本发明涉及一种分离提取麦冬中黄酮的方法。
背景技术
黄酮类合物又称黄酮体、黄碱素和类黄酮，使广泛存在于自然界的一大类化合物，数量之多可列天然酚性化合物之首。黄酮类化合物在植物体内大部分与糖成苷，一部分以苷元形式存在。黄酮类化合物因其抗活性氧自由基功能、对脂质代谢的调节作用、抗衰老抗疲劳作用、抗癌和抗肿瘤作用、降血脂和降血清胆固醇的作用、增强免疫机能、抑制前列腺生长和增生、对内分泌的调节作用、抗菌抑菌性能功能、抗过敏抗炎作用、雌激素样作用、对肾脏的保护作用、对骨质酥松症的治疗作用等而受到广泛研究。为便于研究，需要将不同黄酮类进行分离提取。
麦冬(学名：ophiopogonjaponicus(linn.f.)ker-gawl.)百合科沿阶草属多年生常绿草本植物。麦冬的主要成分是皂苷类、黄酮类化合物和糖类成分。麦冬的黄酮类化合物主要有四种，其分别为化合物i、化合物ii、化合物iii和化合物iv。
化合物i，如式i所示，为无定型白色粉末(甲醇)，fecl3显色反应呈阳性。[α]20d-2.6°(c＝0.85，ch3cooc2h5)。其1hnmr(400mhz，cdcl3)显示5个脂肪氢核信号：δ4.52(1h，dd，j＝11.2，4.8hz)，4.22(1h，dd，j＝10.8，10.8hz)，3.10(1h，m)，3.01(1h，dd，j＝14.4，5.2hz)，2.86(1h，dd，j＝14.4，6.4hz)；3个芳氢核信号：δ6.46(1h，d，j＝2.4hz)，6.42(1h，dd，j＝8.4，2.4hz)，6.94(1h，dd，j＝8.4)；2个羟基氢核信号：δ11.94(1h，s)，6.62(1h，s)；2个芳环甲氧基氢核信号δ3.75(3h，s)，3.85(3h，s)；1个芳环甲基氢核信号：δ2.04(3h，s)。化合物i的13cnmr(50mhz，cdcl3)显示有3个脂肪碳、12个芳环碳、1个羰基碳、1个甲基碳以及2个甲氧基碳信号。以上数据显示化合物i为二氢高异黄酮类化合物，其数据和文献(nguyentha，tmmvs，andreap，etal.homoisoflavonoidsfromophiopogonjaponicusker-gawler.phytochemistry，2003，62：1153～1158)基本一致，确定其平面结构为5，7-dihydroxy-6-methyl-8-methoxy-(2’-hydroxy-4’-methoxybenzyl)chrom-4-one。
化合物ii，如式ii所示，为淡黄色无定型粉末(甲醇)，fecl3显色反应呈阳性。[α]20d+3.8°(c＝1.0，ch3coch3)。其1hnmr(400mhz，dmso-d6)显示5个脂肪氢核信号：δ4.24(1h，dd，j＝11.2，4.2hz)，4.05(1h，dd，j＝11.2，8.4hz)，2.95(1h，m)，3.03(1h，dd，j＝13.6，4.8hz)，2.56(1h，dd，j＝13.6，9.6hz)；3个芳氢核信号：δ6.80(1h，d，j＝1.6hz)，6.69(1h，d，j＝8.0hz)，6.60(1h，d，j＝8.0hz)；1个羟基氢核信号：δ12.49(1h，s)；1个芳环甲氧基氢核信号δ3.74(3h，s)以及2个芳环甲基氢核信号：δ1.92(3h，s)，1.90(3h，s)。化合物i的13cnmr(50mhz，dmso-d6)显示有3个脂肪碳、12个芳环碳、1个羰基碳、2个甲基碳以及1个甲氧基碳信号。以上数据显示化合物ii为二氢高异黄酮类化合物，其数据和文献(nguyentha，tmmvs，andreap，etal.homoisoflavonoidsfromophiopogonjaponicusker-gawler.phytochemistry，2003，62：1153～1158)基本一致，确定其平面结构为5，7-dihydroxy-6，8-dimethyl-3-(3’-methoxy-4’-hydroxybenzyl)chrom-4-one。
化合物iii，如式iii所示，为淡黄色针晶(乙酸乙酯)，fecl3显色反应呈阳性。[α]20d-71.3°(c＝0.7，ch3cooc2h5)。其1hnmr(400mhz，cdcl3)显示5个脂肪氢核信号：δ4.27(1h，dd，j＝11.4，4.0hz)，4.11(1h，dd，j＝11.4，7.0hz)，2.78(1h，m)，3.17(1h，dd，j＝13.6，4.2hz)，2.69(1h，dd，j＝13.6，10.4hz)；4个芳氢核信号：δ7.14(2h，d，j＝8.4)，6.85(2h，d，j＝8.4)；2个羟基氢核信号：δ5.50(1h，s)，12.38(1h，s)；1个芳环甲氧基氢核信号δ3.79(3h，s)以及2个芳环甲基氢核信号：δ2.02(3h，s)、2.06(3h，s)。化合物iii的13cnmr(50mhz，cdcl3)显示有3个脂肪碳、12个芳环碳、1个羰基碳、2个甲基碳以及1个甲氧基碳信号。以上数据显示化合物iii为二氢高异黄酮类化合物，其数据和文献(tadaa，kasar，saitoht，etal.studiesontheconstituentsofophionogonistuberv.isolationofnovelclassofhomoisoflavonoidsanddeterminationoftheirstructure(1).chem.pharmbull，1980，28(5)：1477)基本一致，确定其平面结构为5，7-dihydroxy-6，8-dimethyl-3-(4’-methoxyzyl)-4-one(methylophiopogonanoneb)。
化合物iv，如式iv所示，为淡黄色针晶(乙酸乙酯)，fecl3显色反应呈阳性。[α]20d-34.0°(c＝0.96，ch3cooc2h5)。其1hnmr(400mhz，cdcl3)显示5个脂肪氢核信号：δ4.29(1h，dd，j＝11.2，4.4hz)，4.13(1h，dd，j＝11.2，7.0hz)，2.79(1h，m)，3.15(1h，dd，j＝13.6，4.4hz)，2.68(1h，dd，j＝13.6，10.4hz)；3个芳氢核信号：δ6.73(1h，d，j＝1.6hz)，6.76(1h，d，j＝8.0hz)，6.68(1h，dd，j＝8.0，1.6hz)；2个羟基氢核信号：δ12.36(1h，s)，5.48(1h，s)；1个次甲二氧基信号：δ5.95(2h，s)以及2个芳环甲基氢核信号：δ2.03(3h，s)、2.07(3h，s)。化合物iii的13cnmr(50mhz，cdcl3)显示有3个脂肪碳、12个芳环碳、1个羰基碳以及2个甲基碳信号。以上数据显示化合物iv为二氢高异黄酮类化合物，其数据和文献(tadaa，kasar，saitoht，etal.studiesontheconstituentsofophionogonistuberv.isolationofnovelclassofhomoisoflavonoidsanddeterminationoftheirstructure(1).chem.pharmbull，1980，28(5)：1477)基本一致，确定其平面结构为5，7-dihydroxy-6，8-dimethyl-3-(3’，4’-methylenedioxybenzyl)-chroman-4-one(methylophiopogonanonea)。
现有技术以柱分离的形式将式i-iv分离，研发出另一种分离方式仍具有较为重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种分离提取麦冬中黄酮的方法，具有分离不同黄酮类化合物的优点。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种分离提取麦冬中黄酮的方法，包括以下步骤：
(1)取干麦冬，粉碎并过50～100目筛，放入回流装置内；向回流装置内加入第一乙醇水溶液，加热至回流，反应2～3hr，得到提取液；干麦冬和第一乙醇水溶液的质量比为1∶8～10，第一乙醇水溶液中乙醇的含量为75～90wt％；
(2)取步骤(1)的提取液用0.45～0.22μm有机过滤膜过滤，得到滤液和滤渣，取滤液在30～35℃下真空干燥除尽溶剂，加水使析出的样品溶解并用水定容，作为供试液；初始加入的干麦冬的质量和定容后的供试液的体积的比1kg∶1～2l；
(3)将步骤(2)的供试液上ab-8大孔树脂柱，上样吸附1.0～1.5hr后，用第一蒸馏水洗脱，收集洗脱液和上样流出液合并为流出液a；大孔树脂再用0.08～0.12mol/l的氨水进行洗脱，收集流出液b；大孔树脂再用第二蒸馏水冲洗至中性，再用第二乙醇水溶液洗脱，收集流出液c；第二乙醇水溶液中乙醇的含量为45～60wt％；供试液、第一蒸馏水、氨水、第二蒸馏水和第二乙醇水溶液的体积比为1∶4～5∶4～5∶4～5∶4～5；
(4)取步骤(3)的洗出液b，加入0.5～1.0mol/l盐酸调节至中性，将其上ab-8大孔树脂柱，用第三蒸馏水淋洗，再用第三乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液并在30～35℃下真空干燥除尽溶剂，得到麦冬总黄酮粉末；第三乙醇水溶液中乙醇的含量为75～90wt％；洗出液b、第三蒸馏水和第三乙醇水溶液的体积比为1∶2～3∶2～3；
(5)取步骤(4)的麦冬总黄酮粉末加至反应瓶内，向反应瓶内加入乙醚、氯化钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1，于25～28℃下超声分散30～40min，用0.45～0.22μm有机过滤膜过滤，得到第一滤液和第一滤渣；麦冬总黄酮粉末、乙醚、氯化钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1的质量比为1∶3～4∶0.01～0.02∶0.05～0.06；
(6)取步骤(5)的第一滤渣，在30～35℃下真空干燥除尽溶剂，加至反应瓶内，向反应瓶内加入乙醚、氯化钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1，于30～32℃下超声分散30～40min，用0.45～0.22μm有机过滤膜过滤，得到第二滤液和第二滤渣；第一滤渣、乙醚、氯化钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1的质量比为1∶6～8∶0.06～0.07∶0.15～0.18；
(7)取步骤(6)的第二滤渣，在30～35℃下真空干燥除尽溶剂，加至反应瓶内，向反应瓶内加入乙醚、氯化钠、碳酸氢钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1，于34～35℃下超声分散30～40min，用0.45～0.22μm有机过滤膜过滤，得到第三滤液和第三滤渣；第二滤渣、乙醚、氯化钠、碳酸氢钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1的质量比为1∶4～5∶0.05～0.06∶0.05～0.06∶0.08～0.10；
(8)取步骤(7)的第三滤渣，在30～35℃下真空干燥除尽溶剂，加至反应瓶内，向反应瓶内加入乙酸乙酯、氯化钠、碳酸氢钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1，于25～26℃下超声分散30～40min，用0.45～0.22μm有机过滤膜过滤，得到第四滤液和第四滤渣；第三滤渣、乙酸乙酯、氯化钠、碳酸氢钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1的质量比为1∶3～4∶0.03～0.04∶0.05～0.06∶0.06～0.08；
(9)分别取步骤(5)的第一滤液、步骤(6)的第二滤液、步骤(7)的第三滤液和步骤(8)的第四滤液，分别在30～35℃下真空干燥除尽溶剂，加入水并于15～35℃下超声分散，分别过滤取滤液，分别将滤液在30～35℃下真空干燥除尽溶剂，分别得到与第一滤液、第二滤液、第三滤液、第四滤液一一对应的产品i、产品ii、产品iii和产品iv。
进一步优选为：步骤(5)中还添加有氧化钙，麦冬总黄酮粉末、乙醚、氯化钠、粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1和氧化钙的质量比为1∶3～4∶0.01～0.02∶0.05～0.06∶0.005～0.008；
步骤(6)中还添加有氧化钙，第一滤渣、乙醚、氯化钠、粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1和氧化钙的质量比为1∶6～8∶0.06～0.07∶0.15～0.18∶0.005～0.008；
步骤(7)中还添加有氧化钙，第二滤渣、乙醚、氯化钠、碳酸氢钠、粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1和氧化钙的质量比为1∶4～5∶0.05～0.06∶0.05～0.06∶0.08～0.10∶0.005～0.008；
步骤(8)中还添加有氧化钙，第三滤渣、乙酸乙酯、氯化钠、碳酸氢钠、粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1和氧化钙的质量比为1∶3～4∶0.03～0.04∶0.05～0.06∶0.06～0.08∶0.005～0.008。
综上所述，本发明具有以下有益效果：可将麦冬中结构相似的多个黄酮类化合物分离开，分离得到的黄酮纯度高、产率高，过程简便易控制。
具体实施方式
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的保护范围内都受到专利法的保护。
实施例1：一种分离提取麦冬中黄酮的方法，包括以下步骤：
(1)取干麦冬，粉碎并过50目筛，放入回流装置内；向回流装置内加入第一乙醇水溶液，加热至回流，反应3hr，得到提取液；干麦冬和第一乙醇水溶液的质量比为1∶8，第一乙醇水溶液中乙醇的含量为90wt％；
(2)取步骤(1)的提取液用0.45μm有机过滤膜过滤，得到滤液和滤渣，取滤液在30℃下真空干燥除尽溶剂，加水使析出的样品溶解并用水定容，作为供试液；初始加入的干麦冬的质量和定容后的供试液的体积的比1kg∶1l；
(3)将步骤(2)的供试液上ab-8大孔树脂柱，上样吸附1.0hr后，用第一蒸馏水洗脱，收集洗脱液和上样流出液合并为流出液a；大孔树脂再用0.08mol/l的氨水进行洗脱，收集流出液b；大孔树脂再用第二蒸馏水冲洗至中性，再用第二乙醇水溶液洗脱，收集流出液c；第二乙醇水溶液中乙醇的含量为45wt％；供试液、第一蒸馏水、氨水、第二蒸馏水和第二乙醇水溶液的体积比为1∶4∶4∶4∶4；
(4)取步骤(3)的洗出液b，加入0.5mol/l盐酸调节至中性，将其上ab-8大孔树脂柱，用第三蒸馏水淋洗，再用第三乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液并在30℃下真空干燥除尽溶剂，得到麦冬总黄酮粉末；第三乙醇水溶液中乙醇的含量为75wt％；洗出液b、第三蒸馏水和第三乙醇水溶液的体积比为1∶2∶2；
(5)取步骤(4)的麦冬总黄酮粉末加至反应瓶内，向反应瓶内加入乙醚、氯化钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1，于25℃下超声分散40min，用0.45μm有机过滤膜过滤，得到第一滤液和第一滤渣；麦冬总黄酮粉末、乙醚、氯化钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1的质量比为1∶3∶0.01∶0.05；
(6)取步骤(5)的第一滤渣，在30℃下真空干燥除尽溶剂，加至反应瓶内，向反应瓶内加入乙醚、氯化钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1，于30℃下超声分散40min，用0.45μm有机过滤膜过滤，得到第二滤液和第二滤渣；第一滤渣、乙醚、氯化钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1的质量比为1∶6∶0.06∶0.15；
(7)取步骤(6)的第二滤渣，在30℃下真空干燥除尽溶剂，加至反应瓶内，向反应瓶内加入乙醚、氯化钠、碳酸氢钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1，于34℃下超声分散40min，用0.45μm有机过滤膜过滤，得到第三滤液和第三滤渣；第二滤渣、乙醚、氯化钠、碳酸氢钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1的质量比为1∶4∶0.05∶0.05∶0.08；
(8)取步骤(7)的第三滤渣，在30℃下真空干燥除尽溶剂，加至反应瓶内，向反应瓶内加入乙酸乙酯、氯化钠、碳酸氢钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1，于25℃下超声分散40min，用0.45μm有机过滤膜过滤，得到第四滤液和第四滤渣；第三滤渣、乙酸乙酯、氯化钠、碳酸氢钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1的质量比为1∶3∶0.03∶0.05∶0.06；
(9)分别取步骤(5)的第一滤液、步骤(6)的第二滤液、步骤(7)的第三滤液和步骤(8)的第四滤液，分别在30℃下真空干燥除尽溶剂，加入水并于15℃下超声分散，分别过滤取滤液，分别将滤液在30℃下真空干燥除尽溶剂，分别得到与第一滤液、第二滤液、第三滤液、第四滤液一一对应的产品i、产品ii、产品iii和产品iv。
实施例2：一种分离提取麦冬中黄酮的方法，包括以下步骤：
(1)取干麦冬，粉碎并过100目筛，放入回流装置内；向回流装置内加入第一乙醇水溶液，加热至回流，反应2hr，得到提取液；干麦冬和第一乙醇水溶液的质量比为1∶10，第一乙醇水溶液中乙醇的含量为75wt％；
(2)取步骤(1)的提取液用0.22μm有机过滤膜过滤，得到滤液和滤渣，取滤液在35℃下真空干燥除尽溶剂，加水使析出的样品溶解并用水定容，作为供试液；初始加入的干麦冬的质量和定容后的供试液的体积的比1kg∶2l；
(3)将步骤(2)的供试液上ab-8大孔树脂柱，上样吸附1.5hr后，用第一蒸馏水洗脱，收集洗脱液和上样流出液合并为流出液a；大孔树脂再用0.12mol/l的氨水进行洗脱，收集流出液b；大孔树脂再用第二蒸馏水冲洗至中性，再用第二乙醇水溶液洗脱，收集流出液c；第二乙醇水溶液中乙醇的含量为60wt％；供试液、第一蒸馏水、氨水、第二蒸馏水和第二乙醇水溶液的体积比为1∶5∶5：5∶5；
(4)取步骤(3)的洗出液b，加入0.5～1.0mol/l盐酸调节至中性，将其上ab-8大孔树脂柱，用第三蒸馏水淋洗，再用第三乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液并在30～35℃下真空干燥除尽溶剂，得到麦冬总黄酮粉末；第三乙醇水溶液中乙醇的含量为90wt％；洗出液b、第三蒸馏水和第三乙醇水溶液的体积比为1∶3∶3；
(5)取步骤(4)的麦冬总黄酮粉末加至反应瓶内，向反应瓶内加入乙醚、氯化钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1，于28℃下超声分散30min，用0.22μm有机过滤膜过滤，得到第一滤液和第一滤渣；麦冬总黄酮粉末、乙醚、氯化钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1的质量比为1∶4∶0.02∶0.06；
(6)取步骤(5)的第一滤渣，在35℃下真空干燥除尽溶剂，加至反应瓶内，向反应瓶内加入乙醚、氯化钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1，于32℃下超声分散30min，用0.22μm有机过滤膜过滤，得到第二滤液和第二滤渣；第一滤渣、乙醚、氯化钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1的质量比为1∶8∶0.07∶0.18；
(7)取步骤(6)的第二滤渣，在35℃下真空干燥除尽溶剂，加至反应瓶内，向反应瓶内加入乙醚、氯化钠、碳酸氢钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1，于35℃下超声分散30min，用0.22μm有机过滤膜过滤，得到第三滤液和第三滤渣；第二滤渣、乙醚、氯化钠、碳酸氢钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1的质量比为1∶5∶0.06∶0.06∶0.10；
(8)取步骤(7)的第三滤渣，在35℃下真空干燥除尽溶剂，加至反应瓶内，向反应瓶内加入乙酸乙酯、氯化钠、碳酸氢钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1，于26℃下超声分散30min，用0.22μm有机过滤膜过滤，得到第四滤液和第四滤渣；第三滤渣、乙酸乙酯、氯化钠、碳酸氢钠和粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1的质量比为1∶4∶0.04∶0.06∶0.08；
(9)分别取步骤(5)的第一滤液、步骤(6)的第二滤液、步骤(7)的第三滤液和步骤(8)的第四滤液，分别在35℃下真空干燥除尽溶剂，加入水并于35℃下超声分散，分别过滤取滤液，分别将滤液在35℃下真空干燥除尽溶剂，分别得到与第一滤液、第二滤液、第三滤液、第四滤液一一对应的产品i、产品ii、产品iii和产品iv。
实施例3：一种分离提取麦冬中黄酮的方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(5)中还添加有氧化钙，麦冬总黄酮粉末、乙醚、氯化钠、粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1和氧化钙的质量比为1∶3∶0.01∶0.05∶0.005；步骤(6)中还添加有氧化钙，第一滤渣、乙醚、氯化钠、粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1和氧化钙的质量比为1∶6∶0.06∶0.15∶0.005；步骤(7)中还添加有氧化钙，第二滤渣、乙醚、氯化钠、碳酸氢钠、粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1和氧化钙的质量比为1∶4∶0.05∶0.05∶0.08∶0.005；步骤(8)中还添加有氧化钙，第三滤渣、乙酸乙酯、氯化钠、碳酸氢钠、粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1和氧化钙的质量比为1∶3∶0.03∶0.05∶0.06∶0.005。
实施例4：一种分离提取麦冬中黄酮的方法，与实施例2的不同之处在于，步骤(5)中还添加有氧化钙，麦冬总黄酮粉末、乙醚、氯化钠、粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1和氧化钙的质量比为1∶4∶0.02∶0.06∶0.008；步骤(6)中还添加有氧化钙，第一滤渣、乙醚、氯化钠、粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1和氧化钙的质量比为1∶8∶0.07∶0.18∶0.008；步骤(7)中还添加有氧化钙，第二滤渣、乙醚、氯化钠、碳酸氢钠、粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1和氧化钙的质量比为1∶5∶0.06∶0.06∶0.10∶0.008；步骤(8)中还添加有氧化钙，第三滤渣、乙酸乙酯、氯化钠、碳酸氢钠、粉碎后的金属有机框架化合物hkust-1和氧化钙的质量比为1∶4∶0.04∶0.06∶0.08∶0.008。
性能表征
1、纯度测试
测试方法：hplc法。采用日本岛津lc-10avp高效液相色谱仪，附紫外检测器。色谱柱为迪马c18：250mm×4.6mm，5μm。流动相为乙腈和水，梯度洗脱：1-15min：17％乙腈；15-17min：17％乙腈变为30％；17-40min：保持30％乙腈；40-42min：30％乙腈变为17％。流速为1ml/min，进样体积为10μl，检测波长为260nm，温度为30℃。数据采用归一法计算。
测试结果如表1所示。表1显示，实施例1-4中的化合物i-iv得到较好的分离，产品纯度较高。
表1纯度测试
2、收率测试
收率＝产品质量/原料质量×100％，其中产品质量可直接采用称取产品的方式得到，而原料质量＝含量×干麦冬，含量可根据hplc测试并计算得到。hplc含量数据采用5点标准曲线法计算。
测试结果如表2所示。表2显示，实施例1-4中的化合物i-iv收率高。
表2收率测试
以上内容不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。