cdte/hgs、cdte/hgte、inas/znse、inas/cdse、inas/inp、zns:mn、zns:cu、cds:mn和cds:cu中的任一种，以及以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点。
本发明提供了一种由基于荧光标记多糖的染料编码方法编码得到的标签序列。
本发明提供了一种液相芯片，包括：
所述的标签序列；
与所述标签序列连接的探针分子p1；
磁性微球；
与磁性微球连接的探针分子p2，所述探针分子p1与所述探针分子p2之间不互相结合。
优选的，所述探针分子p1包括核苷酸序列、抗原或抗体，所述探针分子p2包括核苷酸序列、抗原或抗体。
优选的，所述探针分子p2上连接有生物素或荧光染料，且探针分子p2上连接的荧光染料与所述标签序列中的荧光染料不相同。
本发明提供了一种制备所述的液相芯片的方法，包括以下步骤：
s1.将权利要求6所述的标签序列连接探针分子p1；
s2.将生物素或荧光染料连接探针分子p2
s3.将磁性微球连接上探针分子p2。
本发明提供了一种利用所述的液相芯片在核酸或蛋白检测领域的用途。
本发明相对现有技术具有如下优点：
1.本发明提供的基于荧光标记多糖的染料编码方法，以糖链序列为标签序列，沿着所述单糖或多糖分子延伸方向，将所述标签序列分为至少两个荧光区域，每个荧光区域中的单糖或多糖分子至少连接一种荧光染料或量子点，并且相邻两个荧光区域之间间隔至少3个单糖或多糖分子，使得两个区域之间的发出的荧光不互相干扰。
2.本发明提供的基于荧光标记多糖的染料编码方法，每个荧光区域连接一种荧光染料，通过对每个荧光区域连接的荧光染料进行排列组合可以达到对标签序列进行编号的目的。将标签序列分为四个荧光区域，通过对4种不同的荧光染料进行组合，可以得到24种不同的组合方式，如果不同的荧光区域可以使用相同的荧光染料，4个荧光区域可以得到256种不同的组合方式。依次类推，将标签序列分得荧光区域越多，可以获得更多的组合方式，实现更多编号的标签序列，极大的扩展了标签序列的编号范围。另外，通过使用不同颜色的荧光染料，可以有效的避免光谱之间的重叠。
3.本发明提供的基于荧光标记多糖的染料编码方法，标签序列每个荧光区域内连接的荧光染料或量子点的个数不同，使得每个荧光区域的放光强度不同，通过对每个荧光区域的发光强度进行排列组合可以达到对标签序列进行编号的目的；例如将标签序列分为4个荧光区域，每个荧光区域可以连接10个量子点，每两个量子点设置一个荧光强度等级，分为5个荧光强度等级，4个荧光区域就可以得到54中不同的排列方式，依次类推，标签序列设置n个荧光区域，每个荧光区域内设置m个荧光强度等级，可以得到mn种不同的排列方式，极大的扩展了标签序列的编号范围。
4.本发明提供的液相芯片，包括标签序列，与标签序列连接的探针分子p1，磁性微球标记的探针分子p2，检测标签序列每个荧光区域的荧光染料发出的荧光，得到标签序列的编号，得知待测序列中是否存在靶核酸序列，可以对靶核酸序列进行定性检测。
5.本发明提供的液相芯片，利用探针分子p2上的荧光染料或生物素的荧光强度与靶核酸序列浓度成正比，能够对靶核酸序列进行定量检测。
6.本发明提供的液相芯片，可以一次检测多种不同的靶序列，实现高通量的检测。
7.本发明提供的液相芯片，探针分子p1包括核苷酸序列、蛋白或糖类，探针分子p2包括核苷酸序列、蛋白或糖类，实现对核苷酸序列、蛋白或糖类进行检测。
附图说明
图1为本发明实施例中荧光标记多糖的染料编码方法的编码示意图；
图2为本发明实施例中液相芯片的检测示意图。
图3为本发明实验例中液相芯片检测alk、apc、braf和egfr基因的检测结果。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术。
实施例1
本实施例提供一种基于荧光标记多糖的染料编码方法，包括标签序列，标签序列为糖链序列，长度为70个单糖或多糖分子，如图1所示，将标签序列分成四个荧光区域，分别为荧光区域i，荧光区域ii，荧光区域iii和荧光区域iv，相邻两个荧光区域之间间隔至少3个单糖或多糖分子；其中荧光区域i中的乳糖连接罗丹明，荧光区域ii中的果糖连接花青素，荧光区域iii中的葡萄糖连接香豆素，荧光区域iv中的苏力糖连接酞菁。
按照上述基于荧光标记多糖的染料编码方法，对每个荧光区域连接的荧光染料进行排列组合，每个荧光区域使用不同的荧光染料，得到24种不同的排列方式，并对每种排列方式进行编号作为标签序列的编号，实现对标签序列编号。
所述编码方法将标签序列分成了多个荧光区域，并且相邻两个荧光区域之间间隔至少3个单糖或多糖分子，使得两个区域之间的发出的荧光不互相干扰。每个荧光区域连接一种荧光染料，通过对每个荧光区域连接的荧光染料进行排列组合可以达到对标签序列进行编号的目的。例如，如表1所示，对排列的组合方式进行了举例，通过对4种不同的荧光染料进行组合，可以得到24种不同的组合方式，如果不同的荧光区域可以使用相同的荧光染料，4个荧光区域可以得到256种不同的组合方式。
表1
将标签序列分成5个荧光区域可以得到625种不同的组合方式，依次类推，将标签序列分得荧光区域越多，可以获得更多的组合方式，实现更多编号的标签序列，极大的扩展了标签序列的编号范围。另外，通过使用不同颜色的荧光染料，可以有效的避免光谱之间的重叠。
实施例2
本实施例提供一种基于荧光标记多糖的染料编码方法，以糖链序列为标签序列，长度为80个单糖或多糖分子，将所述标签序列分成四个荧光区域，分别为荧光区域i，荧光区域ii，荧光区域iii和荧光区域iv，长度均为15个单糖和多糖分子，相邻两个荧光区域之间间隔至少3个单糖或多糖分子，在本实施例中为相邻两个荧光区域之间间隔5个单糖和多糖分子；其中荧光区域i中的乳糖连接芘，荧光区域ii中的果糖连接bodipy，荧光区域iii中的葡萄糖连接fitc，荧光区域iv中的苏力糖连接罗丹明。
按照上述基于荧光标记多糖的染料编码方法，对每个荧光区域连接的荧光染料进行排列组合，每个荧光区域使用不同的荧光染料，得到24种不同的排列方式，并对每种排列方式进行编号作为标签序列的编号，实现对标签序列编号。
实施例3
本实施例提供一种基于荧光标记多糖的染料编码方法，以糖链序列为标签序列，长度为100个单糖或多糖分子，将所述标签序列分成五个荧光区域，分别为荧光区域i，荧光区域ii，荧光区域iii、荧光区域iv和荧光区域v，长度均为15个单糖或多糖分子，相邻两个荧光区域之间间隔至少3个单糖或多糖分子，在本实施例中为相邻两个荧光区域之间间隔间隔5个单糖或多糖分子；其中荧光区域i中的乳糖连接呫吨，荧光区域ii中的果糖连接花青素，荧光区域iii中的葡萄糖连接芘，荧光区域iv中的苏力糖连接bodipy，荧光区域v中的乳糖连接罗丹明。
按照上述基于荧光标记多糖的染料编码方法，选择上述5种荧光染料(呫吨、花青素、芘、bodipy和罗丹明)排列组合对上述5个荧光区域进行标记，实现625个标签序列编号。
实施例4
本实施例提供一种基于荧光标记多糖的染料编码方法，以糖链序列为标签序列，长度为30个单糖或多糖分子，将所述标签序列分成2个荧光区域，分别为荧光区域i，荧光区域ii，长度均为10个单糖或多糖分子，相邻两个荧光区域之间间隔至少3个单糖或多糖分子，在本实施例中为相邻两个荧光区域之间间隔间隔10个单糖或多糖分子；其中荧光区域i中的苏力糖连接酞菁，荧光区域ii中的乳糖连接花青素。
按照上述基于荧光标记多糖的染料编码方法，对每个荧光区域连接的荧光染料进行排列组合，每个荧光区域使用不同的荧光染料，得到2种不同的排列方式，并对每种排列方式进行编号作为标签序列的编号，实现对标签序列编号。
作为可替换的实施方式，标签序列可以分为两个、三个、四个、五个以上荧光区域，只要相邻两个荧光区域之间间隔至少3个单糖或多糖分子，每个荧光区域中只有一种单糖或多糖分子连接一种荧光染料。
作为可替换的实施方式，荧光染料可以是bodipy、fitc、罗丹明、香豆素、呫吨、花青素、芘和酞菁。
实施例5
本实施例提供一种基于荧光标记多糖的染料编码方法，以糖链序列为标签序列，长度为95个单糖或多糖分子，将所述标签序列分成四个荧光区域，分别为荧光区域i，荧光区域ii，荧光区域iii和荧光区域iv，长度均为15个单糖或多糖分子，相邻两个荧光区域之间间隔至少3个单糖或多糖分子，在本实施例中为相邻两个荧光区域之间间隔3个单糖或多糖分子；其中荧光区域i中的乳糖连接cdte，荧光区域ii中的果糖连接cas，荧光区域iii中的葡萄糖连接cds，荧光区域iv中的苏力糖连接cdse。
所述编码方法将标签序列分成了多个荧光区域，并且相邻两个荧光区域之间间隔至少3个单糖或多糖分子，使得两个区域之间的发出的荧光不互相干扰。每个荧光区域连接一种量子点，通过对每个荧光区域连接的量子点进行排列组合可以达到对标签序列进行编号的目的。例如，如表2所示，对排列的组合方式进行了举例，通过对4种不同的量子点进行组合，可以得到24种不同的组合方式，如果不同的荧光区域可以使用相同的量子点，4个荧光区域可以得到256种不同的组合方式。
表2
将标签序列分成5个荧光区域可以得到625种不同的组合方式，依次类推，将标签序列分得荧光区域越多，可以获得更多的组合方式，实现更多编号的标签序列，极大的扩展了标签序列的编号范围。另外，通过使用不同颜色的量子点，可以有效的避免光谱之间的重叠。
实施例6
本实施例提供一种基于荧光标记多糖的染料编码方法，以糖链序列为标签序列，长度为95个单糖或多糖分子，将所述标签序列分成四个荧光区域，分别为荧光区域i，荧光区域ii，荧光区域iii和荧光区域iv，长度均为15个单糖或多糖分子，相邻两个荧光区域之间间隔至少3个单糖或多糖分子，在本实施例中为相邻两个荧光区域之间间隔5个单糖或多糖分子；其中荧光区域i中的单糖或多糖分子连接cdte，荧光区域ii中的单糖或多糖分子连接cas，荧光区域iii中的单糖或多糖分子连接cds，荧光区域iv中的单糖或多糖分子连接cdse。每个荧光区域中每连接两个量子点为一个荧光强度等级，例如荧光区域i中有两个单糖或多糖分子连接cdte，则荧光区域i的荧光强度等级为cdte强度i，荧光区域ii中有四个单糖或多糖分子连接cas，则荧光区域ii的荧光强度等级为cas强度ii，荧光区域iii中有六个单糖或多糖分子连接cds，则荧光区域iii的荧光强度等级为cds强度iii，荧光区域iv中有八个单糖或多糖分子连接cdse，则荧光区域iv的荧光强度等级为cdse强度iv。本实施例中每个荧光区域分为5个荧光强度等级：强度i，强度ii，强度iii，强度iv和强度v，通过对每个荧光区域连接的量子点的荧光强度等级进行排列组合可以达到对标签序列进行编号的目的。例如，如表3所示，对排列的组合方式进行了举例，通过对4种不同的量子点荧光强度等级进行组合，可以得到54种不同的组合方式，即有54个编号。
表3
实施例7
本实施例提供一种基于荧光标记多糖的染料编码方法，以糖链序列为标签序列，长度为125个单糖或多糖分子，将所述标签序列分成五个荧光区域，分别为荧光区域i，荧光区域ii，荧光区域iii，荧光区域iv和荧光区域v，长度均为15个单糖或多糖分子，相邻两个荧光区域之间间隔至少3个单糖或多糖分子，在本实施例中为相邻两个荧光区域之间间隔5个单糖或多糖分子；其中荧光区域i中的单糖或多糖分子连接cdte，荧光区域ii中的单糖或多糖分子连接cas，荧光区域iii中的单糖或多糖分子连接cds，荧光区域iv中的单糖或多糖分子连接cdse，荧光区域v中的单糖或多糖分子连接hgs。每个荧光区域中每连接两个量子点为一个荧光强度等级，例如荧光区域i中有两个单糖或多糖分子连接cdte，则荧光区域i的荧光强度等级为cdte强度i，荧光区域ii中有四个单糖或多糖分子连接cas，则荧光区域ii的荧光强度等级为cas强度ii，荧光区域iii中有六个单糖或多糖分子连接cds，则荧光区域iii的荧光强度等级为cds强度iii，荧光区域iv中有八个单糖或多糖分子连接cdse，则荧光区域iv的荧光强度等级为cdse强度iv；荧光区域v中有十个单糖或多糖分子连接hgs，则荧光区域v的荧光强度等级为hgs强度v，本实施例中每个荧光区域分为6个荧光强度等级：强度i，强度ii，强度iii，强度iv，强度v和强度vi，对每个荧光区域连接的量子点的荧光强度等级进行排列组合可以达到对标签序列进行编号的目的，通过对5种不同的量子点，6个荧光强度等级进行组合，可以得到65种不同的组合方式，即有65个编号。
作为可替换的实施方式，标签序列可以分为两个、三个、四个、五个以上荧光区域，只要相邻两个荧光区域之间间隔至少5bp，每个荧光区域中单糖或多糖分子连接一种量子点。
作为可替换的实施方式，量子点可以是mgs、mgse、mgte、cas、case、cate、zno、zns、znse、znte、srs、srse、sete、cds、cdse、cdte、bas、base、bate、hgs、hgse、hgte、pbse、caas、inp、inas、incaas、zns/cds、zns/cds/zns、zns/hgs/zns/cds、cds/zns、cds/ag2s、cds/hgs、cds/hgs/cds、cds/pbs、cds/cd(oh)2、cdse/cuse、cdse/zns、cdse/znse、cdse/cds、cdse/hgse、cdse/hgse/cdse、cdse/hgte、cdte/hgs、cdte/hgte、inas/znse、inas/cdse、inas/inp、zns:mn、zns:cu、cds:mn和cds:cu中的任一种，以及以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点。
将标签序列分为n个荧光区域，相邻两个荧光区域之间间隔至少3个单糖或多糖分子，每个荧光区域中单糖或多糖分子连接一种量子点，每个荧光区域分为m个荧光强度等级，通过对n种不同的量子点，m个荧光强度等级进行组合，可以得到mn种不同的组合方式，即有mn个编号，并对每种排列方式进行编号作为标签序列的编号，实现对标签序列编号。
实施例8
本实施例提供的一种液相芯片，包括通过实施例1的基于荧光标记多糖的染料编码方法编码得到的标签序列；
根据靶核酸序列设计一段探针分子p1和一段探针分子p2，探针分子p1能与靶核酸序列5’端杂交结合，探针分子p2能与靶核酸序列3’端杂交结合，探针分子p1和探针分子p2不互补，探针分子p2上连接有荧光染料fitc。如图2所示，将探针分子p1连接到标签序列上，将探针分子p2连接到磁性微球上；使用通用引物将待测样本进行pcr扩增，再将pcr扩增产物同时与标签序列和磁性微球进行杂交反应，如果待测样本含有靶核酸序列，则标签序列上的探针分子p1和磁性微球上的探针分子p2可以与靶核酸序列通过碱基互补发生特异性结合，所得的复合物利用磁性微球可以通过磁性分离从反应体系中分离出来，再利用标签序列上的荧光染料的荧光强度与靶核酸序列浓度成正比，对靶核酸序列进行定量检测。如果待测样本中不含有靶核酸序列，则针对该靶核酸的探针分子p1无法通过靶核酸序列与磁性微球标记的探针分子p2结合，不具有磁性，从而在磁性分离中取出。
实施例9
本实施例提供一种液相芯片，包括通过实施例6的基于荧光标记多糖的染料编码方法编码得到的标签序列，即标签序列为糖链序列，长度为95个单糖或多糖分子，将标签序列分成四个荧光区域，分别为荧光区域i，荧光区域ii，荧光区域iii和荧光区域iv，长度均为15个单糖或多糖分子，相邻两个荧光区域之间间隔至少3个单糖或多糖分子；将cdte，cas，cds和cdse分别连接到四个荧光区域中的一种单糖或多糖分子上，其中荧光区域i中的乳糖连接cdte，荧光区域ii中的果糖连接cas，荧光区域iii中的葡萄糖连接cds，荧光区域iv中的苏力糖连接cdse，每个荧光区域中每连接两个量子点为一个荧光强度等级，例如荧光区域i中有两个单糖或多糖分子连接cdte，则荧光区域i的荧光强度等级为cdte强度i，荧光区域ii中有四个单糖或多糖分子连接cas，则荧光区域ii的荧光强度等级为cas强度ii，荧光区域iii中有六个单糖或多糖分子连接cds，则荧光区域iii的荧光强度等级为cds强度iii，荧光区域iv中有八个单糖或多糖分子连接cdse，则荧光区域iv的荧光强度等级为cdse强度iv。本实施例中每个荧光区域分为5个荧光强度等级：强度i，强度ii，强度iii，强度iv和强度v，对每个荧光区域连接的量子点的荧光强度等级进行排列组合可以达到对标签序列进行编号的目的。通过对4种不同的量子点荧光强度等级进行组合，可以得到625种不同的组合方式，并对每种排列方式进行编号作为标签序列的编号。
根据625种不同的靶核酸序列设计不同的探针分子p1和探针分子p2，探针分子p1能与靶核酸序列5’端杂交结合，探针分子p2能与靶核酸序列3’端杂交结合，探针分子p1和探针分子p2不互补，探针分子p2上连接有荧光染料fitc。将探针分子p1连接到标签序列上，将探针分子p2连接到磁性微球上；将连接探针分子p1的所述标签序列与连接探针分子p2的所述磁性微球混合。
使用通用引物将待测样本进行pcr扩增，再将pcr扩增产物加入至所述液相芯片中，所述pcr扩增产物同时与标签序列和磁性微球进行杂交反应，如果待测样本含有靶核酸序列，则标签序列上的探针分子p1和磁性微球上的探针分子p2可以与靶核酸序列通过碱基互补发生特异性结合，所得的复合物利用磁性微球可以通过磁性分离从反应体系中分离出来，检测标签序列每个荧光区域的荧光染料发出的荧光，得到标签序列的编号，得知待测序列中是否存在靶核酸序列，可以对靶核酸序列进行定性检测；再利用探针分子p2上的荧光染料fitc的荧光强度与靶核酸序列浓度成正比，对靶核酸序列进行定量检测。
实验例1
本实验例使用实施例9中的液相芯片检测4个肿瘤靶向药物用药相关的基因，包括alk、apc、braf和egfr。标签序列为糖链序列，长度为95个单糖或多糖分子，糖链序列具体如下：-葡糖糖-乳糖-葡萄糖-苏力糖-半乳糖-葡萄糖-葡萄糖-半乳糖-果糖-蔗糖-半乳糖-葡萄糖-葡萄糖-葡萄糖-葡萄糖-葡萄糖-葡萄糖-葡萄糖-半乳糖-果糖-半乳糖-果糖-半乳糖-果糖-半乳糖-果糖-鼠李糖-半乳糖-果糖-半乳糖-果糖-半乳糖-葡萄糖-n2-乙酰半乳糖胺-葡萄糖-葡萄糖-半乳糖-果糖-葡萄糖-葡萄糖-半乳糖-果糖-葡萄糖-葡萄糖-半乳糖-果糖-葡萄糖-葡萄糖-半乳糖-果糖-唾液酸-苏力糖-苏力糖-半乳糖-苏力糖-苏力糖-半乳糖-果糖-半乳糖-果糖-半乳糖-果糖-鼠李糖-半乳糖-果糖-葡萄糖-半乳糖-果糖-半乳糖-果糖-半乳糖-乳糖-葡萄糖-苏力糖-半乳糖-葡萄糖-葡萄糖-鼠李糖-半乳糖-果糖-半乳糖-半乳糖-果糖-唾液酸-半乳糖-果糖-半乳糖-果糖-半乳糖-葡萄糖
alk基因的探针分子p1如seqno.1所示，探针分子p2如seqno.2所示，apc基因的探针分子p1如seqno.3所示，探针分子p2如seqno.4所示；braf基因的探针分子p1如seqno.5所示，探针分子p2如seqno.6所示；egfr基因的探针分子p1如seqno.7所示，探针分子p2如seqno.8所示。
图3为采用本发明液相芯片使用流式细胞仪检测肿瘤靶向药物用药相关的基因混合样本的标准曲线，用最小平方法求得各标准曲线的回归方程，r2均高于0.99，表明荧光染料fitc荧光强度与靶核酸序列浓度成正比，可以据此对靶核酸序列进行定量检测。
上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110>苏州百源基因技术有限公司
<120>基于荧光标记多糖的染料编码方法
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