一种基于金/鲁米诺纳米复合物的生物芯片及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物芯片，具体涉及一种基于金/鲁米诺纳米复合物的生物芯片及其制备方法和应用。

背景技术：

胆固醇是哺乳动物细胞中不可缺少的组成部分，对于维持正常的细胞功能有着极其重要的作用。同时胆固醇也是维持人体正常新陈代谢不可缺少的原料，是抗老防衰、延年益寿的重要物质，也是体内合成多种激素，如类固醇激素、维生素d、胆汁酸的重要原料。然而，胆固醇还是一把双刃剑，人体血液中胆固醇如果太高，会形成动脉粥样硬化，而动脉粥样硬化又是冠心病、心肌梗死和脑卒中的主要危险要素。可以说，胆固醇对于人体正常的生理代谢和生命过程具有重要的意义。因此，开发一种制备方法简便，操作简单，绿色环保，灵敏高效的高通量检测胆固醇的生物芯片对于进一步研究胆固醇十分重要。

胆固醇在胆固醇氧化酶的分解作用下会转化为胆甾烯酮和过氧化氢，而过氧化氢在大豆过氧化物酶及金纳米粒子的催化作用下可以氧化鲁米诺至激发态产生化学发光信号，从而实现对胆固醇的定量检测。同时，聚二甲硅氧烷由于其良好的可塑性及无毒性被广泛应用于芯片的制备，醋酸纤维素薄膜由于其良好的吸附性及生物相容性适用于基底修饰。基于以上原理及材料特性，可以实现一种简易生物芯片的制备并对胆固醇进行高通量、简便、灵敏的检测，对胆固醇的进一步研究具有深远的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于金/鲁米诺纳米复合物的生物芯片及其制备方法，该生物芯片可实现高通量、快速简便地检测胆固醇。

一种基于金/鲁米诺纳米复合物的生物芯片，包括聚二甲硅氧烷微孔模板，在模板的微孔中有醋酸纤维素薄膜形成基底，在基底上固定有金/鲁米诺纳米复合物，在模板的微孔中还包埋有大豆过氧化物酶和胆固醇氧化酶。

进一步地，所述金/鲁米诺纳米复合物是由包覆有全氟磺酸聚合物的金纳米粒子与鲁米诺-聚二甲基二烯丙基氯化铵复合得到。

进一步地，金/鲁米诺纳米复合物制备过程如下：将金纳米粒子与全氟磺酸聚合物混合，在室温下搅拌8h后于14000rpm下离心得到金与全氟磺酸聚合物的连接物；将质量浓度为0.2%的聚二甲基二烯丙基氯化铵与4mm鲁米诺在60℃下搅拌6h后于离心后得到连接物；将以上两种连接物按体积比1:1混合搅拌12h后离心即得到金/鲁米诺纳米复合物。

上述生物芯片的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，将聚二甲基乙烯基硅氧烷预聚物与氢化硅氧烷交联剂混合，混合液倒入模具中，经固化、打孔制成聚二甲硅氧烷微孔模板；

步骤2，将聚二甲硅氧烷微孔模板黏附于玻璃片上，在微孔中加入醋酸纤维素溶液，形成醋酸纤维素薄膜；

步骤3，将金/鲁米诺纳米复合物固定在醋酸纤维素薄膜上，再将大豆过氧化物酶和胆固醇氧化酶包埋在微孔中，用牛血清白蛋白进行封闭，得到生物芯片。

进一步地，步骤1中聚二甲基乙烯基硅氧烷预聚物与氢化硅氧烷交联剂的重量比为8-10：1-3。

进一步地，所述聚二甲硅氧烷微孔模板的微孔大小为直径4-6mm、深2-3mm。

进一步地，步骤2中醋酸纤维素溶液的质量浓度为2%-4%。

上述生物芯片在胆固醇检测中的应用。具体是将胆固醇溶液加入权利要求1所述生物芯片的微孔中，通过电荷耦合图像分析仪收集检测产生的化学发光信号。曝光时间为0~4分钟。

如图1所示，本发明的生物芯片以聚二甲硅氧烷制备微孔模板，黏附于玻璃片上并在微孔中修饰醋酸纤维素薄膜；将合成的金/鲁米诺纳米复合物固定于基底，大豆过氧化物酶和胆固醇氧化酶包埋于微孔薄膜，以牛血清白蛋白封闭制得芯片。本发明所制备的生物芯片用于高通量检测胆固醇的原理为胆固醇氧化酶特异性分解胆固醇产生过氧化氢，在大豆过氧化物酶及金纳米粒子的催化作用下氧化鲁米诺为激发态，在电荷耦合元件曝光一定时间的条件下，产生化学发光信号并被收集检测，从而实现高通量下对胆固醇进行灵敏定量检测。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：本发明利用金纳米粒子优异的导电性、独特的光学性能、良好的生物相容性和优越的比表面积，将其与发光剂鲁米诺通过静电吸附复合，保证了足够的发光剂被引入；将金/鲁米诺复合物和反应所需的大豆过氧化物酶及胆固醇氧化酶固定于基底，直接加入胆固醇反应物即可引发反应产生化学发光信号，并且可以同时加入多个浓度的样品，实现了高通量、简便快速的检测胆固醇。同时，该生物芯片的制备工艺简单方便，成本低。

通过本发明的生物芯片，可特异性的检测胆固醇，包括血清及细胞中的胆固醇，通过电荷耦合元件对产生的化学发光信号进行收集检测，具有高灵敏度，低成本，检测时间快，高选择性，良好的稳定性，检测范围宽等多种优势，可同时对多个样品进行检测，实现高通量检测胆固醇。

附图说明

图1为本发明所述的基于金/鲁米诺纳米复合物的用于检测胆固醇的生物芯片的制备及检测方法。

图2为本发明中生物芯片对胆固醇响应的化学发光信号。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1

本实施例使用的聚二甲硅氧烷是道康宁牌套件产品，包括聚二甲基乙烯基硅氧烷预聚物与氢化硅氧烷交联剂，购自苏州中芯启恒科学仪器有限公司；全氟磺酸聚合物、聚二甲基二烯丙基氯化铵购自阿拉丁试剂有限公司；醋酸纤维素、牛血清白蛋白、氯金酸溶液购自国药集团；鲁米诺、大豆过氧化物酶及胆固醇氧化酶购自美国sigma-alorich公司。

（1）聚二甲硅氧烷微孔模板的制备：将聚二甲基乙烯基硅氧烷预聚物与氢化硅氧烷交联剂按9:2的重量比混合均匀，通过同一方向用力搅拌调节为中等粘度混合液并倒入模具中，抽真空去除其中的气泡，放入烘箱使其固化成为具有韧性的透明弹性体，利用打孔器打孔，孔直径为4~6mm、深2~3mm，得到的模板洗净烘干备用。

（2）将玻璃片按模板的尺寸进行裁切后用二次水超声清洗洗净，将制得的聚二甲硅氧烷微孔模板黏附在玻璃片上，在微孔中加入质量浓度为2%的醋酸纤维素溶液，形成醋酸纤维素薄膜。

（3）将金/鲁米诺纳米复合物固定在醋酸纤维素薄膜上，再将大豆过氧化物酶和胆固醇氧化酶包埋在微孔中，用牛血清白蛋白进行封闭，得到生物芯片。

通过柠檬酸钠还原氯金酸的方法制得金纳米粒子。金纳米粒子与质量浓度为3.5%的全氟磺酸聚合物按1:1的体积比混合，在室温下搅拌8h后于14000rpm下离心30min得到金与全氟磺酸聚合物的连接物；质量浓度为0.2%的聚二甲基二烯丙基氯化铵与4mm鲁米诺按1:1的体积比混合后，在60℃下搅拌6h后于1000rpm下离心后得到连接物；将两种连接物按体积比1:1混合搅拌12h后在1000rpm下离心即得到金/鲁米诺纳米复合物。

取10µl金/鲁米诺纳米复合物加入模板微孔中，使其完全固定于醋酸纤维素薄膜基底；重复该步骤3次以保证足够的金/鲁米诺纳米复合物被引入微孔中。

将30µl浓度为35u/ml的大豆过氧化物酶及30µl浓度为20u/ml的胆固醇氧化酶包埋于醋酸纤维素薄膜中，在黑暗中4℃下静置一晚，用ph7.4的缓冲溶液洗去多余的酶，加入50µl牛血清白蛋白溶液对芯片进行封闭，得到基于金/鲁米诺纳米复合物的用于高通量检测胆固醇的生物芯片。

实施例2

本实施例使用的聚二甲硅氧烷是道康宁牌套件产品，包括聚二甲基乙烯基硅氧烷预聚物与氢化硅氧烷交联剂，购自苏州中芯启恒科学仪器有限公司；全氟磺酸聚合物、聚二甲基二烯丙基氯化铵购自阿拉丁试剂有限公司；醋酸纤维素、牛血清白蛋白、氯金酸溶液购自国药集团；鲁米诺、大豆过氧化物酶及胆固醇氧化酶购自美国sigma-alorich公司。

（1）聚二甲硅氧烷微孔模板的制备：将聚二甲基乙烯基硅氧烷预聚物与氢化硅氧烷交联剂按8:3的重量比混合均匀，通过同一方向用力搅拌调节为中等粘度混合液并倒入模具中，抽真空去除其中的气泡，放入烘箱使其固化成为具有韧性的透明弹性体，利用打孔器打孔，得到的模板洗净烘干备用。

（2）将玻璃片按模板的尺寸进行裁切后用二次水超声清洗洗净，将制得的聚二甲硅氧烷微孔模板黏附在玻璃片上，在微孔中加入质量浓度为3%的醋酸纤维素，形成醋酸纤维素薄膜。

（3）将金/鲁米诺纳米复合物固定在醋酸纤维素薄膜上，再将大豆过氧化物酶和胆固醇氧化酶包埋在微孔中，用牛血清白蛋白进行封闭，得到生物芯片。

通过柠檬酸钠还原氯金酸的方法制得金纳米粒子。金纳米粒子与质量浓度为3.5%的全氟磺酸聚合物按1:1的体积比混合，在室温下搅拌8h后于14000rpm下离心30min得到金与全氟磺酸聚合物的连接物；质量浓度为0.2%的聚二甲基二烯丙基氯化铵与4mm鲁米诺按1:1的体积比混合后，在60℃下搅拌6h后于1000rpm下离心后得到连接物；将两种连接物按体积比1:1混合搅拌12h后在1000rpm下离心即得到金/鲁米诺纳米复合物。

取10µl金/鲁米诺纳米复合物加入生物芯片模板微孔中，使其完全固定于基底；重复该步骤3次以保证足够的金/鲁米诺纳米复合物被引入微孔中。

将30µl浓度为45u/ml的大豆过氧化物酶及30µl浓度为25u/ml的胆固醇氧化酶包埋于醋酸纤维素薄膜中，在黑暗中4℃下静置一晚，用ph7.4的缓冲溶液洗去多余的酶，加入50µl牛血清白蛋白溶液对芯片进行封闭，得到基于金/鲁米诺纳米复合物的用于高通量检测胆固醇的生物芯片。

实施例3

本实施例使用的聚二甲硅氧烷是道康宁牌套件产品，包括聚二甲基乙烯基硅氧烷预聚物与氢化硅氧烷交联剂，购自苏州中芯启恒科学仪器有限公司；全氟磺酸聚合物、聚二甲基二烯丙基氯化铵购自阿拉丁试剂有限公司；醋酸纤维素、牛血清白蛋白、氯金酸溶液购自国药集团；鲁米诺、大豆过氧化物酶及胆固醇氧化酶购自美国sigma-alorich公司。

（1）聚二甲硅氧烷微孔模板的制备将聚二甲基乙烯基硅氧烷预聚物与氢化硅氧烷交联剂按10:1的重量比混合均匀，通过同一方向用力搅拌调节为中等粘度混合液并倒入模具中，抽真空去除其中的气泡，放入烘箱使其固化成为具有韧性的透明弹性体，利用打孔器打孔，得到的模板洗净烘干备用。

（2）将玻璃片按模板的尺寸进行裁切后用二次水超声清洗洗净，将制得的聚二甲硅氧烷微孔模板黏附在玻璃片上，在微孔中加入质量浓度为3%的醋酸纤维素，形成醋酸纤维素薄膜。

（3）将金/鲁米诺纳米复合物固定在醋酸纤维素薄膜上，再将大豆过氧化物酶和胆固醇氧化酶包埋在微孔中，用牛血清白蛋白进行封闭，得到生物芯片。

通过柠檬酸钠还原氯金酸的方法制得金纳米粒子。金纳米粒子与质量浓度为3.5%的全氟磺酸聚合物按1:1的体积比混合，在室温下搅拌8h后于14000rpm下离心30min得到金与全氟磺酸聚合物的连接物；质量浓度为0.2%的聚二甲基二烯丙基氯化铵与4mm鲁米诺按1:1的体积比混合后，在60℃下搅拌6h后于1000rpm下离心后得到连接物；将两种连接物按体积比1:1混合搅拌12h后在1000rpm下离心即得到金/鲁米诺纳米复合物。

取10µl金/鲁米诺纳米复合物加入生物芯片模板微孔中，使其完全固定于基底；重复该步骤3次以保证足够的金/鲁米诺纳米复合物被引入微孔中。

将30µl浓度为45u/ml的大豆过氧化物酶及30µl浓度为25u/ml的胆固醇氧化酶包埋于醋酸纤维素薄膜中，在黑暗中4℃下静置一晚，用ph7.4的缓冲溶液洗去多余的酶，加入50µl牛血清白蛋白溶液对芯片进行封闭，得到基于金/鲁米诺纳米复合物的用于高通量检测胆固醇的生物芯片。

从图2可以看出，向芯片修饰不同基底的微孔中加入1mm相同浓度的胆固醇溶液，将芯片放入电荷耦合图像分析仪中，设置曝光时间为1分钟，可观察到明显的化学发光信号，并通过电荷耦合元件对其进行收集。