本发明属于生物医学工程领域，涉及一种基于三苯胺多吡啶盐的光敏剂及其制备方法与应用。
背景技术
随着人类生活水平地不断提高，人们对健康问题愈发重视。然而，癌症给全人类健康带来的问题一直尚未解决，由于环境的恶化等影响甚至愈发严重。虽然很多研究者致力于探索治疗癌症的新方法，但目前最常用的仍是手术、放疗以及化疗等传统方法。然而，这些传统方法都有自己的弊端，比如：手术对恶性肿瘤无法彻底清除、放疗和化疗会给机体带来的巨大毒副作用。针对这些现状，我们急需研究出一种高效、低毒副作用的新型药物去解决癌症的难题。
光动力治疗(photodynamictherapy,pdt)因为具有创伤小、毒副作用小、选择性好、可重复性好、可保护重要器官功能等优点，日渐成为一种颇具前景的肿瘤治疗手段。光敏药物进入体内，富集在癌变组织，通过光的激发促使光敏药物在癌细胞中产生细胞有害物如单线氧、自由基或者超氧化物，从而导致肿瘤细胞坏死和死亡的过程。但是，目前光动力治疗手段的效率一般，同时，对其药效的实时监测还是一个难题。一些覆载多种功能材料的纳米制剂往往面临着载药量低，重复性差以及释药困难等问题。因此，开发出一种高效率的，并且同时具备实时监测药效功能的光动力治疗与诊断一体化的水溶性小分子药物是非常意义重大的。
技术实现要素：
本发明解决了现有技术中光敏剂单线态氧量子产率低下，且无法实时监测细胞状态的技术问题。
根据本发明的第一方面，提供了一种基于三苯胺多吡啶盐的光敏剂，所述光敏剂的结构式如式ⅰ所示：
其中r为拉电子基团。
优选地，所述拉电子基团r为
按照本发明的另一方面，提供了基于三苯胺多吡啶盐的光敏剂的制备方法，含有以下步骤：
(1)在惰性气体保护下，将三苯胺单醛二碘和催化剂a充分混匀后，加热至50℃-70℃，然后加入4-吡啶硼酸，在80℃-100℃条件下回流8h-16h，使所述三苯胺单醛二碘和4-吡啶硼酸发生偶联反应，生成三苯胺单醛二吡啶；将该三苯胺单醛二吡啶与对苯二乙腈和催化剂b充分混匀后，在80℃-100℃条件下回流10h-12h，使所述三苯胺单醛二吡啶和对苯二乙腈发生缩合反应，得到对苯二乙腈三苯胺吡啶；
或者步骤(1)为以下技术方案：在惰性气体保护下，将三苯胺单醛二碘、甲基三苯基溴化膦和催化剂c充分混匀后，冰浴20min-40min，然后在20℃-30℃条件下反应3h-5h，所述三苯胺单醛二碘和甲基三苯基溴化膦发生缩合反应，得到三苯胺单烯二碘；将该三苯胺单烯二碘与二溴苯并噻二唑和催化剂d充分混匀后，在90℃-110℃条件下，反应20h-25h，使所述三苯胺单烯二碘和二溴苯并噻二唑发生偶联反应，得到苯并噻二唑三苯胺二碘；将所述苯并噻二唑三苯胺二碘与4-吡啶硼酸在催化剂e作用下反应得到苯并噻二唑三苯胺吡啶；
(2)在惰性气体保护下，将步骤(1)得到的对苯二乙腈三苯胺吡啶或苯并噻二唑三苯胺吡啶与碘甲烷进行回流反应，使所述对苯二乙腈三苯胺吡啶或苯并噻二唑三苯胺吡啶与碘甲烷发生成盐反应，得到基于三苯胺多吡啶盐的光敏剂。
优选地，步骤(1)中生成三苯胺单醛二吡啶的过程中，所述三苯胺单醛二碘与4-吡啶硼酸的物质的量之比为1.0：(2.0-3.0)；步骤(1)所述催化剂a为四三苯基膦钯或二(三苯基膦)二氯化钯；步骤(1)所述催化剂b和催化剂c为叔丁醇钾或叔丁醇钠。
优选地，步骤(1)所述三苯胺单醛二吡啶与对苯二乙腈的物质的量之比为(2.0-3.0)：1.0；步骤(1)所述催化剂d为醋酸钯；步骤(1)所述催化剂e为四三苯基膦钯。
优选地，步骤(2)中所述对苯二乙腈三苯胺吡啶或苯并噻二唑三苯胺吡啶与碘甲烷的物质的量之比为1.0：(10.0-20.0)；步骤(2)所述回流的时间为6h-8h。
按照本发明的另一方面，提供了所述基于三苯胺多吡啶盐的光敏剂用于制备抗肿瘤药物的应用。
优选地，所述抗肿瘤药物在光照下作用于肿瘤细胞，所述光照的波长为400nm-600nm；所述光照的光源功率为1mw/cm2-50mw/cm2。
按照本发明的另一方面，提供了所述基于三苯胺多吡啶盐的光敏剂用于制备监测肿瘤细胞死亡的药物的应用。
按照本发明的另一方面，提供了所述基于三苯胺多吡啶盐的光敏剂应用于检测dna的荧光探针。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)本发明所述光敏剂可以高效率产生单线态氧，光照下，其相对单线态氧量子产率φ可以达到0.79(参比孟加拉红，φ＝0.75)，可以达到高效杀死肿瘤细胞的目的，能在15s内促使癌细胞死亡。
(2)本发明所述光敏剂促使肿瘤细胞死亡后，肿瘤细胞的核膜通透性增强，细胞质中的光敏剂进入细胞核，与细胞核内的核酸结合，引起光敏剂的聚集诱导发光，且随着肿瘤细胞死亡进程的深入，光敏剂的聚集诱导发光作用增强，因此可以点亮死亡以及死亡过程中的肿瘤细胞，可以实时监测细胞的死亡状态。随着光敏剂溶液中dna浓度的增加，光敏剂荧光强度逐渐增强，因此可以作为检测dna的增强型荧光探针。
(3)本发明所述光敏剂不仅可以高效地杀死肿瘤细胞和抑制肿瘤生长，还可以实时监测肿瘤细胞及肿瘤组织的死亡，因此该光敏剂药物可以及时判断肿瘤细胞在该光敏剂作用下的效果。本发明所述光敏剂制备方法简单，且成本低廉。
附图说明
图1是本发明提供的光敏剂的作用原理示意图。
图2是实施例2中，10μmol·l-1的光敏剂jp2在加入不同浓度ctdna后荧光发射光谱图，ctdna离子浓度依次为0、2.5、5.0、7.5、10、12.5、15.0、17.5、20.0、22.5μg·l-1，溶液的体系为水溶液，激发波长为445nm；其中横坐标为波长，纵坐标为荧光强度值。
图3是实施例3中，孵育光敏剂的活hela癌细胞在不同时间的光照下的细胞死亡图片；光源为共聚焦内置光源(488nm,10mw)，jp2的激发波长为488nm，收集波段为500-550nm；线粒体染料mitotracker为mitotrackerdeepred，激发波长为640nm，收集波段为660-750nm；比例尺为6μm；其中图3(a)、图3(e)和图3(i)分别为加入光敏剂jp2后0秒、8秒和15秒时细胞的明场图；图3(b)为、图3(f)和图3(j)分别为加入光敏剂jp2后0秒、8秒和15秒时细胞的荧光图；图3(c)为、图3(g)、图3(k)分别为加入光敏剂jp2后0秒、8秒和15秒时细胞中线粒体的染色图；图3(d)、图3(h)和图3(l)为分别为加入光敏剂jp2后0秒、8秒和15秒时细胞的荧光图和线粒体染色图的叠加图。
图4(a)是实施例4中光照条件下的不同浓度的hela癌细胞通过mtt试验得出的细胞存活率(465nm,30mwcm-2)；图4(b)是实施例4中没有光照条件下的不同浓度的hela癌细胞通过mtt试验得出的细胞存活率(465nm,30mwcm-2)。
图5是实施例5中，给药及光照前后小鼠肿瘤部位的荧光强度变化；其中pbs组为空白组，即注射等体积pbs溶液并给予相同剂量光照；jp2-light组为对照组，即注射等体积jp2溶液不给光照；jp2+light组为试验组，即在注射jp2溶液的情况下给予光照。其中，其中图5(a)、图5(b)和图5(c)分别为试验组注射光敏剂jp2之前、注射光敏剂jp2之后和注射光敏剂jp2之后进行光照的小鼠荧光成像图；图5(d)、图5(e)和图5(f)分别为对照组注射光敏剂jp2之前、注射光敏剂jp2之后和注射光敏剂jp2之后不进行光照的小鼠荧光成像图；图5(g)、图5(h)和图5(i)分别为空白组组注射光敏剂jp2之前、注射光敏剂jp2之后和注射光敏剂jp2之后进行光照的小鼠荧光成像图。
图6各组小鼠的肿瘤生长情况。
图7是实施例1合成光敏剂核磁共振氢谱。
图8是实施例1合成光敏剂核磁共振碳谱。
图9是实施例1合成光敏剂的maldi-tof质谱。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1：光敏剂jp2的合成
(1)化合物iii的合成
在100ml二口烧瓶中加入三苯胺单醛二碘iv(4.2g，8mmol)，碳酸铯(5.21g，16mmol)，催化剂四三苯基膦钯(0.92g，0.8mmol)和50ml甲苯，氮气保护，加热至60℃，搅拌10min，将溶有4-吡啶硼酸(2.96g，24mmol)的乙醇注入到二口烧瓶中，升温至90℃，回流反应10h。反应结束后，冷却至室温，用硅藻土过滤，以除去催化剂。旋干滤液，用乙酸乙酯和饱和食盐水溶液萃取，旋干粗产物进行柱层析(洗脱剂为dcm:ethanol＝50:1)。得到ⅲ，产率：3.15g(92％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.87(s,1h),8.66(dd,j＝4.5,1.6hz,4h),7.89–7.71(m,2h),7.68–7.59(m,4h),7.50(dd,j＝4.5,1.6hz,4h),7.37–7.25(m,4h),7.18(d,j＝8.7hz,2h).
(2)化合物ii的合成
在100ml二口烧瓶中，将化合物iii(427.5mg,1mmol)，对苯二乙腈(156.2mg,0.33mmol)叔丁醇钾(561.1mg,5mmol)溶于30ml甲醇溶液中.，氮气保护，加热回流反应12h，反应结束。加入10毫升去离子水淬灭反应，用稀盐酸调节ph至中性，用二氯甲烷与饱和氯化钠溶液萃取，将有机相旋干后得粗产物，进行柱层析(洗脱剂为二氯甲烷:乙醇为15:1)，得到产物ii(210mg,yield:65％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.67(d,j＝6.1hz,8h),7.89(d,j＝8.8hz,4h),7.74(s,4h),7.64(d,j＝8.6hz,8h),7.56–7.47(m,10h),7.30(d,j＝8.6hz,8h),7.22(d,j＝8.8hz,4h).13cnmr(101mhz,cdcl3)δ150.28,149.13,147.28,147.22,141.55,135.07,133.74,130.98,128.23,127.78,126.25,125.52,122.65,121.14,118.24,107.94.maldi-tof:[m]calcdforc68h46n8,975.1720；found,975.2053.
(3)化合物jp2的合成
在50ml圆底烧瓶中，将化合物ii(100.0mg,0.10mmol)和碘甲烷(0.24g,0.1ml,1.7mmol)溶于20ml乙腈中，在氮气气氛下搅拌回流10小时后，将混合物冷却至室温，然后倒入无水乙醚中析出沉淀，将所得沉淀过滤并用无水乙醚洗涤三次，干燥后得到产物jp2。产率：(122mg,yield:79％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.94(d,j＝6.9hz,8h),8.45(d,j＝7.0hz,8h),8.16(s,2h),8.12(d,j＝8.8hz,8h),8.03(d,j＝8.8hz,4h),7.90(s,4h),7.32(d,j＝8.7hz,12h),4.29(s,12h)；如图7所示。13cnmr(101mhz,dmso-d6))δ156.88,153.45,153.31,149.53,145.86,132.47,131.69,130.29,128.90,126.81,125.03,123.60,118.39,111.11,108.39,100.62,47.35；如图8所示。maldi-tof:[m4+]calcdforc72h58n84+,1035.3098；found:1035.2889；如图9所示。
实施例2：光敏剂jp2在不同浓度ctdna中的荧光变化
在浓度为10μmol·l-1光敏剂jp2的pbs溶液中加入不同浓度的ctdna，ctdna离子浓度依次为0、2.5、5.0、7.5、10、12.5、15.0、17.5、20.0、22.5μg·l-1，激发波长为445nm，随着ctdna浓度的增加，荧光强度不断增强，如图2所示。说明jp2和ctdna具有一定的结合能力，能激发jp2本身的聚集诱导发光性能，从而荧光增强。这也是jp2点亮细胞核的主要原因。
实施例3：活hela癌细胞在不同时间的光照下的细胞死亡
hela细胞经过10μm光敏剂jp2孵育2h后，用pbs溶液洗掉残余染料再用线粒体染料mitotrackerdeepred孵育30min。在显微镜下观察光敏剂在细胞中的荧光分布，在共聚焦内置光源(488nm,10mw)的照射下，得到图3的结果，其中图3(a)、图3(e)和图3(i)分别为加入光敏剂jp2后0秒、8秒和15秒时细胞的明场图；图3(b)为、图3(f)和图3(j)分别为加入光敏剂jp2后0秒、8秒和15秒时细胞的荧光图；图3(c)为、图3(g)、图3(k)分别为加入光敏剂jp2后0秒、8秒和15秒时细胞中线粒体的染色图；图3(d)、图3(h)和图3(l)为分别为加入光敏剂jp2后0秒、8秒和15秒时细胞的荧光图和线粒体染色图的叠加图。可以从图3观察到细胞核中的jp2荧光强度逐渐增强，同时线粒体染料荧光逐渐减弱虚化，明场细胞出现吐泡，细胞形态改变等死亡症状，说明了细胞在光动力作用下的快速死亡。其中，jp2的激发波长为488nm，收集波段为500-550nm。线粒体染料mitotracker为mitotrackerdeepred，激发波长为640nm，收集波段为660-750nm。比例尺为6μm。
实施例4：在光照及没有光照条件下的不同浓度的hela癌细胞通过mtt试验得出的细胞存活率
hela细胞分别经过0，10，20，30，40μm光敏剂jp2孵育24h后，通过mtt试验发现即使jp2浓度高达40μm，在没有光照的刺激下，仍然表现了很好的细胞存活率，如图4(a)所示。
而经过0，2，4，6，8，10μm光敏剂孵育后的细胞4h，经过2min光照(465nm,30mwcm-2)刺激后，继续孵育24h后，通过mtt试验考察细胞存活率，通过图4(b)可以看到，随着jp2浓度的增加，细胞的光毒性逐渐增大。通过spss软件对分别对实验数据进行拟合得到jp2光动力疗法对hela细胞毒性的ic50为1.67μm。
实施例5：给药及光照前后小鼠肿瘤部位的荧光强度
图1是本发明提供的光敏剂的作用原理示意图。从图1可以得知，本光敏剂在光照条件下高效率产生单线态氧，单线态氧可以高效杀死肿瘤细胞。肿瘤细胞死亡后，肿瘤细胞的核膜通透性增强，细胞质中的光敏剂进入细胞核，与细胞核内的核酸结合，引起光敏剂的聚集诱导发光，且随着肿瘤细胞死亡进程的深入，光敏剂的聚集诱导发光作用增强，可以实时监测细胞的死亡状态。
将接种h22细胞皮下瘤的bal/c雄鼠一共24只，分成三组，每组8只。其中pbs组为空白组，及注射等体积pbs溶液并给予相同剂量光照。jp2-light组为对照组，即注射等体积jp2溶液不给光照。jp2+light组为试验组，即在注射jp2溶液的情况下给予光照。注射剂量为浓度为0.8mg/ml的jp2pbs溶液50微升。结果图如5所示，其中图5(a)、图5(b)和图5(c)分别为试验组注射光敏剂jp2之前、注射光敏剂jp2之后和注射光敏剂jp2之后用光照的小鼠荧光成像图；图5(d)、图5(e)和图5(f)分别为对照组注射光敏剂jp2之前、注射光敏剂jp2之后和注射光敏剂jp2之后不用光照的小鼠荧光成像图；图5(g)、图5(h)和图5(i)分别为空白组组注射光敏剂jp2之前、注射光敏剂jp2之后和注射光敏剂jp2之后用光照的小鼠荧光成像图。jp2+light组在光照20分钟后肿瘤组织荧光显著增强，说明光动力治疗具有一定效果。而pbs组和jp2-light组没有明显变化。
每天用游标卡尺测量每组小鼠肿瘤体积，其肿瘤体积生长曲线如图6所示。jp2+light组小鼠的肿瘤相比于pbs组和jp2-light具有明显的抑制效果。
实施例6：光敏剂bz的合成
(1)化合物ivb的合成
在100ml二口烧瓶中加入三苯胺单醛二碘iv(213.75mg，0.5mmol)，甲基三苯基溴化膦(607.85mg，1.5mmol)，叔丁醇钾(280.53mg，0.0027mmol)氮气保护后，冰浴下注入15ml四氢呋喃，氮气保护下，冰浴反应半小时后，升至常温搅拌反应4小时。反应结束后，用乙酸乙酯和饱和食盐水溶液萃取，旋干粗产物进行柱层析(洗脱剂为正己烷:二氯甲烷＝1:1)。得到三苯胺单烯二碘ivb，产率：190mg(73％)。1hnmr(400mhz,chcl3)δ7.51(dt,j＝3.6,1.7hz,4h),7.29(d,j＝8.1hz,2h),7.05–6.95(m,2h),6.81(dt,j＝4.3,2.1hz,4h),6.65(dd,j＝17.6,10.8hz,1h),5.66(d,j＝17.6hz,1h),5.19(d,j＝10.8hz,1h).
(2)化合物iiib的合成
在100ml两口圆底烧瓶中分别加入化合物三苯胺单烯二碘ivb(130mg,0.248mmol)，二溴苯并噻二唑(29.22mg,0.099mmol)，醋酸钯(31.08mg,0.0099mmol)，醋酸钠(1.60g,0.0198mol)以及四丁基溴化铵(95.63mg,0.33mmol)，氩气保护下注射加入干燥dmf溶液30ml，搅拌溶解后反应体系加热到100℃反应24小时。停止反应冷却到室温后，将反应液倒入100ml去离子水中，会看到大量黑色沉淀析出。过滤收集固体，得到粗产物为黑色固体。将其用硅胶柱柱层析，洗脱剂为石油醚：二氯甲烷＝1：2，得到终产物苯并噻二唑三苯胺二碘iiib为紫黑色固体粉末，重量为55mg,产率为47％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.95(d,j＝12.0hz,2h),7.66(s,2h),7.57-7.53(m,14h),7.07(d,j＝8.6hz,4h),6.90–6.85(m,8h).
(3)化合物iib的合成
在100ml二口烧瓶中加入苯并噻二唑三苯胺二碘iiib(32mg，0.027mmol)，碳酸铯(17.69mg，0.054mmol)，催化剂四三苯基膦钯(3.13mg，0..0027mmol)和10ml甲苯，氮气保护，加热至60℃，搅拌10min，将溶有4-吡啶硼酸(10.01mg，0.081mmol)的乙醇注入到二口烧瓶中，升温至90℃，回流反应10h。反应结束后，冷却至室温，用硅藻土过滤，以除去催化剂。旋干滤液，用乙酸乙酯和饱和食盐水溶液萃取，旋干粗产物进行柱层析(洗脱剂为dcm:ethanol＝50:1)。得到苯并噻二唑三苯胺二吡啶iib，产率：15mg(57％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.65(dd,j＝4.7,1.4hz,8h),8.00(d,j＝16.2hz,2h),7.69(s,2h),7.69–7.51(m,14h),7.52(dd,j＝4.6,1.6hz,8h),7.27(d,j＝8.6hz,4h),7.21(d,j＝8.6hz,4h).
(4)光敏剂bz的合成
在50ml圆底烧瓶中，将化合物苯并噻二唑三苯胺二吡啶iib(15mg,0.015mmol)和碘甲烷(0.24g,0.1ml,1.7mmol)溶于20ml乙腈中，在氮气气氛下搅拌回流10小时后，将混合物冷却至室温，然后倒入无水乙醚中析出沉淀，将所得沉淀过滤并用无水乙醚洗涤三次，干燥后得到产物bz。产率：(17mg,yield:73％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.92(d,j＝6.8hz,8h),8.43(d,j＝7.0hz,8h),8.15–8.13(m,4h),8.10(d,j＝9.0hz,8h),7.96(s,2h),7.78(d,j＝8.6hz,6h),7.74–7.71(m,2h),7.28(d,j＝8.7hz,8h),7.24(s,4h),4.28(s,12h).
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。