本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种基于银纳米簇荧光探针的t4多聚核苷酸激酶活性检测方法。
背景技术
dna磷酸化在细胞代谢过程中起着重要作用，例如核酸代谢和dna损伤修复等。t4多聚核苷酸激酶(t4polynucleotidekinase)最初是从感染了t4噬菌体的大肠杆菌中分离得到的，该酶可将atp中v位上的磷酸基转移到具有5'一羟基的dna或rna分子上，常简称为t4激酶。t4多聚核苷酸激酶(t4pnk)是一种dna修复酶，可催化atp或其他三磷酸核苷酸基团转移至单链dna、双链dna或rna的5’-oh末端。t4多聚核苷酸激酶广泛用于dna和rna的5'末端标记，标记时以[y-"p]atp作为底物，采用转移反应可获得高水平的末端标记，但反应前必须除去5'端未标记的磷酸基，5'端标记的dna和rna可用于核酸的定序分析、部分酶切法绘制限制酶图谱、dna或rna的指纹分析、经dnase或甲基化保护的dna足迹分析(dna-footprinting)及分子杂交研究等，用于dna或rna连接酶作用底物的dna或rna分子也必须首先进行5'端磷酸化才可用于连接反应，限制酶人工接头(linker)与dna分子连接前也必须用此激酶磷酸化。
已经有研究证实t4pnk活性异常可导致核酸中磷酸化水平的紊乱，其与多种疾病有关，包括布鲁姆综合征、沃纳综合征和先天性皮肤异色综合症等。因此，开发简便灵敏的检测t4pnk活性的方法至关重要。
t4pnk传统的检测方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)和放射性同位素标记技术。然而，这些方法往往是低灵敏度，耗时长且具有放射性，最近出现很多关于检测t4pnk活性的新方法，例如荧光法，比色法和电化学法，其中，基于纳米粒子的荧光方法具有合成性好、光稳定性好和毒性低的特点。
如中国专利cn201510336445.1公开了一种基于荧光铜纳米颗粒免标检测t4多聚核苷酸激酶/磷酸酶及其抑制剂的新方法，它是通过以下步骤实现的：设计3′端磷酸化修饰的发夹探针，5′端为富含t碱基的序列；将上述探针用tris-hcl缓冲溶液稀释，并把一定量t4pnkp、klenowfragment、dntps与之混合并反应；将上述反应液稀释为mops缓冲体系，并加入硫酸铜、抗坏血酸钠，室温下反应；最终所得反应液用荧光仪检测其荧光强度，得到体系荧光强度与t4pnkp浓度之间的对应关系，该发明方法操作简单、灵敏度高并且选择性好，能够定量检测并筛选t4pnkp及其抑制剂。
纳米簇：当贵金属纳米颗粒的尺寸逐渐缩小到与费米波长相当时，会呈现出与半导体类似的特征，产生能级分离，并在一定波长光激下发射荧光。相比传统的有机荧光染料及半导体量子点等荧光纳米材料，贵金属纳米簇具有不易光漂白、生物相容性较好、发光波长随团簇尺寸可调等很多优点，并且合成条件温和。正是由于这些优异的光电特性和生物相容性使得贵金属纳米簇已成为纳米材料研究领域的热点之一。
银纳米簇模板化的dna(dna-agncs)具有优异的光谱特性而且dna-agncs的荧光发射光谱可根据dna模板的结构和特性从可见光到近红外线(ir)范围调节，目前dna-agncs已经开始应用于细胞成像、化学检测和生物检测等。
如中国专利cn201710062737.x公开了一种基于dna-银纳米簇分子信标与核酸外切酶iii循环信号放大的转录因子检测方法，该发明将dna-银纳米簇分子信标这种新型纳米材料作为荧光探针应用于转录因子的检测，该发明中转录因子的检测方法具有免标记，选择性高，低成本和灵敏度高的优点，能够实现生物样品中转录因子的高通量检测。
但目前还未见有科研人员能成功地将银纳米簇应用于t4多聚核苷酸激酶的活性检测。本发明基于银纳米簇在生物检测中的广泛应用及其在修饰寡核苷酸上的简单操作，创造性的设计了一个无标记的、“turn-off”型荧光探针，用以检测t4pnk的活性，应用本发明可显著提高t4pnk活性检测的灵敏度，另外，本发明还可用于检测抑制剂对t4pnk活性的抑制作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简单、耗时较短并且灵敏度高的基于银纳米簇荧光探针的t4多聚核苷酸激酶活性的检测方法，并且本发明还可用于检测抑制剂对t4pnk活性的抑制作用。
为实现上述目的，本发明首次制备了无标记的、“turn-off”型荧光探针来检测t4pnk的活性：银纳米簇模板化的dna链为strand-1(dnas1)，含有[3′-g4(tg4)2tg3]序列的dna链为strand-2(dnas2)，将两条链杂交，在富含g序列的作用下，银纳米簇可产生强烈的红色荧光，t4pnk能使双链dna的5-羟基末端磷酸化，从而产生5-磷酸基末端，其可迅速被λ核酸外切酶识别并降解，即，dnas1和dnas2被分开，由于两条链分离时没有富含g序列的作用，荧光信号迅速减弱，产生与t4pnk浓度成反比的信号。因此，应用本发明可精确检测t4pnk活性，根据dna-agncs荧光信号强度，该方法的检测灵敏度可达到0.01u/ml。
本发明所采用的具体技术方案为：
一方面，本发明提供了一种t4多聚核苷酸激酶活性的检测方法，具体步骤包括：
(1)制备两种dna链：银纳米簇模板化的dnas1，含有[3′-g4(tg4)2tg3]序列的dnas2，并将dnas2溶解在te缓冲液中。
(2)将步骤(1)制得的银纳米簇模板化的dnas1与溶解在te缓冲液中的dnas2混合于dna杂交缓冲液中，使两种dna链杂交得杂交dna，然后将上述杂交dna加入tris-hcl缓冲液，室温下反应，得最终反应液；
(3)将步骤(2)制得的最终反应液用荧光仪检测其荧光强度，即可实现对t4pnk的活性检测。
进一步的，步骤(1)中所述的两种dna链中的dnas2和银纳米簇模板化之前的dnas1分别为：
dnas1:5′-cccttaatcccctataataaattttaaatattatttattaat-3′,
dnas2:5′-attaataaataatatttaaaatttattatagggtggggtggggtgggg-3′。
进一步的，步骤(1)中所述的银纳米簇模板化的dnas1的制备方法为：在ph7的磷酸盐缓冲液中加入dnas1，90℃加热5min后冷却至室温，在溶液中加入agno3，其中ag+和dna的摩尔比为6.67:1，室温孵育30min，形成dna-ag+复合物，将制备好的dna-ag+复合物用nabh4处理，其中nabh4和ag的摩尔比为1:1，然后避光保存12小时后，即可制得银纳米簇模板化的dnas1(dna-agncs)。
进一步的，步骤(2)中所述的te缓冲液包含10mmtris–hcl和1mmedta,ph8.0。
进一步的，步骤(2)中所述的杂交缓冲液包含10mmtris-hcl，1.0mmedta和1.0m氯化钠，ph7.4。
进一步的，步骤(2)中所述的tris-hcl缓冲液包含10mmmgcl2,5mmdtt,0.5mmatp,10unitsλexo,和t4pnk。
进一步的，步骤(3)中所述的tris-hcl缓冲液中的t4pnk浓度可设置为0、0.01、0.1、0.5、1、5、10或12.5u/ml。
另一方面，本发明还提供了一种检测抑制剂对t4pnk活性的抑制作用，具体包括以下步骤：
(1)在反应缓冲液中加入t4pnk抑制剂，例如分别加入不同浓度的na2hpo4；
(2)检测过程与t4pnk的活性检测过程相同。
再一方面，本发明还提供了一种可以用于t4pnk抑制剂的筛查方法。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明可以达到较宽的检测范围(0.01-12.5u/ml)和较低的检测限(0.01u/ml)。
(2)本发明操作简单，不需要复杂的反应组件的修饰和处理，同时本发明可用于t4pnk抑制剂的筛查，具有显著地临床应用价值。
附图说明
图1为本发明的原理图。
图2为实施例3中的dna-agncs在t4pnk缺失和存在时荧光强度示意图。
图3为实验例1中的t4pnk催化磷酸化和λ核酸外切酶作用的时间对检测效果的影响示意图。
图4为实验例1中对λ核酸外切酶浓度进行优化的示意图。
图5为实验例1中随着atp浓度逐渐增加，荧光值逐渐降低的示意图。
图6-a为实验例2中随着t4pnk浓度的增加，荧光强度逐渐降低的示意图。
图6-b为实验例2中荧光强度与t4pnk的浓度呈现良好的线性关系的示意图。
图7为实验例3中检测方法的特异性的示意图。
图8为实验例4中随着na2hpo4浓度的增加，t4pnk的相对活性逐渐增加的示意图。
图9为实验例5中随着t4pnk的加入，荧光强度逐渐降低的示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但是本发明的保护范围并不仅局限于此。
实施例1dna序列的合成
该实施例由上海生工生物有限公司合成两种dna序列，其碱基序列分别为：
dnas1:5′-cccttaatcccctataataaattttaaatattatttattaat-3′,
dnas2:5′-attaataaataatatttaaaatttattatagggtggggtggggtgggg-3′；
实施例2制备银纳米簇模板化的dnas1
在ph7的磷酸盐缓冲液中加入10μm实施例1中的dnas1，然后90℃加热5min后冷却至室温，在溶液中加入agno3，其中ag+和dnas1的摩尔比为6.67:1，室温孵育30min，形成dna-ag+复合物，将制备好的dna-ag+复合物用nabh4处理，其中nabh4和ag+的摩尔比为1:1，之后避光保存12小时，即可制得银纳米簇模板化的dnas1(dna-agncs)溶液，此时浓度用“1×”表示。
实施例3t4pnk的活性检测
将6μm实施例1中的溶解在te缓冲液中的dnas2与实施例2中已制备好的浓度为1×的dna-agncs(dnas1)溶液混合于dna杂交液中，加热至95℃持续50s，然后缓慢冷却至室温并孵育20min，使两条dna链杂交得杂交dna，将上述杂交dna加入tris-hcl缓冲液中进行dna的磷酸化反应，得反应混合物，此反应混合物在37℃孵育30min后，加热至75℃，10min，灭活λexo活性，得到最终反应液。
其中所述的杂交缓冲液为10mmtris-hcl，1.0mmedta和1.0m氯化钠，ph7.4；
其中，所述的tris-hcl缓冲液为10mmmgcl2、5mmdtt、0.5mmatp、10unitsλexo和t4pnk。
该实施例中的t4pnk浓度梯度为0、0.01、0.1、0.5、1、5、10和12.5u/ml；
结果表明：dna-agncs在t4pnk缺失和存在时荧光强度如图2所示，在没有t4pnk的情况下，加入各反应成分，由于两条dna链杂交，在650nm处可检测到强荧光；然而，在t4pnk存在的情况下，双链dna的5-羟基末端磷酸化，从而产生的5-磷酸基末端可迅速被λ核酸外切酶识别并降解，因此，dnas1和dnas2被分开，可在650nm处检测到荧光强度的减弱。
即，本发明的基于dna-agncs的“turn-off”型荧光探针的方法可以简单、快速检测t4pnk的活性。
实验例1检测条件的优化
为了达到最佳的检测效果，本实验例对反应时间、λ核酸外切酶浓度和atp的浓度进行了优化。
首先，t4pnk催化磷酸化和λ核酸外切酶作用的时间对该方法的检测效果有着重要影响，如图3所示，在反应初始阶段，观察到信号快速下降，在接近30分钟时，荧光信号接近稳定状态，说明此时dnas1的5-羟基磷酸化和λ核酸外切酶的降解达到了动态平衡，因此，本发明的最佳反应时间为30分钟。
此外，该实验例对λ核酸外切酶浓度也进行了优化。如图4所示，当λ核酸外切酶浓度达到10u/ml时，可将全部磷酸化的dsdna降解，因此，本发明选择10u/ml作为λ核酸外切酶的最佳浓度。
最后，atp作为磷酰基的主要供体是磷酸化反应中的关键试剂，因此atp的浓度对t4pnk活性有着重要影响。如图5所示，随着atp浓度逐渐增加，荧光值逐渐降低，在atp浓度达到0.5mm时，荧光值不再发生变化，表明逐渐增加的atp浓度不会进一步促进磷酸化反应，因此，本发明选择0.5mm作为atp的最佳浓度。
实验例2优化后的t4pnk的活性检测
在实验例1发现的最优化的条件下，该实验例对t4pnk的活性进行了检测，如图6-a所示，随着t4pnk浓度的增加，荧光强度逐渐降低。如图6-b所示，在0.01-12.5u/ml的范围内，荧光强度与t4pnk的浓度呈现良好的线性关系(r2＝0.997)，检测限可达0.01u/ml(s/n＝3)，并且本实验的检测方法操作更简单，不需要对反应组件进行复杂的修改和处理。
实验例3检测方法的特异性
为评价本发明对t4pnk检测的特异性，该实验例将t4pnk与其他两种蛋白(bsa和pka)的检测效果做了比较。
需要说明的是，该实验例采用了实施例1合成的dnas2、实施例2制得的银纳米簇模板化的dnas1和实施例3中的t4活性检测方法；
结果如图7所示，当t4pnk存在的情况下荧光强度迅速减弱，而另两种蛋白存在时只检测到荧光强度轻微的变化。说明t4pnk对dna的磷酸化可导致荧光减弱，结果表明本发明构建的方法具有良好的特异性。
实验例4抑制剂的检测和筛选
该实验例研究了不同浓度的抑制剂(na2hpo4)对t4pnk磷酸化反应的影响，在t4pnk浓度不变的情况下(0.01u/ml)，随着na2hpo4浓度的增加，t4pnk的相对活性逐渐增加(结果如附图8所示)，说明t4pnk活性被抑制。
t4pnk的相对活性是通过(f抑制剂)-f0)与(f-f0)的比值来计算的，其中f抑制剂是指存在抑制剂的情况的下的荧光值，f是指不存在抑制剂的情况下的荧光值，f0是指dnas1/dnas2/t4pnk混合物的荧光强度，na2hpo4的ic50值为16mm，这与目前已公开的报道一致，表明本发明的方法可以用于t4pnk抑制剂的筛选，并且筛选效果显著。
实验例5复杂样品中t4pnk的检测
该实验例通过在复杂生物样品中检测t4pnk的活性来验证本发明是否可以在实际中应用。
如附图9所示，在稀释的细胞提取物中，随着t4pnk的加入，荧光强度逐渐降低，上述结果表明，本发明可用于检测复杂混合物中的t4pnk的活性，可见本发明在实际样品分析中具有潜在的应用前景。
综上，本发明通过构建一种新型的、无标记的、“turn-off”型的荧光检测系统用以检测t4pnk的活性。具体利用银纳米簇模板化的dna(dna-agncs)作为检测探针，通过富含鸟嘌呤的dna链与dna-agncs的分离实现对t4pnk的检测，通过dna-agncs的制备和λ核酸外切酶的降解反应，该方法可以达到较宽的检测范围(0.01-12.5u/ml)和较低的检测限(0.01u/ml)，重要的是，该方法操作简单，不需要复杂的反应组件的修饰和处理，同时结果表明该方法可以用于t4pnk抑制剂的筛查，具有显著的临床应用价值。