本发明涉及化学分析技术领域，具体涉及一种快速识别含-sh化合物的荧光探针及其制备方法。
背景技术
通常我们将含有-sh的化合物分为三大类，即苯硫酚类化合物、硫化氢和硫醇。而生物体内的h2s和生物硫醇的含量以及环境中苯硫酚类化合物的含量，与我们的生命健康息息相关，因此，选择性识别和定量分析含-sh化合物，就显得尤为重要和迫切。
技术实现要素：
本发明的目的在于，针对上述现有技术的不足，提出一种快速识别含-sh化合物的荧光探针，该种荧光探针在检测过程中对含-sh化合物的响应速度较快、水溶性较强以及很好的抗干扰性，进而大大的提高了该种荧光探针的适用范围。
本发明提出一种快速识别含-sh化合物的荧光探针，通过与含-sh化合物反应，生成具有强荧光性的反应产物，其特征在于，具有如下所示的结构式：
所述r1为
所述r2为
本发明的荧光探针由于含有吸电子的识别基团r2，使荧光探针处于荧光淬灭状态。当荧光探针检测到含-sh化合物反应时，含-sh化合物反应首先亲核进攻识别基团，r1末端发生-o-键或-n-键断裂，得到具有强荧光的反应产物，通过监测产物的荧光强度，可以实时检测含-sh化合物的浓度。
由于识别基团r2具有较强的吸电子能力，同时由于在本发明的荧光探针一侧具有氮杂环丁烷基，其对整个共轭体系的电子云密度发生变化，使r1末端发生-o-键或-n-键断裂速度较快，所以在检测含-sh化合物时，本发明提供的荧光探针识别含-sh化合物时，能够快速响应，再者本荧光探针具有萘啶类衍生物结构，萘啶类衍生物的发射波长在近红外区域，而且具有较大的stokes位移，具有很强的抗干扰能力，进而对含-sh化合物识别针对性较强，从而达到灵敏度高、响应速度快的特点。
由于本发明的荧光探针具有较强的抗干扰能力和响应速度，所以可以适用于干扰性较强的样品检测，例如水环境以及各种生物样品（细胞、斑马鱼）。
进一步的，一种快速识别含-sh化合物的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)、将2，7-萘啶-1(2h)-酮与三溴氧磷的反应物经过萃取、干燥、分离纯化，制得中间体a；
(2)、将步骤(1)的中间体a与甲基硼酸和碳酸氢钠发生反应，得到中间体b；
(3)、将步骤(2)中的中间体b与液溴在乙酸溶液中反应，得到中间体c；
(4)、将步骤(3)的中间体c、氮杂环丁烷和2-二环己基磷-2，4，6-三异丙基联苯混合反应得到中间体d；
(5)、将步骤(4)的中间体d进行r1取代反应得到中间体e；
(6)、将步骤(5)的中间体e进行r2取代，反应得到荧光探针。
本发明中r1基团和r2基团的取代反应是根据各自对应基团的化学性质、反应条件进行选择。
进一步的，步骤（1）中所述分离纯化采用硅胶色谱法。
进一步的，步骤（2）还包含pd(pph3)cl2。
进一步的，步骤（3）中所述中间体c通过二氯甲烷萃取后制得。
本发明的一种快速识别含-sh化合物的荧光探针及制备方法，该种荧光探针通过具有萘啶类结构，提供较大的stokes位移，使探针具有较强的抗干扰性，同时，在萘啶环上设有氮杂环丁烷基，使整个共轭体系电子云密度发生变化，在反应时，断键更加迅速，提高了探针的响应时间，再者，本探针具有较强吸电子能力的基识别基团r2不仅能够与含-sh化合物快速反应，同时灵敏度高；由于该荧光探针具有较强的抗干扰能力，响应速度快，灵敏度高，能够特异性识别含-sh化合物，适用于各种干扰强度较大样品的检测。
附图说明
图1为本发明一种荧光探针对含-sh化合物的识别机理反应示意图；
图2为本发明一种荧光探针的1hnmr谱图；
图3为本发明一种荧光探针的1cnmr谱图；
图4为本发明荧光探针与含-sh化合物反应前后的荧光光谱图；
图5为本发明一种荧光探针抗干扰性测试结果示意图；
图6为本发明另一种荧光探针对含-sh化合物的识别机理反应示意图；
图7为本发明另一种荧光探针的1hnmr谱图；
图8为本发明另一种荧光探针的1cnmr谱图；
图9为本发明另一种荧光探针抗干扰性测试结果示意图。
具体实施方式
为下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，本领域技术人员对本发明所做的各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所要求保护的范围内。本发明实施例中的配比均为以重量计。
实施例1
本发明一种快速识别含-sh化合物的荧光探针的制备方法，具体包括以下步骤：
中间体a的合成：将1g(6.84mmol)的2,7-萘啶-1(2h)-酮和9.81g(34.21mmol)的三溴氧磷溶于10ml的乙腈中，加热到80℃反应1h。向反应体系中加入冰水使三溴氧磷淬灭，然后调ph至中性。将溶液用二氯甲烷萃取3次，然后用na2so4干燥二氯甲烷萃取液，经过减压蒸馏得到红色粗产品，继续硅胶柱色谱纯化，制得白色固体，即为中间体a(980mg,yield69%)。1hnmr(400mhz,cdc13):δ9.76(s,1h),8.82(d,j=4hz,1h),8.48(d,j=4hz,1h),7.68(d,j=8hz,1h),7.61(d,j=8hz,1h).
中间体b的合成：在氩气条件下，将400mg(1.91mmol)的中间体a和134mg(0.19mmol)的pd(pph3)cl2溶解于10ml的二氧六烷。然后依次加入已溶解了138mg(2.3mmol)甲基硼酸的10ml的二氧六烷溶液和209mg(2.5mmol)的碳酸氢钠，在130℃搅拌反应1h。然后减压蒸馏除溶剂，残留液经硅胶柱色谱法纯化，制得黄色稠状液体，即为中间体b(180mg,yield66%)。1hnmr(400mhz,cdc13):δ9.59(s,1h),8.71(d,j=5.6hz,1h),8.57(d,j=6hz,1h),7.61(d,j=5.6hz,1h),7.48(d,j=6hz,1h),3.06(s,3h).
中间体c的合成：将144mg(1mmol)的中间体b溶于10ml的乙酸中，向反应液中滴加211mg(1.2mmol)的液溴，室温下搅拌5小时。反应完毕后用nahco3调至中性，然后用二氯甲烷多次萃取，萃取液用na2so4干燥，经过减压蒸馏和硅胶柱色谱法纯化制得黄色油装液体，即为中间体c(154mg,yield69%)。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.66(s,1h),9.02(s,1h),8.73(d,j=5.7hz,1h),7.78(d,j=5.5hz,1h),3.04(s,3h).
中间体d的合成：将100mg(0.45mmol)的中间体c、77.1mg(1.35mmol)的氮杂环丁烷、53mg(0.54mmol)的叔丁醇钠、51.8mg(0.09mmol)的pd(dba)2和85.8mg(0.18mmol)的2-二环己基磷-2,4,6-三异丙基联苯溶解于二氧六烷，在氩气保护下100℃反应12h。反应完毕后，将反应液冷却至室温，经过滤、50ml二氯甲烷洗涤、减压蒸馏制得粗产品。粗产品经硅胶柱色谱法纯化制得黄色油状液体，即为中间体d(53.8mg,yield60%)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.97(s,1h),8.41(d,j=5.4hz,1h),7.83(s,1h),7.63(d,j=5.7hz,1h),4.21(t,j=6.9hz,5h),2.91(s,3h),2.43-2.33(m,2h)。
中间体e的合成：将199mg(1mmol)的中间体d、112mg(0.92mmol)的对羟基苯甲醛、0.5ml哌啶和0.5ml的乙酸溶于30ml的甲苯中，140℃反应12h。反应液经减压蒸馏、硅胶柱色谱法纯化制得黄色固体，即为中间体e(146mg,yield48%)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.50(s,1h),8.93(d,j=2.8hz,1h),8.62(d,j=5.6hz,1h),8.49-8.46(m,1h),8.38(d,j=15.2hz,1h),8.08(t,j=11.7hz,3h),7.87(s,1h),7.72(d,j=5.6hz,1h),7.35(d,j=8.4hz,2h),7.28(d,j=9.2hz,1h),4.25(t,j=7.2hz,4h),2.45-2.38(m,2h)。
荧光探针的合成：将50mg(0.16mmol)的中间体e、37mg(0.2mmol)的2,4-二磺酸氟苯和碳酸钾溶于10ml干燥的n,n-二甲基甲酰胺中。室温搅拌1h。将反应液倒入冰水中，经过过滤、洗涤、硅胶柱色谱法纯化制得黄色固体，即得荧光探针(58mg,yield75%)。请参见图2和图3。
该种荧光探针的与含-sh化合物gsh的检测反应：
使用10mmpbs（ph=7.4）缓冲液；配置100μm(hplc的dmf配置的)的荧光探针溶液，用二次水配置10mm的gsh储液。取100μl上述荧光探针的溶液和900μlpbs（ph=7.4）缓冲液于比色皿中，检测其355nm激发下的荧光光谱图，从图4虚线和实线对比可以看出，荧光探针背景低，并且对gsh响应强，是一种荧光增强型的荧光探针，反应原理请参见图1。
测定该荧光探针检测含-sh化合物时的抗干扰能力。
向比色皿中加入100μl荧光探针溶液，然后分别加入200μm干扰试剂，如c6h5nh2、cys、hcy、gsh、ala、ki、nan3、nascn、nahs、c6h5oh、nano2，分别测试加入不同干扰试剂后反应体系在580nm的荧光强度，如图5中黑色柱形；图5中白色柱形表示再分别向不同体系中加入100μm的苯硫酚，检测其在580nm的荧光强度。
从图5中可以看出在存在不同的干扰试剂下，探针对苯硫酚仍然具有较准确的检测效果，说明该探针的抗干扰能力强。
实施例2
本发明另一种快速识别含-sh化合物的荧光探针的制备方法，具体包括以下步骤：
中间体a的合成：将1g(6.84mmol)的2,7-萘啶-1(2h)-酮和9.81g(34.21mmol)的三溴氧磷溶于10ml的乙腈中，加热到80℃反应1h。向反应体系中加入冰水使三溴氧磷淬灭，然后调ph至中性。将溶液用二氯甲烷萃取3次，然后用na2so4干燥二氯甲烷萃取液，经过减压蒸馏得到红色粗产品，继续硅胶柱色谱纯化，制得白色固体，即为中间体a(980mg,yield69%)。1hnmr(400mhz,cdc13):δ9.76(s,1h),8.82(d,j=4hz,1h),8.48(d,j=4hz,1h),7.68(d,j=8hz,1h),7.61(d,j=8hz,1h)。
中间体b的合成：在氩气条件下，将400mg(1.91mmol)的中间体a和134mg(0.19mmol)的pd(pph3)cl2溶解于10ml的二氧六烷。然后依次加入已溶解了138mg(2.3mmol)甲基硼酸的10ml的二氧六烷溶液和209mg(2.5mmol)的碳酸氢钠，在130℃搅拌反应1h。然后减压蒸馏除溶剂，残留液经硅胶柱色谱法纯化，制得黄色稠状液体，即为中间体b(180mg,yield66%)。1hnmr(400mhz,cdc13):δ9.59(s,1h),8.71(d,j=5.6hz,1h),8.57(d,j=6hz,1h),7.61(d,j=5.6hz,1h),7.48(d,j=6hz,1h),3.06(s,3h)。
中间体c的合成：将144mg(1mmol)的中间体b溶于10ml的乙酸中，向反应液中滴加211mg(1.2mmol)的液溴，室温下搅拌5小时。反应完毕后用nahco3调至中性，然后用二氯甲烷多次萃取，萃取液用na2so4干燥，经过减压蒸馏和硅胶柱色谱法纯化制得黄色油装液体，即为中间体c(154mg,yield69%)。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.66(s,1h),9.02(s,1h),8.73(d,j=5.7hz,1h),7.78(d,j=5.5hz,1h),3.04(s,3h)。
中间体d的合成：将100mg(0.45mmol)的中间体c、77.1mg(1.35mmol)的氮杂环丁烷、53mg(0.54mmol)的叔丁醇钠、51.8mg(0.09mmol)的pd(dba)2和85.8mg(0.18mmol)的2-二环己基磷-2,4,6-三异丙基联苯溶解于二氧六烷，在氩气保护下100℃反应12h。反应完毕后，将反应液冷却至室温，经过滤、50ml二氯甲烷洗涤、减压蒸馏制得粗产品。粗产品经硅胶柱色谱法纯化制得黄色油状液体，即为中间体d(53.8mg,yield60%)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.97(s,1h),8.41(d,j=5.4hz,1h),7.83(s,1h),7.63(d,j=5.7hz,1h),4.21(t,j=6.9hz,5h),2.91(s,3h),2.43-2.33(m,2h)。
中间体e的合成：将199mg(1mmol)的中间体d、112mg(0.92mmol)的对羟基苯甲醛、0.5ml哌啶和0.5ml的乙酸溶于30ml的甲苯中，140℃反应12h。反应液经减压蒸馏、硅胶柱色谱法纯化制得黄色固体，即为中间体e(146mg,yield48%)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.50(s,1h),8.93(d,j=2.8hz,1h),8.62(d,j=5.6hz,1h),8.49-8.46(m,1h),8.38(d,j=15.2hz,1h),8.08(t,j=11.7hz,3h),7.87(s,1h),7.72(d,j=5.6hz,1h),7.35(d,j=8.4hz,2h),7.28(d,j=9.2hz,1h),4.25(t,j=7.2hz,4h),2.45-2.38(m,2h)。
荧光探针的合成：将50mg(0.2mmol)的中间体e溶解在无水二氯甲烷（6ml）中，加入三乙胺（37mg，0.36mmol），在冰水浴搅拌下，逐滴加入溶解在无水二氯甲烷（10ml）中的2,4－二硝基苯磺酰氯（65mg，0.24mmol）。继续冰水浴搅拌1h后，反应体系澄清，红色溶液，常温反应10h，tlc板跟踪反应原料消失，停止反应。采用柱色谱分离，用石油醚：乙酸乙酯（1:1，v/v）作为洗脱剂淋洗，得到黄色固体55mg，即得荧光探针(yield57%)，请参见图7和图8。
该种荧光探针的与含-sh化合物谷胱甘肽的检测反应：
测定荧光探针与谷胱甘肽反应的效果。通过一系列条件的筛选，最终选择的测试条件是，pbs浓度10mm,ph7.4，温度37℃，此为生物体适宜的生理条件。反应机理为亲核取代，谷胱甘肽利用自身的巯基，进攻探针醚键的氧原子，醚键断裂，由于2,4-二硝基苯磺酰氯的不稳定性，会生成so2气体同时释放出荧光团从而发射荧光。反应原理请参见图6。
测定该种荧光探针在不同干扰因子下的抗干扰性。
将本荧光探针与带有不同干扰因子的谷胱甘肽样品进行测试反应，采用实施例2测试条件和方法，以检测本荧光探针在不同干扰因子下对谷胱甘肽的敏感度是否受到干扰，请参见图9，结果反映出不同干扰因子对谷胱甘肽的干扰非常小，说明本荧光探针抗干扰性强。
以上对本发明的实施例进行了示例性说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依据本发明申请范围的均等变化与改进等，均应归属于本发明的专利涵盖范围之内。