本发明涉及细胞分裂素ortho-topolinriboside(otr)、kinetinriboside(kr)、n6-benzyladenosine(bar)、n6-isopentenyladenosine(ipr)作为一类去促分化试剂对人m2型急性髓系白血病细胞株的抗肿瘤作用，属于生物化学与分子生物学技术领域。
背景技术：
目前越来越多的研究发现，细胞分裂素不仅调节植物的生长发育同时对动物细胞的增殖和生长也具有重要作用。研究发现细胞分裂素的一些核苷形式ortho-topolinriboside(otr)、kinetinriboside(kr)、n6-benzyladenosine(bar)、n6-isopentenyladenosine(ipr)在体外对癌细胞具有很强的毒性和促凋亡作用。当用这些细胞分裂素处理癌细胞后导致细胞周期不同程度的受阻和(或者)凋亡，这主要取决于不同的细胞系对不同的细胞分裂素的敏感度。尽管天然的ck和它们的类似物对动物细胞的作用已经被多次报道，但是目前还没有一个系统的对细胞分裂素的一些核苷形式的促分化作用进行研究。
急性髓细胞样白血病(aml)是一种发展为骨髓细胞的克隆性血液系统恶性疾病，其特征在于正常造血细胞分化中不受控制的增殖和阻断，全反式维甲酸(atra)可以通过诱导分化来治愈独特的aml亚型---急性早幼粒细胞白血病(apl)。然而，atra介导的分化疗法不适用于其他类型的aml并且atra诱导疗法尚存在疗效不稳定、部分患者易复发等问题。因此，aml治疗迫切需要能够克服分化停滞的新型毒性较低的治疗剂。
技术实现要素：
本发明针对上述现有技术，本发明提供了ortho-topolinriboside(otr)、kinetinriboside(kr)、n6-benzyladenosine(bar)、n6-isopentenyladenosine(ipr)在人m2型白血病细胞株hl-60中促分化的应用。
本发明的技术方案：
一类促分化试剂在人m2型急性白血病细胞中的应用，步骤如下：
(1)细胞培养：将人m2型急性白血病细胞株hl-60悬浮于含有灭活胎牛血清的无菌的dmed培养液中，置于浓度为5％co2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中培养，细胞长至培养瓶底面积的70％～80％传代1次；
(2)药物配制：otr、kr、bar、ipr均用0.1％dmso溶解，继续用无菌dmem培养基将溶解好的otr、kr、bar、ipr均稀释至浓度为0.1μm-30μm，过滤除菌，室温保存；
(3)处理细胞：将步骤(1)处于对数生长期的5×104～1×105个细胞接种于每孔含有1mldmem培养液的24孔板中，设置5组实验，第1组：空白对照组；第2组：10μmotr组；第3组：10μmkr；第4组：10μmbar；第5组：10μmipr组；向各组中加入对应的药物，置于浓度为5％co2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育36小时，收集细胞；
(4)检查分化指标：收集(3)处理的细胞并用含0.2％fbs的pbs洗涤三次。将细胞与封闭抗体在室温下孵育15分钟，然后在4℃在黑暗中与抗人cd11b-pe抗体温育30分钟后洗涤细胞，并通过流式细胞术分析；
(5)检测细胞形态变化：收集(3)处理的细胞并用含0.2％fbs的pbs洗涤三次；将载玻片用甲醇固定，并用赖特-吉姆萨染色溶液染色20分钟，用蒸馏水漂洗，风干并使用显微镜观察。
本发明的有益效果：本发明的数据建立在细胞分裂素的一些核苷形式otr、kr、bar、ipr对人的9大瘤系60种肿瘤细胞系具有非常显著的体外增殖抑制活性，其中对白血病细胞株的药物敏感性最强的基础之上。
附图说明
图1为正常hl-60细胞中cd11b表达的影响。
图2为otr对hl-60细胞中cd11b表达的影响。
图3为kr对hl-60细胞中cd11b表达的影响。
图4为bar对hl-60细胞中cd11b表达的影响。
图5为ipr对hl-60细胞中cd11b表达的影响。
具体实施方式
以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。
本发明使用的细胞、试剂盒以及试剂：人白血病hl-60细胞株，胎牛血清、双抗(青霉素/链霉素)，dmem培养基，cd11b抗体，wright-giemsa染液，otr，kr，bar，ipr。
实施例1
otr、kr、bar、ipr对hl-60细胞中cd11b表达的影响：将复苏的人m2型白血病细胞hl-60培养于含有10％fbs灭活胎牛血清、1％青霉素/1％链霉素(双抗)的无菌dmem培养液中，置于悬浮细胞瓶中，在37℃、5％co2及饱和湿度下的培养箱中培养，细胞长至70％-80％左右传代1次。继续培养得到生长状态活跃的人白血病细胞，收集细胞。将处于对数生长期的5×104个细胞接种于每孔含有1mldmem培养液的24孔板中，按照实验需求，在各组分别加入对应浓度的otr、kr、bar、ipr，放入培养箱中孵育36小时后收集并用含0.2％fbs的pbs洗涤三次。将细胞与封闭抗体在室温下孵育15分钟，然后在4℃在黑暗中与抗人cd11b-pe抗体温育30分钟后洗涤细胞，并通过流式细胞术分析。结果如图1所示。图1可见，otr、kr、bar、ipr使hl-60细胞中cd11b的表达从3.68％上调至33.88％。这表明otr、kr、bar、ipr诱导了hl-60细胞向成熟粒细胞的分化。
实施例2
otr、kr、bar、ipr诱导hl-60细胞形态变化：将生长状态活跃的hl-60细胞用10μm的otr、kr、bar、ipr处理36h后，收集细胞并用含0.2％fbs的pbs洗涤三次。将载玻片用甲醇固定，并用赖特-吉姆萨染色溶液染色20分钟，用蒸馏水漂洗，风干并使用显微镜观察。结果如图2所示，图2可见，未处理的hl-60细胞作为高度恶性的细胞，圆形，大而圆的细胞核和稀疏的细胞质。用otr、kr、bar、ipr处理降低了细胞核的细胞质比率并改变了细胞核的马蹄形态。通过使用wrightgiemsa染色的形态学分析进一步证实了otr、kr、bar、ipr对诱导分化的作用。