本发明属于转基因生物环境风险评价和分析技术领域，具体涉及一种建立转基因漂移环境安全检测的比较杂种群体取样方法。
背景技术
转基因技术的迅猛发展，持续不断地推动着转基因植物的培育，转基因作物的商品化种植给提高农作物产量、减少农药施用、改善农业生态环境以及解决粮食安全问题提供了新途径。然而，转基因可能通过基因漂移从作物逃逸到其野生近缘种群体，从而可能带来一定的环境风险。因此，在转基因作物商品化之前必须对转基因漂移后可能带来的潜在环境风险进行检测和评估，以确保转基因作物的安全和可持续利用。对转基因作物的转基因漂移后可能带来的环境风险进行评价，是基于该转基因通过基因漂移进入作物的野生近缘种群体后是否改变了野生近缘种群体的适合度，即：通过对包含转基因或不包含该转基因的作物-野生近缘种杂种后代分离实验群体在同质园的环境条件下进行适合度相关性状分析比较，从而预测和评价通过天然杂交（基因漂移）进入作物野生近缘种的转基因是否会导致环境风险。
传统的转基因作物适合度效应检测的杂种后代个体取样，是以转基因为标记对作物-野生近缘种杂种分离后代群体中含有或不含有转基因的个体进行鉴定，然后从杂种后代的分离群体中，分别随机抽取出含有转基因或不含转基因的杂种个体，建立个体数量相同、含转基因或不含转基因的比较群体。然而，这种传统的取样方法，会导致两个比较群体之间来自双亲等位基因的偏分离的差异以及遗传背景不一致现象，即：含转基因的群体中拥有更多的作物等位基因，而不含该转基因的群体拥有更多的作物野生近缘种等位基因。这两个群体除了在是否含有转基因方面存在差别，在遗传背景上也表现不一致，从而导致适合度评价的结果不能真实、准确的反映由转基因带来的适合度效应。因此，需要建立一种更加合理的群体取样方法，确保获得的含转基因的比较群体（p+）和不含该转基因的比较群体（p-），除了在是否含有转基因方面存在差异之外，应该在遗传背景上非常接近，这样才能够真实评价由转基因带来的适合度效应，准确预测通过基因漂移进入作物野生近缘种的该转基因是否会导致环境风险。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种建立用于转基因漂移环境安全检测的适合度比较杂种群体取样方法，以降低在传统取样方法构建含转基因与不含转基因的比较群体中，由于取样（人工选择）而导致比较群体之间来自双亲的等位基因偏分离的差异以及遗传背景不一致的现象，使评价的结果更接近真实情况。
转基因漂移是否会带来环境风险，这在很大程度上取决于该转基因漂移到作物的野生近缘种后，是否会导致作物野生近缘种适合度（指在一定条件环境下，生物体能够生存并传递其基因给后代的能力）发生显著改变。当适合度有较大程度的增加（适合度利益）或降低（适合度成本）均可能导致不同的环境风险，但是这种风险检测的准确性依赖于比较群体（p+和p-）之间的遗传背景是否相同。本发明建立了一种新的转基因漂移环境安全检测的比较杂种群体取样方法，对含有转基因和不含该转基因的作物-野生近缘种杂交后代分离实验群体（f2，f3）进行2次抽样，确保获得的含转基因的比较群体（p+）与不含转基因的比较群体（p-）除了在是否含有转基因方面存在差异之外，遗传背景非常接近，从而达到真实评价转基因适合度效应的目的，进而用于准确预测和评价通过天然杂交（基因漂移）进入作物野生近缘种的转基因是否会导致环境风险。
本发明提出的建立转基因漂移环境安全检测的比较杂种群体取样方法，具体步骤如下：
（1）在任意一种转基因作物与其野生近缘种的杂种后代自交分离群体中，以该转基因为分子标记，对群体中含有该转基因的杂种个体进行取样，形成含有该转基因的比较群体（即转基因阳性群体p+）；
（2）在相同的杂种后代自交分离群体中，利用某一个来自作物亲本的中性分子标记和该转基因为分子标记对杂种个体进行取样，形成一个不包含有该转基因，而且与转基因阳性群体数量相同的比较群体（即转基因阴性群体p-）；p群体的建立方法和过程如下：
a.选择一个来自作物亲本而且与该转基因位于同一染色体上、距离很近但没有物理连锁的中性分子标记，对群体中含有该中性标记的杂种个体进行取样，形成含有该中性标记的群体（标记群体pm）；
b.在这一标记群体pm中，以该转基因为分子标记进行杂种个体鉴定，淘汰群体中含有该转基因的杂种个体，使群体中不再包含该转基因，以此形成一个与转基因阳性群体p+个体数量相同而且不含转基因的比较群体（转基因阴性群体p-）；
（3）利用同质园实验，对p+群体和p-群体进行适合度相关性状的比较，根据p+群体和p-群体的适合度比较的结果，预测该转基因通过基因漂移进入作物野生近缘种群体是否会导致环境风险。
本发明方法，其关键利用转基因作为分子标记，同时利用一个与该转基因位于同一染色体上、距离很近但没有物理连锁的中性分子标记对转基因作物-野生近缘种杂种分离后代的实验群体进行2次取样，分别形成含转基因的比较群体（p+）和不含该转基因的比较群体（p-）。本发明提出的这种新的转基因作物适合度效应检测的比较杂种群体的取样方法，在转基因漂移环境安全评价的过程中，降低了由于取样而导致的比较群体之间来自双亲等位基因的偏分离的差异以及遗传背景不一致的现象，从而避免或降低了转基因适合度效应分析的误差，使评价的结果更接近真实情况，在转基因作物的基因漂移及其环境风险评价方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为利用传统的取样方法进行转基因适合度分析，检测转基因阳性（p+）和转基因阴性（p-）杂种群体的适合度效应，会导致比较群体之间的遗传背景差异。c为作物基因组，w为野生种基因组。
图2为利用本发明的取样方法进行转基因适合度分析，检测转基因阳性（p+）和转基因阴性（p-）杂种群体的适合度效应，p+群体和p-群体之间的遗传背景非常接近。c为作物基因组，w为野生种基因组。
图3（a）为利用传统的杂种群体取样方法，以豇豆胰蛋白酶抑制剂抗虫转基因（cpti）为分子标记进行取样，形成的包含cpti转基因（阳性群体，p+）和不含cpti转基因（阴性群体，p-）这两个比较实验群体之间的等位基因频率不一致；图3(b)为利用本发明的杂种群体取样方法，形成的包含cpti转基因（阳性群体，p+）与包含中性分子标记rm10289但不含cpti转基因（阴性群体，p-）这两个比较实验群体之间的等位基因频率非常接近。
具体实施方式
实施例1
利用传统的取样方法构建的包含抗虫转基因cpti（阳性群体，p+）和不含抗虫转基因cpti（阴性群体，p-）的比较实验群体，在对p+群体和p-群体的遗传分析过程中，发现p+和p-比较群体在部分ssr位点上，表现为来自双亲的等位基因的频率不同，具有偏分离现象，进一步计算p+和p-比较群体之间的遗传分化指数（fst）值表明，比较群体之间的遗传背景存在明显的差异（图1），这样的差异会严重影响对抗虫转基因cpti适合度效应的分析结果。
利用传统的取样方法构建包含抗虫转基因cpti（阳性群体，p+）和不含抗虫转基因cpti（阴性群体，p-）的比较群体，其步骤如下：
（1）确定杂交组合：抗虫转基因水稻（cc）×杂草稻（ww）；
（2）通过人工杂交，获得含抗虫转基因的杂种f1群体（cw）；
（3）对杂种f1群体进行套袋自交，获得f2分离群体；
（4）对f2分离群体进行抗虫转基因的分子鉴定，分别获得包含抗虫转基因的阳性f2个体（f2+）和不含转基因的阴性f2个体（f2-）；
（5）分别将f2+和f2-个体随机组成数量相同的包含cpti转基因（阳性群体，p+）和不含cpti转基因（阴性群体，p-）的比较群体。
从f2分离群体中随机选择1000个体进行萌发并提取dna，利用cpti转基因作为标记，设计相应的转基因筛选引物（cpti1），并对上述dna进行聚合酶链式反应（pcr）和琼脂糖凝胶电泳检测，所有出现415bp电泳条带的个体鉴定为含cpti转基因的个体（f2+），从中随机抽取200个个体（f2+）组成包含cpti转基因的阳性（p+）比较群体；从剩余的不含cpti转基因的个体中随机抽取200个个体，组成不包含cpti转基因的阴性（p-）比较群体。
实验材料如表1所示。
表1实施例1中所包含的实验材料
随机选择40对在栽培稻和杂草稻亲本中具有多态性的ssr分子标记，通过pcr和ssr基因型分型，分别计算p+群体和p-群体中每个ssr位点来自栽培稻亲本（cc）和杂草稻亲本（ww）的等位基因频率，利用卡方检验鉴定出具有显著偏离孟德尔分离（即偏分离）的位点，计算p+群体和p-群体中发生了偏分离的ssr位点的平均等位基因频率；在此基础上，计算p+群体和p-群体之间的遗传分化指数（fst），以遗传分化指数值，评价这两个比较群体的遗传背景差异。结果如下：
1、p+群体和p-群体在12个ssr位点产生了等位基因的偏分离，其中p+群体表现为等位基因偏向于栽培稻亲本（cc），即等位基因c的基因频率数值高于等位基因w的基因频率数值；p-群体表现为等位基因偏向于杂草稻亲本（ww），即等位基因c的基因频率数值低于等位基因w的基因频率数值（表2）。
表2含抗虫转基因（cpti）的比较群体（p+）和不含转基因的比较群体（p-）在发生偏分离的12个ssr位点上栽培稻等位基因c与杂草稻等位基因w的基因频率数值（卡方检验的p值均小于0.01）
2、统计计算p+群体和p-群体中来自栽培稻亲本的等位基因c的平均频率，发现p+群体中来自于栽培稻的等位基因c的平均频率高于p-群体（图3a），而且p+群体和p-群体都发生了等位基因偏分离。
3、根据p+群体和p-群体各ssr标记的基因型数据矩阵，计算出p+群体和p-群体之间的遗传分化指数值fst：
其中，ht为f2分离实验群体处于哈温平衡时的预期杂合度，hs为p+群体和p-群体处于哈温平衡时的预期杂合度，计算出fst的值为0.025，表明p+群体和p-群体之间产生了明显的遗传分化，即这两个群体的遗传背景存在明显差异。
4、由于p+群体和p-群体的遗传背景存在明显的差异，因此，在利用同质园实验进行环境生物安全评价的过程中，无法准确评价适合度相关性状的差异是由于比较群体的遗传背景差异造成，还是由于转基因cpti造成。因此，利用传统的取样方法构建的p+和p-比较实验群体并进行适合度分析方法获得的结果，可能会对转基因cpti的适合度效应产生误判，影响我们对转基因cpti漂移到作物野生近缘种的环境风险评价。
实施例2
利用本发明的取样方法构建包含抗虫转基因cpti（阳性群体，p+）和不含抗虫转基因cpti（阴性群体，p-）的比较实验群体。在对p+群体和p-群体的遗传分析过程中，发现p+和p-比较群体在一些ssr位点上，虽然表现为来自双亲的等位基因具有偏分离现象，但是p+群体和p-比较群体之间的遗传分化指数（fst）值非常小，表明p+群体和p-群体之间的遗传背景非常接近（图2），检测到的适合度差异，能够真实反映转基因所带来的差异，有利于对cpti抗虫转基因漂移到作物野生近缘种环境风险的正确评价。
利用本发明的取样方法构建包含抗虫转基因cpti（阳性群体，p+）和不含抗抗虫转基因cpti（阴性群体，p-）的比较实验群体的步骤如下：
（1）确定杂交组合：抗除草剂转基因水稻（cc）×杂草稻（ww）；
（2）通过人工杂交，获得含抗虫转基因的杂种f1群体（cw）；
（3）对杂种f1群体进行套袋自交，获得f2分离群体；
（4）对f2分离群体进行抗虫转基因的分子鉴定，获得包含抗虫转基因的阳性f2个体（f2+）和不包含抗虫转基因的阴性f2个体（f2-）；
（5）利用一个来自于栽培稻的ssr分子标记（与抗虫转基因cpti在同一条染色体上、距离很近但没有物理连锁的中性分子标记）对f2分离群体的个体进行鉴定，获得含栽培稻ssr分子标记的f2分离群体（pm）和不含栽培稻ssr分子标记的f2分离群体（pm1）；
（6）对pm群体进行抗虫转基因cpti的分子鉴定，获得含抗虫转基因的个体（pm+）和不含抗虫转基因的个体（pm-）；
（7）分别将f2+和pm-个体随机组成数量相同的包含抗虫转基因cpti（阳性群体，p+）和不含转基因cpti（阴性群体，p-）的比较群体。
实验材料如表3所示。
表3实施例2中所包含的实验材料
从f2分离群体中随机选择2000个体进行萌发并提取dna，利用抗虫转基因cpti作为筛选标记，设计相应的转基因筛选引物（cpti1），并对上述dna进行聚合酶链式反应（pcr）和琼脂糖凝胶电泳检测，所有出现415bp电泳条带的个体鉴定为含cpti转基因的个体（f2+），随机抽取200个个体（f2+），组成包含抗虫转基因cpti的比较群体（p+）。
从f2分离群体中随机选择2000个体进行萌发并提取dna，利用栽培稻ssr分子标记rm10289（与转基因cpti在同一条染色体上，且距离转基因的物理位置<300kb，在栽培稻群体与杂草稻群体中具有多态）和转基因引物cpti1对上述dna进行pcr和琼脂糖凝胶电泳检测，所有出现栽培稻rm10289电泳条带（88bp）且不出现抗虫转基因特征电泳条带（415bp）的个体组成不包含抗虫转基因cpti的f2分离个体（pm-），从中随机抽取200个个体（pm-），组成不包含抗虫转基因cpti的比较群体（p-）。
ssr分子标记（rm10289）的序列信息如下：
正向引物（5’-3’）：cttgattggctcttctgtcaatgg
反向引物（5’-3’）：gaattcgatctgcatctgtcacg。
随机选择40对在栽培稻和杂草稻亲本中具有多态性的ssr分子标记，通过pcr和ssr基因型分型，分别计算p+群体和p-群体中每个ssr位点来自栽培稻亲本（cc）和杂草稻亲本（ww）的等位基因频率，利用卡方检验鉴定出具有显著偏离孟德尔分离（即偏分离）的位点，计算p+群体和p-群体中发生了偏分离的ssr位点的平均等位基因频率；在此基础上，计算p+群体和p-群体之间的遗传分化指数（fst），以遗传分化指数值，评价这两个比较群体的遗传背景差异。结果如下：
1、p+群体和p-群体在12个ssr位点产生了等位基因的偏分离，而且这两个群体的等位基因偏离都表现为偏向栽培稻亲本（cc），即等位基因c的基因频率数值高于等位基因w的基因频率数值（表4）；
2、统计计算p+和p-群体中来自栽培稻亲本（cc）的等位基因的平均频率，发现p+群体和p-群体来自于栽培稻亲本（cc）的等位基因平均频率之间差异很小（图3b）；
3、根据p+群体和p-群体各ssr标记的基因型数据矩阵，计算出p+群体和p-群体之间的遗传分化指数值：
其中，ht为f2分离实验群体处于哈温平衡时的预期杂合度，hs为p+群体和p-群体处于哈温平衡时的预期杂合度，计算出fst的值为<0.0001，表明p+群体和p-群体之间遗传分化很小，即这两个群体的遗传背景非常接近；
4、由于p+群体和p-群体的遗传背景非常接近，因此，在同质园实验进行环境生物安全评价的过程中，检测到的适合度相关性状差异就是由于转基因cpti造成。因此，利用本发明取样方法获得的适合度分析结果，真实的反映了转基因所带来的适合度效应，避免了对转基因cpti适合度效应评价的误判，有利于我们对转基因cpti漂移到作物野生近缘种环境风险的正确评价。
表4以rm10289分子标记取样，含抗虫转基因cpti的比较群体（p+）和不抗虫转基因的比较群体（p-）在发生偏分离的12个ssr位点上栽培稻等位基因c与杂草稻等位基因w的基因频率数值（卡方检验的p值均小于0.01）