本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种低丰度突变dna的loop式富集检测引物及其应用。
背景技术
检测生物样本中dna突变或微量等位基因在肿瘤诊断、筛查和预后检测等领域具有重要意义。目前基于pcr检测dna突变的技术主要有arms-pcr技术(amplificationrefractorymutationsystempcr)、基于酶切的pcr富集技术、基于连接的pcr富集技术、基于blocker阻碍的pcr富集技术、低变性温度的复合pcr富集技术(co-amplificationatlowerdenaturationtemperaturepcr，cold-pcr)以及digitalpcr技术等。
由于有些晚期癌症患者，比如晚期肺癌患者的组织样本难以获取，对其检测造成一定的局限性，因此需要找到更易于获取的标本进行检测，如外周血循环dna的检测。基于外周血循环dna与相应的原发性肿瘤细胞在遗传特异性上相一致，可以将其作为肿瘤诊断、筛查和预后检测等的检测指标，因此，外周血游离dna的检测成为目前研究的热点。
然而，外周血循环dna中突变核酸含量较低，以肺癌表皮生长因子受体(egfr)突变检测为例，sanger测序和arms-pcr法这两种方法的灵敏度均较低，测序仅能检测出5％以上的egfr单碱基位点突变，arms-pcr法可检测十分之一～千分之一的egfr单碱基位点突变，采用sanger测序和arms-pcr法均难以检测出突变。这就需要一种检测灵敏度高的检测技术，目前常用的是digitalpcr，该技术可检测千分之一～十万分之一的突变，但该技术依赖特定仪器进行检测，检测成本高昂。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种低丰度突变dna的loop式富集检测引物，特别是用于检测egfr突变中的l858r和t790m突变的富集检测引物，使得所述引物灵敏度高、特异性好，并且可有效的富集并检测出样本中低至万分之一的突变，可将万分之一的突变模板富集100～1000倍以上；
本发明的另外一个目的在于提供包括所述富集检测引物的检测试剂盒，适用于普通pcr和实时荧光定量pcr，特别是应用在egfr突变中的l858r和t790m突变检测中；
本发明的另外一个目的在于提供使用所述富集检测引物检测低丰度dna的方法，适用于普通pcr和实时荧光定量pcr，特别是应用在egfr突变中的l858r和t790m突变检测中。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种低丰度突变dna的loop式富集检测引物，包括上游引物，所述上游引物由辅助引物、连接序列和扩增引物组成，所述辅助引物、连接序列和扩增引物依次连接；
所述辅助引物长度为11-16nt，其上设计有所述突变dna的突变位点，所述辅助引物与所述突变dna可完全互补配对，并与所述突变dna相对应的野生dna有一个突变碱基的不匹配；
所述扩增引物长度为10-14nt，与所述突变dna和野生dna均可完全匹配；
所述辅助引物tm值高于扩增引物tm值3℃以上；优选为高于3-10℃，更优选为高于3-5℃；在具体实施方式中，可选择为高于3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃。
所述富集检测引物与所述突变dna结合时，所述扩增引物结合区域位于所述辅助引物结合区域的上游，且所述辅助引物的5’末端与所述扩增引物的3’末端在所述突变dna上的结合位置间隔0-5个碱基；
所述连接序列与所述突变dna和野生dna均不结合。
本发明富集检测引物中辅助引物tm值略高于扩增引物tm值，使扩增引物在较高的退火温度下，只有辅助引物与模板结合的情况下，才能与模板结合，启动扩增反应；如果辅引物未与模板结合，扩增引物由于其序列太短不能与模板结合启动扩增反应。由此通过辅助引物与突变型模板和野生型模板的差异性结合达到对突变型模板和野生型模板的差异扩增的；所述连接序列连接辅助引物和扩增引物，当辅助引物与扩增引物与模板结合后，本发明所述富集检测引物呈loop式结构。原理示意图参见图1。
作为优选，所述连接序列由oligo(dt)和c12spacer组成。其中，c12spacer除起连接作用外，在扩增过程中可阻碍扩增产物的延伸，避免互补链的过度延伸，对下一轮的富集效果产生负面影响。在本发明的具体实施方式中，所述oligo(dt)聚合度为25-35nt；更具体地，所述oligo(dt)聚合度为28nt或32nt。
在本发明的具体实施方式中，本发明所述富集检测引物为针对突变egfr的富集检测引物，即所述辅助引物长度为11-16nt，其上设计有突变egfr的突变位点，所述辅助引物与突变的egfr可完全互补配对，并与野生egfr有一个突变碱基的不匹配；
所述扩增引物长度为10-14nt，与所述突变的egfr和野生的egfr均可完全匹配。
其中，所述辅助引物长度可具体为11或15nt，所述扩增引物长度可具体为11或12nt。
更近一步地，本发明所述富集检测引物针对egfr突变中的l858r突变和t790m突变。则所述富集检测引物分为富集检测t790m突变的引物和富集检测l858r突变的引物。在富集检测t790m突变的引物中，所述辅助引物长度为11-16nt，其上设计有突变egfr的t790m突变位点，所述辅助引物与突变egfr可完全互补配对，并与野生egfr有一个突变碱基的不匹配；
所述扩增引物长度为10-14nt，与所述突变egfr和野生egfr均可完全匹配。
其中，作为一个具体的实施例，所述辅助引物的序列如seqidno:1所示，所述扩增引物的序列如seqidno:2所示。
在富集检测l858r突变的引物中，所述辅助引物长度为11-16nt，其上设计有突变egfr的l858r突变位点，所述辅助引物与突变egfr可完全互补配对，并与野生egfr有一个突变碱基的不匹配；
所述扩增引物长度为10-14nt，与所述突变egfr和野生egfr均可完全匹配。
其中，作为一个具体的实施例，所述辅助引物的序列如seqidno:3所示，所述扩增引物的序列如seqidno:4所示。
作为优选，本发明所述富集检测引物还包括和所述上游引物对应的下游引物，其可根据突变dna模板进行设计；在本发明中，所述下游引物长度在20-25nt。在本发明具体实施方式中，当所述富集检测引物为富集检测t790m突变的引物时(即当辅助引物上设计有突变egfr的t790m突变位点时)，所述下游引物序列如如seqidno:5所示；当所述富集检测引物为富集检测l858r突变的引物时(即当辅助引物上设计有突变egfr的l858r突变位点时)，所述下游引物的序列如seqidno:6所示。
采用本发明富集检测引物可有效的检测出浓度在万分之一的突变，对万分之一的突变模板可有效富集100～1000倍以上，且对野生型dna不扩增，使用测序引物进行扩增并测序，测序结果与本发明检测结果一致，表明本发明所述富集检测引物特异性高、准确度高以及灵敏度高。基于此，本发明提供了所述富集检测引物在检测突变dna和/或制备检测突变dna试剂盒中的应用。
根据应用，本发明提供了一种检测低丰度突变dna的试剂盒，包括本发明所述富集检测引物。
作为优选，所述试剂盒还包括如下组分中的一种或两种以上：
富集检测扩增试剂、突变dna阳性质控品、野生dna阴性质控品、突变dna测序上/下游引物、测序上/下游通用引物、测序扩增试剂。
其中，所述富集检测扩增试剂为：0.5mmdntp、4mmmgcl2、60mmnh4cl、50mmtris-hcl(ph8.0)、100mmkcl、0.2u/μldna聚合酶(本发明引物的特殊结构，要求扩增所用的dna聚合酶必须具有5’→3’的外切酶活性)；
所述突变dna阳性质控品为含有突变dna的重组质粒，例如针对t790m突变时，为含有t790m突变序列的重组质粒；针对l858r突变时，为含有l858r突变序列的重组质粒，所述重组质粒可采用商用质粒为基础质粒，例如puc质粒。
所述野生dna阴性质控品为未发生突变的dna，例如针对egfr突变时，为egfr未发生突变的人血基因组核酸。
所述突变dna测序上/下游引物、测序上/下游通用引物作为辅助检测组分，用以通过测序手段进一步验证本发明富集检测结果。突变dna测序上/下游引物针对经由所述富集检测引物扩增后的loop式扩增产物设计，在引物序列中引入了一段悬挂式序列及通用引物。
在本发明具体实施方式中，针对t790m突变的测序上/下游引物序列如seqidno:17-18所示，针对l858r突变的测序上/下游引物序列如seqidno:19-20所示；所述测序上/下游通用引物序列如seqidno:21-22所示。
所述测序扩增试剂为：0.5mmdntp、3mmmgcl2、50mmtris-hcl(ph8.0)、100mmkcl、0.2u/μldna聚合酶。
采用上述试剂盒可通过普通pcr验证，故本发明对应提供了一种检测突变dna的方法，采用所述试剂盒对待测样本的核酸进行普通pcr富集扩增，根据电泳条带的有无并结合测序(因本发明富集检测引物强大的富集作用，可达到用于测序的要求)判断dna有无发生突变。
其中，所述普通pcr扩增体系为：
12.5μl的富集检测扩增试剂，2.5μl的富集检测引物，5～10μl的相应模板，补水至25μl，混合均匀。
所述普通pcr富集扩增程序：
95℃5min，循环1次；
95℃5s、56℃10s、68℃30s，循环15次；
95℃5s、60℃5s、68℃30s，循环35次；
为了通过测序手段进一步验证本发明富集检测结果，在普通pcr测序扩增中扩增体系为：
12.5μl的测序扩增试剂，2.5μl相应引物组分，5μl模板(以上述普通pcr富集扩增产物稀释1000倍作为模板)，补水5μl至总体积25μl，混合均匀。
所述普通pcr测序扩增程序：
95℃5min，循环1次；
95℃10s、60℃60s，循环40次；
在上述试剂盒组分基础上，其还可包括如下组分中的一种或两种以上(基于实时荧光定量pcr的试剂盒)：
外质控品、修饰有荧光报告基团以及荧光淬灭基团的突变dna探针、内质控序列检测上/下游引物、修饰有荧光报告基团以及荧光淬灭基团的内质控序列检测探针、外质控检测上/下游引物、修饰有荧光报告基团以及荧光淬灭基团的外质控检测探针。
其中，内质控序列为突变dna中突变位点序列附近的一段不发生突变序列，其作用一是判断样本是否含有突变；二是质控样本的基因含量，即用于质控待测样本核酸模板中含有突变dna+野生dna基因的含量，并与突变位点检测扩增对比，得出最终检测结果；例如针对egfr突变时，内质控品为egfr基因除本发明t790m和l858r扩增序列之外的一段序列，用于质控模板含有egfr基因的含量，并与突变位点检测扩增对比，得出最终检测结果；在本发明具体实施方式中，针对egfr突变的内质控序列如seqidno:7所示。所述内质控检测上/下游引物以及内质控检测探针根据内质控序列进行设计，针对seqidno:7所示的序列，本发明具体实施方式中提供了如seqidno:8-9所示的内质控检测上/下游引物，以及如seqidno:10所示的内质控检测探针。
外质控品为含有扩增的rnasep基因的一段序列的重组质粒，用于质控所配制的检测体系是否存在问题；在本发明具体实施方式中，所述含有扩增的rnasep基因的一段序列如seqidno:11所示，同时针对该序列提供了如seqidno:12-13所示的外质控检测上/下游引物，以及如seqidno:14所示的外质控检测探针。
修饰有荧光报告基团以及荧光淬灭基团的突变dna探针，可根据待检测的突变dna进行设计并修饰荧光报告基团以及淬灭基团，以t790m突变和l858r突变为例，t790m突变的探针序列如seqidno:15所示，l858r突变的探针序列如seqidno:16所示。
作为优选，所述荧光报告基团可选自fam或joe，所述荧光淬灭基团可选自bhq1或bhq2。
同时，本发明还提供了一种采用上述基于实时荧光定量pcr的试剂盒检测突变dna的方法，即采用该试剂盒对待测样本的核酸进行实时荧光定量pcr富集扩增。
更具体地，本发明提供了一种采用上述基于实时荧光定量pcr的试剂盒检测突变egfr的方法，即采用试剂盒对待测样本的核酸进行实时荧光定量pcr富集扩增，当外质控(pc，外质控品检测)检测荧光信号ct≤20时，阴性对照(nc，野生dna阴性质控品检测)检测结果无s型扩增曲线时，内质控(ic，内质控序列检测)荧光检测信号10＜ct≤22时，检测结果有效；
针对t790m突变的检测，当所述富集检测引物扩增待测样本核酸的ct值-内质控引物扩增待测样本核酸的ct值的δct≤13.8时检测结果为阳性，所述δct＞13.8时检测结果为阴性；针对l858r突变的检测，当所述δct≤13.2时检测结果为阳性，所述δct＞13.2时检测结果为阴性；当内质控荧光检测信号ct＞22时，说明模板用量过少，需增加模板加入量重新检测，当内质控荧光检测信号ct＜10时，说明模板浓度过高，可将模板进行适当稀释然后重新检测。
此外，当检测结果δct＞10，尤其是t790m检测δct＞13.8，l858r检测δct>13.2，说明其中不含有突变型模板或其低于千分之一或者万分之一，无法通过该方法直接确定其是否含有突变型模板，为了进一步确认，可将本发明loop式引物扩增后的产物再次进行测序引物的扩增，然后送测序，确定是否真的含有突变型基因。
由以上技术方案可知，本发明通过一段loop式结构连接两段短的核苷酸序列，利用碱基堆积作用达到突变型和野生型的差异扩增，可将浓度低至万分之一的突变富集至百分之一～十分之一，达到sanger测序的检测范围，使其可与sanger测序相结合进行低丰度突变的检测。本发明适用于突变含量低的外周血游离dna的检测，具有采样简单、方便，对病患造成的痛苦少，该检测技术具有特异性好、灵敏度度高、操作简单，检测周期短，检测成本低等优点。
附图说明
图1所示为本发明富集检测引物的扩增原理图；
图2所示为本发明针对t790m突变的富集检测引物与模板结合的示意图；
图3所示为t790m突变经本发明富集与未富集的检测结果；
图4所示为外质控品、内质控品和阴性对照品的扩增曲线；
图5所示为t790m突变标准品的扩增曲线；
图6所示为l858r突变标准品的扩增曲线；
图7所示为t790m突变和l858r突变的万分之一测序结果。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种低丰度突变dna的loop式富集检测引物及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的引物和相关应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的引物及相关应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在具体实施方式中，本发明以突变egfr中的t790m突变和l858r突变为例对本发明所述富集检测引物进行详细阐述，但这并非限制本发明所述富集检测引物仅能用于检测突变egfr中的t790m突变和l858r突变，在核心原理相同的情形下，本发明所述富集检测引物可以针对任何突变dna的检测。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种低丰度突变dna的loop式富集检测引物及其应用进行详细说明。
实施例1：本发明检测t790m突变和l858r突变的富集检测引物
表1
表1中，t790m-loop-f和l858r-loop-f为针对t790m突变和l858r突变的富集检测引物，其中下划线处为突变位点碱基；t790m-r和l858r-r分别为各自对应的下游引物，序列如seqidno:5-6所示。
t790m-loop-f中，oligo(dt)聚合度为32，为c12表示c12spacer修饰，tcatcatgcagctca为辅助引物核酸序列(seqidno:1所示)，caccgtgcagc为扩增引物核酸序列(seqidno:2所示)，且扩增引物3’端和辅助引物5’端与模板结合位点间隔0个碱基，示意图参见图2。
l858r-loop-f中，oligo(dt)聚合度为28，c12表示c12spacer修饰，gggcgggccaa为辅助引物核酸序列(seqidno:3所示)，gatcacagattt为扩增引物核酸序列(seqidno:4所示)，且扩增引物3’端和辅助引物5’端与模板结合位点间隔1个碱基。
实施例2：本发明检测t790m突变和l858r突变的富集检测试剂盒(普通pcr)
表2
表2中，cx-t790m-f和cx-t790m-r为t790m测序上下游扩增引物(seqidno:17-18所示)，cx-l858r-f和cx-l858r-r为l858r测序上下游扩增引物(seqidno:19-20所示)，cx-f和cx-r为上机测序上下游通用引物(seqidno:21-22所示)。
用于t790m和l858r突变富集检测试剂盒(普通pcr)由以下组分组成：t790m突变富集引物混合液，l858r突变富集引物混合液，t790m测序扩增引物混合液，l858r测序扩增引物混合液，测序上游通用引物cx-f，测序下游通用引物cx-r，突变富集扩增试剂，测序扩增试剂，阳性质控品，阴性质控品。
t790m突变富集引物混合液：为t790m-loop-f和t790m-r混合液，t790m-loop-f在体系中的浓度为0.5μm，t790m-r在体系中的浓度为0.35μm。
l858r突变富集引物混合液：为l858r-loop-f的l858r-r混合液，其中l858r-loop-f在体系中浓度为0.5μm，l858r-r在体系中浓度为0.3μm。
t790m测序扩增引物混合液：为cx-t790m-f和cx-t790m-r的混合液，两引物在体系中的浓度均为0.25μm。
l858r测序扩增引物混合液：为cx-l858r-f和cx-l858r-r的混合液，两引物在体系中的浓度均为0.25μm。
突变富集扩增试剂：0.5mmdntp、4mmmgcl2、60mmnh4cl、50mmtris-hcl(ph8.0)、100mmkcl、0.2u/μldna聚合酶。
测序扩增试剂：0.5mmdntp、3mmmgcl2、50mmtris-hcl(ph8.0)、100mmkcl、0.2u/μldna聚合酶。
阴性质控品：为egfr基因未发生突变的人血基因组核酸
阳性质控品：含有t790m突变序列的质粒puc-t790m-m，含有l858r突变序列的质粒puc-l858r-m，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
上机测序上游通用引物：10μmcx-f。
上机测序下游通用引物：10μmcx-r。
实施例3：本发明检测t790m突变和l858r突变的普通pcr方法
1、检测方法
采用实施例2的试剂盒进行两轮扩增进行检测，第一轮扩增进行低丰度突变的富集，第二轮扩增进行通用测序引物的添加，为上机测序做准备。
第一轮扩增体系的配制，取一个八联排pcr反应管，依次加入12.5μl的2×检测体系，2.5μl的相应引物组分，5～10μl的相应模板，补水至25μl，混合均匀，将配制好的pcr反应管置于pcr扩增仪中进行扩增。
第一轮扩增程序：
95℃5min，循环1次
95℃5s、56℃10s、68℃30s，循环15次
95℃5s、60℃5s、68℃30s，循环35次
第二轮扩增体系的配制，取一个八联排pcr反应管，依次加入12.5μl的2×测序扩增体系，2.5μl相应引物组分，5μl模板(以第一轮扩增产物稀释1000倍作为模板)，补水5μl至总体积25μl，混合均匀，将配置好的pcr反应管置于pcr扩增仪中进行扩增。
为了通过测序手段进一步验证本发明富集检测结果
第二轮扩增程序：
95℃5min，循环1次
95℃10s、60℃60s，循环40次
然后，将第二轮扩增产物进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳，将有扩增条带的扩增产物送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，对测序结果进行分析。
2、灵敏度和特异性检测
将阳性质控品puc-t790m和puc-l858r-m质粒稀释至10000拷贝/μl。阴性指控品稀释至10000拷贝/μl。将稀释好的阴性质控品与阳性质控品按下述比例进行混合，制备相应浓度的参考品，阳性质控品与阴性质控品混合比例0:100(纯野生型)、0.01:99.99(万分之一)、0.1:99.9(千分之一)、1:99(百分之一)、10:90(十分之一)、100:0(纯突变型)，以及不同测序测序对照检测浓度5:95(百分之五)、20:80(百分之二十)、40:60(百分之四十)、60:40(百分之六十)等浓度。
按照上述检测方法配制实施例2试剂盒相应的扩增试剂，取相应反应数的反应管依次加入12.5μl的突变富集检测扩增试剂，2.5μl的相应的引物混合液，5μl的双蒸水，5μl的相应的模板。同时进行不同浓度标准品的扩增，一轮扩增所用标准品浓度为纯野生型、万分之一、千分之一和百分之一，以及纯野生型和纯突变型模板的对照。为了保证实验结果的准确性每个样本同时做3次重复检测。将上述配制好的扩增体系置于pcr仪中进行扩增检测。
第一轮扩增程序如下:
95℃5min；
95℃5s、56℃10s、68℃30s，循环15次；
95℃5s、60℃5s、68℃30s，循环35次；
将上述扩增产物稀释100倍作为第二轮扩增的模板，同时采用浓度为万分之一、千分之一、百分之一、百分之五、百分之十、百分之二十、百分之四十、百分之六十的标准品作为对照，与检测样本同时进行扩增，然后将扩增产物送测序，对测序结果进行分析。
结果分析
将样本测序结果与对照组测序结果进行比对，发现浓度在万分之一的突变经过本发明的技术富集后，浓度可达百分之五以上，其富集倍数在100倍以上。测序结果如图3所示，为t790m经经第一轮富集后与未经第一轮扩增富集对照的测序结果。由实验组与对照组对比可以看出经本发明的方法富集后突变型浓度由原来的万分之一变为＞5％，达到sanger测序的检测范围。
由此，可以看出本发明富集检测引物可以实现对低丰度突变模板的富集。由纯野生型检测结果可以看出本发明的检测技术特异性好，可在较高的野生型浓度下检测出较低的突变型。由此可以得出结论，本发明的富集检测引物检测灵敏度高，特异性好，检测时间短，成本低。
3、临床样品检测
采集30例肺癌患者的血浆样本，其中已确定11例为egfr基因的t790m突变，12例为egfr基因的l858r突变，其余7例为其他突变或病因未明，此30例肺癌患者血浆样本均采自天坛医院。将采集的样本采用qiagen试剂盒进行核酸提取。然后按照本发明的方法进行检测，并与之前的检测结果进行对比，其结果如下表3所示。
表3
由该表可以看出，采用本发明的富集检测技术，其检测结果如表中所示，可以看出本发明的检测结果与医院之前采用的检测技术检测结果基本一致，之前检测结果为t790m(+)的，采用本发明的技术检测也是t790m(+)，医院检测为l858r(+)的，采用本发明的技术检测结果也是l858r(+)，在未知突变的样本中，采用本发明检测出1例t790m突变和1例l858r突变。经多种方法确认，该两个样本确实含有低丰度的相应突变。由此可以看出，本发明的检测灵敏度高于目前的医院所用的arms-pcr检测技术，且通过本技术可对低丰度的突变样本进行突变型模板的有效富集，其富集倍数可达100～1000倍以上。
实施例4：本发明检测t790m突变和l858r突变的富集检测试剂盒(实时荧光定量pcr)
表4
表4中，探针t790m-p，5’端修饰有荧光报告基团fam，3’端修饰有荧光淬灭基团bhq1；探针l858r-p，5’端修饰有荧光报告基团fam，3’端修饰有荧光淬灭基团bhq1；探针ic-p，5’端修饰有荧光报告基团joe，3’端修饰有荧光淬灭基团bhq2；探针rnp-p，5’端修饰有荧光报告基团fam，3’端修饰有荧光淬灭基团bhq1。
用于t790m和l858r突变富集检测的试剂盒由以下组分组成：t790m检测引物混合液，l858r检测引物混合液，外质控引物混合液，t790m测序扩增引物混合液，l858r测序扩增引物混合液，突变富集检测试剂，测序扩增试剂，测序通用上游引物cx-f，测序通用下游引物cx-r，外质控品，阳性质控品，阴性质控品，各组分组成如下所述。
t790m检测引物混合液组成为：t790m-loop-f、t790m-r和t790m-p以及内质控引物ic-f、ic-r和ic-p。其中，t790m-loop-f在体系中浓度为0.5μm，t790m-r在体系中浓度为0.3μm，t790m-p在体系中浓度为0.25μm，ic-f在体系中浓度为0.25μm，ic-r在体系中浓度为0.25μm，ic-p在体系中浓度为0.2μm。
l858r检测引物混合液组成为：l858r-loop-f、l858r-r和l858r-p以及内质控引物ic-f、ic-r和ic-p的混合液，其中l858r-loop-f在体系中浓度为0.5μm，l858r-r在体系中浓度为0.3μm，l858r-p在体系中浓度为0.25μm，ic-f在体系中浓度为0.25μm，ic-r在体系中浓度为0.25μm，ic-p在体系中浓度为0.2μm。
t790m测序扩增引物混合液组成为：cx-t790m-f和cx-t790m-r，在体系中其浓度分别为cx-t790m-f0.2μm、cx-t790m-r0.2μm。
l858r测序扩增引物混合液组成为：cx-l858r-f和cx-l858r-r，在体系中其浓度分别为cx-l858r-f0.2μm、cx-l858r-r0.2μm。
测序通用上游引物：10μmcx-f；
测序通用下游引物：10μmcx-r；
突变检测试剂组成为：0.5mmdntp、4mmmgcl2、60mmnh4cl、50mmtris-hcl(ph8.0)、100mmkcl、0.2u/μldna聚合酶。
测序扩增试剂组成为：0.5mmdntp、3mmmgcl2、50mmtris-hcl(ph8.0)、100mmkcl、0.2u/μldna聚合酶。
外质控品：为含有下述序列的重组质粒puc-rnp：gcagatttggacctgcgagcgggttctgacctgaaggctctgcgcggacttgtggagacagccgctcacc(seqidno:11)；
阴性质控品：为egfr基于未发生突变的人血基因组核酸
阳性质控品：含有t790m突变序列的质粒puc-t790m-m和含有l858r突变序列的质粒puc-l858r-m。
内质控序列：tatctcaacactgtccagcccacctgtgtcaacagcacattcgacagccctgcccactgggcccagaaaggcagccaccaaattagcctggacaaccctgactaccagcaggacttctttcccaaggaagccaagccaaatggcatctttaagggctc(seqidno:7)
实施例5：本发明检测t790m突变和l858r突变的实时荧光定量pcr方法
1、检测方法
采用实施例4试剂盒，根据实验需求取适量的八联排pcr反应管，依次加入12.5μl的富集检测试剂，2.5μl的相应引物组分，5～10μl相应的模板，补水至25μl，混合均匀，上机进行检测，采用abi7500实时荧光pcr仪进行的检测。样本检测选择fam和joe双通道进行荧光采集，外质控检测选择fam通道进行荧光信号采集，阳性对照和阴性对照检测选择fam通道进行荧光采集。富集扩增检测程序如下所述：
95℃5min，循环1次；
95℃5s、56℃10s、68℃30s，循环15次；
95℃5s、60℃5s、68℃30s(采集荧光)，循环35次。
检测时间仅需90min即可完成检测。
结果判读
每次检测均需同时进行外质控检测以及阳性对照和阴性对照检测。外质控阳性检测荧光采集通道为fam，样本检测同时选择fam和joe两个通道进荧光信号采集。当外质控(pc)检测fam信号ct≤20时，阴性对照(nc)检测结果无s型扩增曲线时，内质控(ic)joe检测信号10＜ct≤22时，检测结果有效，针对t790m突变的检测，当δct(检测-内质控)≤13.8时检测结果为阳性，δct＞13.8时检测结果为阴性；针对l858r突变的检测，当δct(检测-内质控)≤13.2时检测结果为阳性，δct＞13.2时检测结果为阴性。当内质控joe检测信号ct＞22时，说明模板用量过少，需增加模板加入量重新检测，当内质控joe检测信号ct＜10时，说明模板浓度过高，可将模板进行适当稀释然后重新检测。
本发明的富集检测技术对突变型和野生型模板的扩增差异较大，其检测过程同时也是对突变型模板的富集过程，所以，当检测结果δct＞10，尤其是当t790m突变检测＞13.8，l858r突变检测＞13.2时，可利用sanger测序进行辅助检测，对结果进行重复确认，其具体做法为将扩增产物稀释100～1000倍作为模板，利用t790m测序扩增引物或l858r测序扩增引物及测序扩增试剂进行扩增，扩增程序为95℃5min，95℃10s、60℃60s，循环30次，然后将扩增产物用测序通用引物cx-f和cx-r进行sanger测序。根据测序结果判断样本中是否含有t790m或l858r突变。
2、灵敏度和特异性
按照上述方法配制实施例3试剂盒相应的扩增体系，取相应反应数的反应管依次加入12.5μl的富集检测扩增试剂，2.5μl的相应的引物混合液，5μl的双蒸水，5μl的相应的模板。同时进行不同浓度标准品、阳性对照、阴性对照、外质控以及內质控的检测，为了保证实验结果的准确性每个样本同时做3次重复检测。将上述配制好的扩增体系置于实时荧光pcr仪中进行富集扩增检测。
富集扩增程序如下:
95℃5min；
95℃5s、56℃10s、68℃30s，循环15次；
95℃5s、60℃5s、68℃30s(采集荧光)，循环35次；
记录扩增后的ct值，然后进行数据分析，其检测结果如图4-6所示，图4为对照组检测结果，其中外质控ct均值为14.3，t790m阳性对照ct均值为18.8，l858r阳性对照ct均值为18.2，阴性对照均无扩增曲线，内质控ct均值为19.1＜22符合要求。
图5为t790m浓度标准品扩增曲线，其中纯突变型的样本检测ct均值为18.8，十分之一的样本检测ct均值为22.4，δct(十分之一-ic)＝3.3；百分之一的样本检测ct均值为25.2，δct(百分之一-ic)＝6.1；千分之一的样本检测ct均值为28.8，δct(千分之一-ic)＝9.7，万分之一的样本检测ct均值为31.2，δct(万分之一-ic)＝12.1；纯野生型的样本无扩增曲线，结果为阴性。
图6为l858r浓度标准品扩增曲线，其中纯突变型的样本检测ct均值为18.2，十分之一的样本检测ct均值为21.6，δct(十分之一-ic)＝2.5；百分之一的样本检测ct均值为24.8，δct(百分之一-ic)＝5.7；千分之一的样本检测ct均值为27.9，δct(千分之一-ic)＝8.8，万分之一的样本检测ct均值为31.1，δct(万分之一-ic)＝12；纯野生型的样本无扩增曲线，结果为阴性。
由于万分之一检测δct＝12或12.1＞10，所以将万分之一的6例样本的扩增产物稀释1000倍，然后用相应测序扩增引物混合液及测序扩增试剂进行扩增，将扩增产物进行sanger测序，结果如图7所示，可以看出样本中确实存在t790m或l858r突变，且经过本发明的检测方法扩增后得到了富集，达到了sanger测序的检测范围。由此可以看出本发明既能进行低丰度突变的检测，又能对低丰度模板进行富集。由纯野生型检测结果可以看出本发明的富集检测引物特异性好，可在较高的野生型浓度下检测出较低的突变型。由此可以得出结论，本发明的富集检测引物检测灵敏度高，特异性好，检测时间短，成本低。
3、临床检测
采集25例肺癌患者的血浆样本，其中已确定9例为egfr基因t790m突变，10例为egfr基因l858r突变，其余6例为其他突变或病因未明，此25例肺癌患者血浆样本均采自深圳市第三人民医院。将采集的样本采用qiagen核酸提取试剂盒进行核酸提取。然后按照本发明的方法进行检测，并与之前的检测结果进行对比，其结果如下表5所示。
表5
由该表可以看出，采用本发明的检测技术，其中，9例t790m阳性样本中其δct均小于13.8，检测结果为阳性，与医院检测结果阳性符合率为100％；10例l858r阳性样本中δct均小于13.2，检测结果为阳性，与医院检测结果阳性符合率为100％。在6例其他突变或未知突变的样本中，检测出1例l858r突变，其δct＝12.8＜13.2，可判定为l858r阳性，将4例t790m检测δct>10样本，2例l858r检测δct>10的样本，以及1例阴性样本中l858r检测δct>10样本的扩增产物稀释1000倍作为模板，利用本试剂盒提供的测序引物进行扩增，将扩增产物送测序公司进行测序，测序结果表明均含有相应的突变。说明本发明具有较高的灵敏度，可检测出样本中低丰度的核酸突变。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
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