本发明涉及一种改进的2-酮基-l-古龙酸发酵生产工艺，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
维生素c(vitaminc，简称vc)又称l-抗坏血酸(l-ascorbicacid)，在医药和食品工业中都占有很重要的地位，目前国内普遍采用我国自主研发的“二步发酵法”生产，“二步发酵法”的第一步是单菌发酵：①通过一步菌种将d-山梨醇转化成l-山梨糖，②对山梨糖醪液进行30分钟70～80℃的低温灭菌后处理，杀灭山梨糖醪液中的一步菌种；第二步是混合菌发酵：通过二步菌种将l-山梨糖转化成2-酮基-l-古龙酸(2-kga)；2-酮基-l-古龙酸再经过提取和转化生成维生素c。
在“二步发酵法”生产维生素c的过程中，第一步发酵的产物l-山梨糖作为第二步发酵的底物，在第一步发酵结束后要首先对山梨糖醪液进行30分钟70～80℃的低温灭菌处理，然后才能将其一次性全部合入二步培养基中，而在将第一步发酵的产物山梨糖醪液合入到二步培养基中后，二步培养基的初始山梨糖浓度可达11～14％；并且在第二步发酵的过程中为了维持一定的酸碱平衡，促进菌种的代谢产酸，需使用经灭菌处理后的无菌碳酸钠溶液调节ph值。这样的维生素c生产工艺：1、第一步发酵结束后对山梨糖醪液进行的低温灭菌处理，对山梨糖的营养成分有所破坏；2、将第一步发酵的产物山梨糖醪液一次性全部合入到二步培养基中，导致二步培养基的初始糖浓度较高，因菌种对高糖浓度的适应能力和耐受能力有限，致使菌种生长的迟滞期比较长，延长了发酵周期，并限制了终点酸的进一步提高；3、使用无菌碳酸钠溶液调节二步发酵液的ph值，碳酸钠溶液的配制、灭菌在人力和动力方面消耗较多。
为了节降成本、提高生产效率、扩大产能，需对2-酮基-l-古龙酸的发酵生产工艺进行改进。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，而提供“二步发酵法”维生素c生产技术一种改进的2-酮基-l-古龙酸发酵生产工艺，以节降2-酮基-l-古龙酸发酵生产成本，并提高其生产效率，促进“二步发酵法”维生素c生产技术的进步。
本发明解决其技术问题所采取的技术方案为：一种改进的2-酮基-l-古龙酸发酵生产工艺，它是按如下步骤：
第一步、单菌发酵
通过一步菌种将d-山梨醇转化成l-山梨糖；
第二步、混合菌发酵
将部分第一步发酵的产物山梨糖醪液直接合入到二步培养基中，至二步培养基的初始山梨糖浓度达2.0～9.0％，接种二步菌种，培养，当发酵液中的残留山梨糖浓度降至1.0～5.0％时，开始进行剩余山梨糖醪液的连续补加，并在此后的发酵过程中，通过补加剩余山梨糖醪液维持发酵液的残留山梨糖浓度在0.5～4.0％，发酵终止前停止补加，至发酵液的残留山梨糖浓度≤0.5mg/ml时终止发酵，在整个混合菌发酵期间控制温度在28～33℃，使用15～25％的氢氧化钠溶液调节发酵液的ph值：
(1)、初始阶段维持发酵液的ph值为7.5～8.5；
(2)、当发酵液中2-酮基-l-古龙酸的含量达5～15mg/ml时，将发酵液的ph值下调至6.5～7.0；
(3)、当发酵液中2-酮基-l-古龙酸的含量达50～90mg/ml后，将发酵液的ph值调整为7.0～7.5，至终点，生产2-酮基-l-古龙酸的。
本发明所提供的这种改进的2-酮基-l-古龙酸发酵生产工艺，1、取消了对第一步发酵产物山梨糖醪液进行低温灭菌后处理的过程，而通过在第二步发酵的初始阶段调高发酵液ph值的手段来抑制发酵液中一步菌种的生长繁殖，从而达到快速降低一步菌种活性的目的；2、当二步发酵液中的残留山梨糖浓度降至1.0～5.0％时，开始进行剩余山梨糖醪液的连续补加，并在此后的发酵过程中，通过补加剩余山梨糖醪液维持发酵液的残留山梨糖浓度在0.5～4.0％，当发酵液中2-酮基-l-古龙酸的含量达5～15mg/ml时，将发酵液的ph值下调至6.5～7.0，使发酵液解除高糖浓度对微生物生长的抑制作用，仅维持适宜的渗透压，并予二步菌种生长繁殖最适宜的ph值环境，促进二步菌种的生长繁殖；3、在第二步发酵的最后阶段，调整发酵液的ph值至7.0～7.5，促进二步菌种的代谢产酸；4、在整个混合菌发酵的过程中，使用15～25％的氢氧化钠溶液替代现有技术中的碳酸钠溶液调节发酵液的ph值，由于氢氧化钠碱性强，在15～25％的溶液中几乎无微生物存活，因而无需对使用的氢氧化钠溶液进行灭菌处理。
本发明取得的有益效果如下：
1、取消对第一步发酵产物山梨糖醪液进行低温灭菌后处理的过程，减少了高温对山梨糖成分的破坏，可缩短混合菌发酵周期，同时，取消对第二步发酵过程中使用的碱液的灭菌处理，可减少灭菌过程中人力和动力的消耗，节降生产成本。
2、开始仅将部分第一步发酵的产物山梨糖醪液合入到二步培养基中，使二步培养基的初始山梨糖浓度仅达2.0～9.0％，然后再在发酵的过程中补加剩余的山梨糖醪液，使发酵的过程中发酵液维持适宜的渗透压，再辅以对发酵液ph值的分段调控，达到在第二步发酵过程中抑制一步菌种生长繁殖而促进二步菌种繁殖和代谢的效果，可使发酵终点2-酮基-l-古龙酸含量由现有工艺的93.0～103.0mg/ml提升至130.0～155.0mg/ml，产酸速率由2.1～2.8g/l·h提升至3.0～3.7g/l·h，实现2-酮基-l-古龙酸的高效生产，利于提高设备利用率，增大产能。
具体实施方式
以下实例用于具体说明本发明，但本发明的保护范围并不仅仅局限于此，其要求保护的范围记载于权利要求的权项中。
实施例1：
一种改进的2-酮基-l-古龙酸发酵生产工艺，它是按如下步骤：
第一步、单菌发酵
通过一步菌种将d-山梨醇转化成l-山梨糖；
第二步、混合菌发酵
二步培养基配方(％)：玉米浆1.5、尿素0.1、磷酸二氢钾0.05、硫酸镁0.02，ph6.5～8.2；
将部分第一步发酵的产物山梨糖醪液直接(不经低温灭菌处理)合入到二步培养基中，至二步培养基的初始山梨糖浓度达9.0％，接种二步菌种，培养，当发酵液中的残留山梨糖浓度降至3.5～5.0％时，开始进行剩余未经低温灭菌处理的山梨糖醪液的连续补加，并在此后的发酵过程中，通过补加剩余未经低温灭菌处理的山梨糖醪液维持发酵液的残留山梨糖浓度在2.0～4.0％，发酵终止前7～15小时停止补加，至发酵液的残留山梨糖浓度≤0.5mg/ml时终止发酵，在整个混合菌发酵期间控制温度在28～33℃，使用15～25％的氢氧化钠溶液调节发酵液的ph值：
(1)、初始阶段维持发酵液的ph值为7.6～8.2；
(2)、当发酵液中2-酮基-l-古龙酸的含量达5～15mg/ml时，将发酵液的ph值下调至6.5～7.0；
(3)、当发酵液中2-酮基-l-古龙酸的含量达50～90mg/ml后，将发酵液的ph值调整为7.0～7.5，至终点，生产2-酮基-l-古龙酸的。
混合菌发酵结果：发酵周期45h，2-酮基-l-古龙酸浓度为139.57mg/ml，产酸速率3.10g/l·h，无菌度阴性。
实施例2：
一种改进的2-酮基-l-古龙酸发酵生产工艺，它是按如下步骤：
第一步、单菌发酵
通过一步菌种将d-山梨醇转化成l-山梨糖；
第二步、混合菌发酵
二步培养基配方(％)：玉米浆1.5、尿素0.1、磷酸二氢钾0.05、硫酸镁0.02，ph6.5～8.2；
将部分第一步发酵的产物山梨糖醪液直接(不经低温灭菌处理)合入到二步培养基中，至二步培养基的初始山梨糖浓度达2.5％，接种二步菌种，培养，当发酵液中的残留山梨糖浓度降至1.0～2.0％时，开始进行剩余未经低温灭菌处理的山梨糖醪液的连续补加，并在此后的发酵过程中，通过补加剩余未经低温灭菌处理的山梨糖醪液维持发酵液的残留山梨糖浓度在0.5～2.0％，发酵终止前3～8小时停止补加，至发酵液的残留山梨糖浓度≤0.5mg/ml时终止发酵，在整个混合菌发酵期间控制温度在28～33℃，使用15～25％的氢氧化钠溶液调节发酵液的ph值：
(1)、初始阶段维持发酵液的ph值为7.7～8.2；
(2)、当发酵液中2-酮基-l-古龙酸的含量达5～15mg/ml时，将发酵液的ph值下调至6.5～7.0；
(3)、当发酵液中2-酮基-l-古龙酸的含量达50～90mg/ml后，将发酵液的ph值调整为7.0～7.5，至终点，生产2-酮基-l-古龙酸的。
混合菌发酵结果：发酵周期43h，2-酮基-l-古龙酸浓度为146.88mg/ml，产酸速率3.42g/l·h，无菌度阴性。
以上实例为本发明的优选实施方式，对不同菌属的2-酮基-l-古龙酸生产菌种只须在以上实例构思的前提下做出相应的调整，这些调整也应视为本发明的保护范围。