植物根结线虫生防菌、其制剂及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种植物根结线虫生防菌、其制剂及其应用。

背景技术：

根结线虫属于侧尾腺纲、垫刃目、异皮总科、根结线虫科中的根结线虫属，是一类严重危害经济农作物并广泛分布于世界各地的重要的植物病原线虫；它可以侵染经济性的粮食作物、蔬菜以及观赏性的花卉树木，甚至杂草都可以侵染。

在我国，随着农业经济的高速发展、产业结构的不断改革调整、种植制度的不断合理优化以及温室和大棚栽培面积的迅速发展，加上农民的管理意识淡薄，致使根结线虫病害发病程度逐年呈上升趋势，如我国南方根结线虫造成寄主作物常年减产15～20%，严重时达到70%以上；根结线虫还可诱发寄主产生其它的病害如根腐、青枯病、枯萎病和烟草黑胫病。由根结线虫引起的病害已严重制约着我国保护地作物的发展和稳产，影响着全国经济持续快速健康的发展。

目前，对线虫病害的防治方法主要采用化学农药防治、农业轮作防治以及利用抗病品种等多种方法来防治和控制根结线虫病害。

化学防治具有高效、速效的优势，是采用控制植物根结线虫病的常用防治方法。但是，许多化学农药如二溴氯丙烷（dbcp）和甲基溴等，容易诱导非靶标生物产生抗性、潜在毒性，具有高毒性，残留量高，对食品安全、环境污染、臭氧层有较大的隐患。

农业防治是通过轮作的方法改良土壤环境以减少虫源、靠增施有机肥料，提高土壤肥力、靠通过施加碱性肥料，调节土壤ph值等方法防治。但受限于有限的种植面积和温室建设的高成本投资，农户受环境和利益的影响，很难接受土地空闲，或者与经济价值和收益不高的作物轮作，因此靠农业防治根结线虫病害尚未很好地实施。

抗性品种的栽种理论上曾一度被认为是防治根结线虫病害比较有效而且广泛使用的防治措施，然而实际的农业生产中有效的抗性品种资源有限。

而生物农药以其高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性和原料易得等特性被人们认为是未来化学农药的理想替代药剂。因此，利用生物农药防治根结线虫也逐渐引起人们的重视。

因此，当前亟待在农业生产中对根结线虫提供一种环保安全、低成本的防治制剂及方法，并达到绿色有效的防治根结线虫的目的。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种生防菌株pt362在防治植物根结线虫病害中的应用，以达到环保安全、低成本的高效防治效果。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术思路：

已有的研究结果表明，许多土壤、叶围、根围及内生微生物甚至包括一些植物病原物对根结线虫均有一定程度的抑制作用。用生物防治方法防治线虫病害，不仅可以防治线虫病害和增加作物产量，而且还能克服施用化学农药带来的农药残留、人畜健康和生态失衡等一系列环境灾害。

发明人在长期的实践研究中，发现并筛选出了一株对植物根结线虫具有强致病力的植物根结线虫生防菌——淡紫紫孢菌菌株cctccno.m2016682。

研究制备出植物根结线虫生防制剂，为含淡紫紫孢菌cctccno.m2016682、其分生孢子、其代谢产物、其固体发酵物中的至少一种。

上述固体发酵物的优选制备方法为：将淡紫紫孢菌cctccno.m2016682孢子悬浮液浇灌由质量比为1：0.8～1.2的土和沙组成的土壤基质，即得。

优选的，所述淡紫紫孢菌cctccno.m2016682的孢子在土壤介质中的终浓度控制为1×10⁵～10⁷个/g。

设计一种植物根结线虫的防治方法，将所述的植物根结线虫生防制剂以拌土的形式施入土壤中。

发展研究出一种白灰制菌素的提取方法，包括如下步骤：

（1）取淡紫紫孢菌株cctccno.m2016682接种于pda平板上，于28℃下黑暗中培养9天，用无菌水清洗孢子制成孢子悬浮液；

（2）取上述孢子悬浮液接种于培养基中，28℃下、200rpm/min培养15天得发酵液；

（3）再向发酵液中加入1mol/lhcl溶液，调节ph值到3.0，然后加入同体积的乙酸乙酯进行萃取；

（4）萃取液用5%nahco3溶液洗涤两次，然后真空旋转干燥，粗提物即为白灰制菌素。

将淡紫紫孢菌cctccno.m2016682在防治植物根结线虫中应用。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

（1）本发明研究发现淡紫紫孢菌菌株pt362对植物根结线虫具备很强的致病力或杀灭作用，可用于制备番茄等的植物根结线虫的生物防治的生防菌制剂，与目前的根结线虫的防治化学药剂相比，具有高效、低毒、低残留、绿色环保、无污染、不易产生抗药性的良好特性。

（2）本发明筛选出的根结线虫生防菌—淡紫紫孢菌菌株pt362繁殖力强，培养速度快，产孢量大，孢子萌发率高，生产成本低，易于制备。

（3）本发明筛选出的淡紫紫孢菌菌株pt362的孢子悬浮液和代谢产物均对植物根结线虫虫卵和幼虫均具有很强的致病力或杀灭效果。

（4）本发明筛选出的淡紫紫孢菌菌株pt362代谢产生的白灰制菌素的浓度高、量大，为开发高效生防制剂提供基础。

附图说明

图1为淡紫紫孢菌菌株pt362寄生根结线虫卵对比图；其中，a为未侵染的卵，b为菌丝侵染的卵；

图2为淡紫紫孢菌菌株pt362在土壤中的存活动态图；

图3为淡紫紫孢菌菌株及突变菌株对比图；

图4为淡紫紫孢菌菌株pt362白灰制菌素组分图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备，如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的生化试剂，如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的检测方法或试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：淡紫紫孢菌菌株pt362的培养、驯化

淡紫紫孢菌原始菌株pl36-1在1991年由王明祖在湖北省从根结线虫体内分离得到，保存于华中农业大学植物病理线虫研究室。1991年在植物病理学报发表文章为《根结线虫卵寄生真菌的研究初报》。pt362是通过根癌农杆菌介导的t-dna插入遗传转化而获得的突变菌株，于2016年11月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctccno：m2016682（参见专利文献cn106967613a）。

实施例2：淡紫紫孢菌菌株pt362对根结线虫卵寄生及幼虫致死率测定

将根结线虫卵从番茄发病植株根部分离，用1%次氯酸钠进行表面消毒3min，水洗3次，将表面消毒的卵置于已在水琼脂（wa）平板上生长2天的菌丝上方，每皿50个卵囊，封口于28℃温箱中暗培养9天，于显微镜下观察卵被寄生情况。卵粒的寄生观察采用乳酸甘油液处理，处理约2min后被淡紫紫孢菌侵染的卵边缘透明，未被侵染的仍为深色，重复四次，只接卵的为空白对照。

淡紫紫孢菌菌株pt362寄生根结线虫卵如图1所示。

具体检测结果见表1。

表1淡紫紫孢菌对根结线虫卵寄生率变化

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淡紫紫孢菌株对根结线虫卵寄生率测定表明：菌株pt362对番茄根结线虫寄生率达98.3%；pl36-1对线虫卵寄生率为63.5%。

从番茄根结上面分离根结线虫幼虫，然后0.5ml的淡紫紫孢菌菌株pt362无菌发酵液和0.5ml的线虫液（100条/ml）混合均匀，28℃温箱培养，24小时以后，每天开始计数幼虫死亡条数，计算幼虫死亡率。

公式为：死亡率=(ca-ta)/ca，ca代表对照中未死亡的线虫数量，ta代表处理中未死亡的线虫数量。

具体检测结果见表2。

表2淡紫紫孢菌对根结线虫幼虫致死率

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淡紫紫孢菌无菌发酵液对根结线虫幼虫致死率测定表明：菌株pt362无菌发酵液对番茄根结线虫幼虫致死率达94.5%；pl36-1对线虫卵幼虫致死率为68.4%。

实施例3：淡紫紫孢菌菌株pt362产孢测定

将淡紫紫孢菌pt362在pda平板上于28℃下培养3d后，用打孔器（直径为0.5cm）打取边缘带菌丝的琼脂块，转接于含定量pda（20ml/皿）的培养皿（直径为9cm）中央，每培养皿中接种一块，以出发菌株（pl36-1菌株）为对照，每菌株4次重复。28℃培养，10天后，制成淡紫紫孢菌孢子悬浮液，血球计数板计数，测定孢子浓度。

具体检测结果见表3。

表3淡紫紫孢菌产孢量

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淡紫紫孢菌株产孢测定表明：菌株pt362产孢量可达5.3×10⁸spores/皿；菌株pl36-1产孢量可达3.2×10⁶spores/皿。

实施例4：淡紫紫孢菌菌株pt362在土壤中的存活测定

制备淡紫紫孢菌pt362固体发酵物：

以塑料杯（直径7cm，深8cm）为支持物，每杯装土壤（黄壤土）基质（土/沙=1/1）200g，将pt362菌株分别以实施例3中孢子悬浮液浇灌。

固体发酵物以拌土的形式施入土壤中，使其在土壤介质中的终浓度为10⁶个/g，然后将空塑料杯埋于田间土壤中（河南省新乡市原阳县河南现代农业研究开发基地）。

10天后，分期取出埋于土壤的小杯，开始第一次测定，间隔10d取样一次，测定pt362菌株在土壤中的定殖量，持续测定60天（共6次）。

测定时间自2017年5月到7月。设未接种土壤做为对照。

采用平板计数法对目的菌株进行分离测定。田间取回小杯，倒出土壤混匀后称取两份10g土样，一份于80℃烘箱放置12h烘干测重；另一份用于分离淡紫紫孢菌。每次取3杯即为3次重复。每杯土样测定设4个平板重复。菌液涂平板后于28℃温箱中培养，5d后对平板菌落进行计数。

检测结果如图2所示：

pt362菌株分别以孢子液和固体发酵物的形式施入土壤，测定得到的菌株存活量总趋势随时间延长而略有降低。以固体发酵物拌土施入的定殖量较孢子液浇灌的高，60d后菌株以固体发酵物拌土和孢子液浇灌的定殖量分别在10⁵、10⁴的数量级。二者的定殖量在1%极显著水平上存在差异，固体发酵物拌土的形式较利于菌株在土壤中的长期存活。

实施例5：淡紫紫孢菌菌株pt362在田间小区防效试验

番茄根结线虫的小区防效试验共设置5个处理：10％噻唑膦（3g/穴）、0.5％阿维菌素乳油（3ml/穴）、pt362固体发酵物（9g/穴）、pl36-1固体发酵物（9g/穴）和空白对照。

每处理设置3个小区，完全随机设计，每小区面积8.4m²（5.6m×1.5m），共移栽60株番茄。

在番茄移栽时，采用“穴施法”将微生物菌剂和药剂施入穴内，然后移栽番茄苗，此后各小区均采用相同的管理条件。

在番茄移栽时（0d），移栽后38、68和105d，检测各小区土壤中根结线虫j2种群密度，获得不同时期土壤中j2种群动态变化，并计算j2扩繁指数。公式为：

扩繁指数(ri)=移栽105d后土壤中j2种群密度(pf)／初始土壤j2种群密度(pi)。

在番茄移后38和105d，每小区随机挖取5株番茄植株，参照bridge和page方法，对各处理根系样品的根结进行分级，并计算根结病情指数和防效。同时测定各处理番茄植株地上部和根系样品鲜重，然后置于105℃鼓风干燥箱杀青30min，80℃烘干至恒重，测定地上部和根系干重。每小区随机选取10株番茄测产。

根结线虫分级标准：

0级：根系上无根结；

1级：10%以下的根系上有根结，但根结不互相连接；

2级：11％～30％的根系上有根结，仅少数根结相互连接；

3级：31～50％的根系上有根结，半数根结相互连接；

4级：51～75％的根系上有根结，多数根结相互连接；

5级：75%以上的根系上有根结，根变粗，畸形。

（1）根结线虫2龄幼虫动态变化

具体检测结果见表4。

表4不同处理不同时期根结线虫j2种群动态

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番茄移栽期和移栽后38d，各处理土壤中根结线虫j2数量无明显差异。到移栽后68d，pt362菌剂处理的土壤中j2数量显著低于10%噻唑膦和0.5%阿维菌素乳油处理。移栽后105d，pt362菌剂、0.5%阿维菌素乳油、10％噻唑膦和单一菌剂处理的土壤中j2数量和扩繁指数(ri)均显著性低于空白对照。

（2）pt362菌剂对根结级数和根结病情指数的影响

具体检测结果见表5。

表5不同处理对根结级数和根结病情指数的影响

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番茄移栽后105d的测定结果表明，pt362菌剂处理的根结级数和根结病情指数分别为2.0和21.0，对根结线虫的防效达75.7%。用阿维菌素乳油处理的根结级数和病情指数分别为2.0和22.7，对根结线虫防效达67.4%。

（3）pt362菌剂对番茄植株生物量和产量的影响

具体检测结果见表6。

表6不同处理对番茄植株生物量和产量的影响

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番茄移栽后105d，用pt362菌剂处理的番茄地上部平均鲜重和干重分别达652.6g和102.4g，显著性高于空白对照，说明施用该pt362菌剂有利于番茄植株地上部生物量积累。番茄整个生育期的测产数据显示，使用pt362菌剂处理的小区，番茄产量最高，达到70.9kg/60株，增产达14.9％。

实施例6：白灰制菌素的提取及测定

白灰制菌素在根结线虫幼虫致死方面起重要的作用，是用来检测线虫活性的重要指标。白灰制菌素a和b是白灰制菌素家族重要组成成分，白灰制菌素a和b以一定的比例存在于原始菌株中。

白灰制菌素提取方法如下：

（1）pt362菌株和pl36-1菌株在pda平板上28℃黑暗中培养九天，如图3所示，用无菌水清洗孢子制成（10⁶孢子/ml）孢子悬浮液；

（2）分别取1ml孢子悬浮液放置含有100ml的培养基的三角瓶中，28℃，200rpm/min培养15天。

（3）在培养好的发酵液中加入1mol/lhcl溶液，调节ph值到3.0，然后加入同体积的乙酸乙酯进行萃取；

（4）萃取液用5%nahco3溶液洗涤两次，然后真空旋转干燥，粗提物即为白灰制菌素；

（5）用小量（10ml）的甲醇溶解，并使用质谱仪（matrix-assistedlaserdesorption/ionization-timeofflightmassspectrometrymaldi-tofms）进行物质分析和浓度测定，如图4所示。

具体检测结果见表7。

表7淡紫紫孢菌株白灰制菌素浓度

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pl36-1菌株产白灰制菌素a和b浓度分别为51.3%、98.4%，pt362菌株产白灰制菌素a和b浓度分别为99.3%、75.8%。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。