本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种同时区分检测cys、hcy和gsh多功能荧光分子探针的合成，以及该探针在血清和细胞中通过不同的反应现象与荧光信号同时区分检测cys、hcy和gsh等方面的应用。
背景技术
小分子生物硫醇如半胱氨酸(cys)、高半胱氨酸(hcy)和谷胱甘肽(gsh)在生物系统中扮演着复杂而重要的角色。cys在正常细胞内浓度为30-200μm，含量异常会导致生长缓慢，水肿，嗜睡，心血管和肝损伤等疾病(chemicalcommunication,2013,49,9176-9178)。血清中hcy正常浓度约为5-12μm，正常细胞中的含量是三种生物硫醇最低的，但过量的hcy会导致阿尔茨海默氏症，叶酸和vb12缺乏以及心血管疾病等疾病(chemicalcommunication,2014,50,6967-6969)。gsh在正常细胞内浓度为0.5-10mm，是细胞中最丰富的低分子量生物硫醇，作为细胞内抗氧化剂维持体内氧化还原反应平衡，清除细胞毒素和自由基，但是gsh含量异常会导致白细胞含量异常，hiv感染，癌症等潜在风险(biosensorsandbioelectronics,2017,90,117-124)。由于这三种生物硫醇具有相似的结构和反应活性，目前很少有高效的方法/工具能够区别检测这三种生物硫醇，考虑到它们重要的生物学作用，同时区分检测细胞内cys，hcy和gsh对深入了解它们的生物学功能以及它们与各种相关疾病的关系非常重要。
近年来，荧光探针由于具有高灵敏度和高选择性，被广泛用于生物硫醇和氨基酸的检测。由于半胱氨酸(cys)、高半胱氨酸(hcy)和谷胱甘肽(gsh)的结构与化学性质相似，虽然已经提出了一些基于不同机制的特异性荧光探针检测cys/hcy和gsh，但已公开的专利/文献中很少有能够同时区分检测cys、hcy和gsh这三种生物硫醇的报道，大部分已报道的荧光探针只能选择性检测其中的1种或2种(如中国专利cn105524055a、cn105588823a、cn105601658a、cn105712964a、cn105820810a和cn105906534a)，尽管有报道荧光探针可以同时检测cys、hcy和gsh，但是在同一检测条件下对于化学结构非常相似的cys和hcy区分效果并不理想，或者需要添加外加物辅助检测(journaloftheamericanchemicalsociety,2014,136,574-577；chemicalscience,2016,7,256-260)，但是无法实现利用三种荧光信号同时区分检测三种生物硫醇(analyticalchemistry,2015,87,3460–3466)，能同时区分检测细胞中cys，hcy和gsh这三种生物硫醇的专利/文献鲜有报道。
技术实现要素：
鉴于上述情况，克服一些现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种同时区分检测cys、hcy和gsh多功能荧光分子探针，能在特定检测条件下对cys、hcy和gsh三种生物硫醇达到同时区分检测的目的。
本发明的目的还在于提供一种制备方法简单、高灵敏度、检测限低和成本较低的上述荧光分子探针的合成与应用方法。
本发明解决问题采取的具体技术方案为，一种同时区分检测cys、hcy和gsh多功能荧光分子探针的合成及应用，其探针的化学结构式如下：
一种同时区分检测cys、hcy和gsh多功能荧光分子探针的合成，其特征在于，所述荧光分子探针的制备方法包括以下步骤：
步骤1.合成7-（二乙基氨基）-4-羟基色烯-2-酮
a.将适量丙二酸二苯酯与3-二乙氨基苯酚加入无水甲苯中，加热回流反应7-9小时，
b.待反应冷至室温后过滤，滤饼用乙醚洗涤，固体真空干燥，得米黄色固体7-（二乙基氨基）-4-羟基色烯-2-酮；
步骤2.合成7-(n,n-二乙基氨基)-4-氯香豆素-3-甲醛
步骤3.合成（e）-2-（苯并[d]噻唑-2-基）-3-（4-氯-7-（二乙基氨基）-2-氧代-2h-色烯-3-基）丙烯腈
本发明的同时区分检测cys、hcy和gsh多功能荧光分子探针的使用方法：通常可以在室温下将探针分子溶解在有机相和水相体积比6:4的环境下测试，有机相为二甲基亚砜(dmso)，水相为ph=7.4的磷酸盐缓冲溶液(pbs)。
本发明的一种同时区分检测cys、hcy和gsh多功能荧光分子探针的具体特征如下：该分子荧光探针用二甲基亚砜(dmso)溶解，探针分子在有机相和水相(6:4,v/v)溶液中，最大紫外吸收波长为500nm，加入cys后，5分钟后500nm左右的吸收峰会消失，在374nm处产生一个新的紫外吸收峰，同时颜色由红色变为浅黄色，在荧光发射光谱中用360nm激发波长激发时发射457nm的强蓝色荧光；与hcy反应15分钟后，紫外吸收产生391nm和492nm两个新吸收峰，同时颜色由红色变为深黄色，用480nm激发波长激发时发射559nm的强黄绿色荧光；与gsh作用5分钟后，紫外吸收光谱蓝移至432nm，检测溶液颜色变为浅黄色，用400nm激发波长激发时发射529nm的绿色荧光。探针本身用360nm、480nm和400nm波长激发时均无明显荧光，而且检测三种生物硫醇时只能用特定的激发波长检测某一种生物硫醇，如检测cys时用360nm激发才会产生强蓝色荧光，用检测hcy/gsh的激发波长(400/480nm)激发时均无荧光或荧光很弱。当三种生物硫醇共同存在时，应用该探针也能够很好地区分检测这三种生物硫醇。上述荧光分子探针实现了在特定检测条件下同时区分检测cys、hcy和gsh，对nac,tyr,pro,leu,ser,arg,his,glu，ala,asp,lys,thr,phe,aco-,br-,cn-,co32-,hco3-,hs-,hso3-,hso4-,no3-,scn-和so32-等氨基酸和阴离子均无明显响应，该探针对cys、hcy和gsh三者的检测限分别低至0.5nm、3.6nm和6.8nm。因此，本发明公开的荧光分子探针能够实现对cys、hcy和gsh这三种生物硫醇的同时区分定量检测，选择性和灵敏度高，而且适合裸眼检测。此外，探针的合成成本和检测成本较低，操作简单，利用不同机理、不同检测现象和荧光发射光谱同时检测cys、hcy和gsh的多功能荧光探针在生物化学、分析检测、体外诊断等领域都具有较大的实际应用价值。
具体实施方式
下面对本发明做进一步解释。
本发明所述的荧光分子探针的合成路线如下式所示：
实施例1.合成合成7-（二乙基氨基）-4-羟基色烯-2-酮
将12.8g(49.93mmol)丙二酸二苯酯与8.25g(49.93mmol)3-二乙氨基苯酚加入50ml无水甲苯中，加热回流反应7小时。反应完毕后冷至室温，过滤，用乙醚洗涤滤饼，固体真空干燥，得米黄色固体7-（二乙基氨基）-4-羟基色烯-2-酮3.28g，产率为28.2%。
实施例2.合成7-(n,n-二乙基氨基)-4-氯香豆素-3-甲醛
在氮气保护条件下，将2.8ml干燥重蒸的dmf缓慢滴加到2.8mlpocl3中，在20-50℃下搅拌40分钟，得红色溶液；将7-（二乙基氨基）-4-羟基色烯-2-酮2.33g(9.99mmol)溶于13.2mldmf中，逐滴加入到上述红色溶液中，混合物继续在氮气保护下60℃搅拌反应12小时；然后将反应液倒入100ml冰水中，用20%的naoh溶液调节ph至6，大量沉淀析出，过滤，滤饼用适量去离子水洗涤3次，固体真空干燥，得7-(n,n-二乙基氨基)-4-氯香豆素-3-甲醛1.84g，产率66.7%。
实施例3.合成（e）-2-（苯并[d]噻唑-2-基）-3-（4-氯-7-（二乙基氨基）-2-氧代-2h-色烯-3-基）丙烯腈
将7-(n,n-二乙基氨基)-4-氯香豆素-3-甲醛100mg(357.50μm)和苯并噻唑-2-乙腈62.3mg(357.50μm)加入到7ml无水乙醇中，室温反应过夜，反应完毕后将反应液过滤，所得固体真空干燥，得（e）-2-（苯并[d]噻唑-2-基）-3-（4-氯-7-（二乙基氨基）-2-氧代-2h-色烯-3-基）丙烯腈99.9mg，产率63.8%。
实施例4.荧光分子探针在检测cys、hcy和gsh中的应用
本发明所述的荧光分子探针光谱性质实验：将探针溶解在二甲基亚砜(dmso)中配置成1mm的探针溶液，分别配置1mm的cys、hcy和gsh水溶液，10mm的tyr,pro,leu,ser,arg,his,glu，ala,asp,lys,thr,phe,aco-,br-,cn-,co32-,hco3-,hs-,hso3-,hso4-,no3-,scn-和so32-水溶液，检测cys、hcy和gsh在有机相和水相体积比6:4的室温条件下测试，有机相为配置1mm探针溶液的二甲基亚砜(dmso)和检测时加入的dmso，水相为cys、hcy和gsh水溶液和检测时加入的pbs磷酸盐缓冲液。具体测试方式为：取20μl1mm的探针溶液，1180μl的分析纯dmso，所需量的1mm的cys/hcy/gsh水溶液和所需量的pbs缓冲水溶液于2ml的样品管中，所有测试均保持有机相和水相的体积比为6:4(每一个测试样品总体积为2ml)，例如当要求测试cys浓度为50μm时探针与cys反应后的荧光强度，配制样品情况为20μl1mm的探针溶液，1180μl的分析纯dmso，100μl1mm的cys水溶液和700μl的pbs缓冲溶液于2ml的样品管中，震荡摇匀15分钟后即可测试荧光强度。本发明提供的探针分子实现了用不同的激发波长和荧光发射信号高选择性的区分检测cys，hcy和gsh这三种生物硫醇，非常适合血清和细胞内cys、hcy和gsh的定量/成像分析。
实施例5.活细胞内cys、hcy和gsh的荧光成像分析
以hela细胞为例：将hela细胞传代至共聚焦皿细胞培养基中，在标准生长条件下培养24小时后，加入适量n-乙基马来酰亚胺(0.5mm)继续培养30分钟，然后用加入cys/hcy/gsh(500μm)和探针(2.5μm)在标准生长条件下继续培养30分钟，在共聚焦荧光显微镜下照相，用蓝色/绿色/红色荧光通道进行细胞内cys/hcy/gsh的荧光成像分析。
本发明的一种同时区分检测cys、hcy和gsh多功能荧光分子探针的合成及应用，基于同一探针、不同机理、不同检测现象和荧光发射信号、高灵敏度、高选择性快速同时区分检测cys、hcy和gsh的荧光探针尚属首例报道，在生物化学、分析检测、体外诊断等领域都具有较大的实际应用价值。同时为今后生物硫醇荧光探针的发展提供了一些思路。尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细的介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，具有本文所述技术特征的一种同时区分检测cys、hcy和gsh多功能荧光分子探针的合成及应用，均落入本专利的保护范围。