本发明属于医药技术领域，尤其是涉及一种甲硝唑栓微生物限度检查方法。
背景技术：
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甲硝唑栓主要成份为甲硝唑，基质为脂肪酸甘油酯、甘油、明胶、液体石蜡、香果酯等，甲硝唑能够抑制细菌的脱氧核糖核酸的合成，从而干扰细菌的生长、繁殖，最终致细菌死亡，甲硝唑栓有抑制微生物生长的作用。甲硝唑栓基质含大量脂溶性成分，难溶于水。
各个企业采用不同方式，解决供试液均一性和消除抑菌作用，部分企业用十四烷基异丙酯萃取方式；另外企业采用吐温-80助溶，体积高到40％，泡沫量大，不易过滤提取方法。在洁净区采用剧烈振摇，不符合洁净区试验管理办法，有机溶剂萃取、振摇造成微生物损伤，污染环境。
技术实现要素：
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本发明所要解决的技术问题是：提供一种甲硝唑栓微生物限度检查方法，避免在洁净区振摇、萃取，减少对药品中微生物损伤。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：一种甲硝唑栓微生物限度检查方法，包括以下步骤，
s1、供试液制备：将甲硝唑栓加在稀释剂中，在40℃水浴中保温10min，用匀浆仪反复拍打1min，作为1:20供试液；
s2、在试管一中加入微生物进行薄膜过滤，过滤过程中按体积量取300份的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液进行分次冲洗，过滤完成后取出滤膜，面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上培养48h并计数，作为对照样本；
s2、按体积量取甲硝唑栓1：20的供试液4份，加到装有100份ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管二中在40℃水浴中保温，摇匀，加入微生物进行薄膜过滤，过滤过程用300份的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液进行分次冲洗，过滤完成后取出滤膜，面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上培养48h并计数，并与试管一中的对照样本进行对照。
作为优选，步骤s1中的稀释剂选用吐温-80或十四烷基异丙酯。
作为优选，步骤s2和s3中每次使用100份ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液进行分次冲洗，共计冲洗三次。
作为优选，步骤s2和s3加入进行薄膜过滤的微生物为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌悬液(小于100cfu)。
与现有技术相比，本发明的有益之处是：本发明采用加吐温-80助溶，在40℃水浴中保温，保证供试液均一性。方法简单，易于操作。避免在洁净区振摇、萃取，减少对药品中微生物损伤。
附图说明：
图1是稀释剂选择测试结果图。
图2是吐温-80对阳性菌生长的影响结果图。
图3是冲洗液类型选择测试结果图。
图4是冲洗液体积选择测试结果图。
图5是甲硝唑栓方法适用性试验结果图。
具体实施方式：
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述：
稀释剂选择：
如图1所示，将甲硝唑栓5g加在不同稀释剂中，在40℃水浴中保温10分钟，用匀浆仪反复拍打1分钟，作为1:20供试液。图1结果所示，加入吐温-80、十四烷基异丙酯有利于甲硝唑栓溶解，可均质成1:20供试液。
测试助溶剂对阳性菌生长的影响：
在一支试验管中加入1.5ml十四烷基异丙酯，在另一支试验管中加入1.5ml吐温-80，在适宜温度下培养48h，观察，记录结果。同时做阴性对照管。其结果如图2所示，十四烷基异丙酯影响阳性菌生长，吐温-80对阳性菌生长影响较小，与阳性对照管生长无差异。阴性对照管：无菌生长。
冲洗液和冲洗体积选择：
一、冲洗液选择：取甲硝唑栓1：20的供试液4ml，加到ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(40℃水浴中保温)100ml中，摇匀，进行薄膜过滤，用不同冲洗液过滤效果。其结果如图3所示，40℃水浴中保温的吐温-80(10％)ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液和ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液易冲洗。
二、冲洗液冲洗体积选择：用ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，每次100ml，其中一筒在最后一次冲洗液中加入金黄色葡萄球菌、生孢梭菌和白色念珠菌菌悬液1ml(小于100cfu)，分别加入100ml胰酪大豆胨液体培养基和沙氏葡萄糖液体培养基；同时进行阳性对照试验；取各种菌的菌悬液1ml注皿，培养，记菌数。其结果如图4所示，采用用300ml冲洗，每次100ml，金黄色葡萄球菌、生孢梭菌和白色念珠菌48小时，能够检出，与阳性对照菌管菌生长状态一致。
需氧菌总数：
取甲硝唑栓1：20的供试液4ml，加到ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(40℃水浴中保温)100ml中，摇匀，加入金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌悬液(小于100cfu)，进行薄膜过滤，用300ml的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上，培养、计数。其结果如图5所示。
霉菌及酵母菌总数：方法同上，在最后一次冲洗液中加入白色念珠菌、黑曲霉取出滤膜，面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，培养、计数。其结果如图5所示。
采用薄膜过滤法，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌回收率高于50％。
控制菌检查
一、金黄色葡萄球菌
取甲硝唑栓1：20的供试液10ml，加到ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(40℃水浴中保温)100ml中，摇匀，加入金黄色葡萄球菌菌悬液(小于100cfu)，进行薄膜过滤，用800ml的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，每次100ml，过滤后加入100ml胰酪大豆胨液体培养基，培养，按《中国药典》2015年版四部147页金黄色葡萄球菌检查项进行试验。
二、铜绿假单胞菌，其检查方法同金黄色葡萄球菌的检查方法。
三、白色念珠菌，其检查方法同金黄色葡萄球菌的检查方法，白色念珠菌菌悬液(小于100cfu)加入100ml沙氏葡萄糖液体培养基中。
结果，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的加菌量分别为69、71和70时，各试验组与阳性对照组在胰酪大豆胨液体中生长、在选择培养基上菌落形态、染色、镜检一致。
需要强调的是：对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。