本发明涉及分子生物学
技术领域：
：，具体为一种含有C-Myc蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法。
背景技术：
：：C-Myc标签蛋白，是一个含10个氨基酸的小标签，标签序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，这10个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。C-Myc融合蛋白标签已成功应用在Western-blot杂交、免疫沉淀和染色质免疫沉淀等分析蛋白表达、蛋白相互作用和蛋白的调控靶基因等研究中。而C-Myc等小的蛋白融合标签，不会或很少会对融合的蛋白功能产生干扰。而要将C-Myc融合蛋白标签规模化、产业化推广，势必要提供一种带有常用的融合蛋白标签的植物表达质粒载体。pCAMBIA的一系列载体被全球许多植物分子生物学实验室广泛使用。随着基因功能和蛋白功能研究的兴起，重组蛋白表达技术现已经广泛应用于生物学各个具体领域，特别是蛋白的体内功能研究和蛋白质的大规模生产都需要应用重组蛋白表达载体。pCAMBIA的系列载体要么不含有蛋白融合标签，必须要制备研究的蛋白自身的特异性抗体，费时费力，不利于快速地研究蛋白功能；要么含有较大的蛋白融合标签(例如GFP和GUS等)，而这些大的蛋白融合标签经常会对目标蛋白自身的功能发生干扰，因此也不利于准确地研究蛋白的功能。所以，本领域技术人员亟待要解决的技术问题是如何构建出含有C-Myc融合蛋白标签的pCAMBIA载体。技术实现要素：为了解决现有技术中pCAMBIA载体没有和C-Myc这种小的蛋白融合标签融合的问题，本发明提供了一种含有C-Myc蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法，实现的目的为，能够得到一种含有C-Myc蛋白这种小蛋白的融合标签的植物表达质粒载体，进而帮助使用者快速的研究蛋白功能，并且不会对目标蛋白自身的功能发生干扰，保证能够准确地研究蛋白的功能。为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为，本发明公开的一种含有C-Myc蛋白融合标签的植物表达质粒载体，该载体为在植物表达质粒载体的C端含有C-Myc蛋白融合标签的植物表达质粒载体。具体地，该载体包含有三段编码C-Myc蛋白标签Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu的基因片段，所述三个C-Myc蛋白的核苷酸序列分别如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3所示。具体地，该载体的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。优选的，本发明还公开了构建上述所述质粒载体的方法，包括如下步骤：(1)以pCAMBIA1302为出发质粒，采用SpeI和Eco065I酶切该质粒，通过凝胶电泳切胶回收9802bp的片段；(2)合成包含编码3个C-Myc蛋白的核苷酸序列，序列信息如SEQIDNo.5所示；(3)设计用于扩增包含编码3个C-Myc蛋白的核苷酸序列基因片段的扩增引物，上游引物如SEQIDNo.6所示，下游引物如SEQIDNo.7所示；采用NewEnglandBiolabs的PhusionHigh-FidelityDNAPolymerase进行扩增反应，扩增体系：50微升的总体积，包括10微升的5XPhusionHFBuffer、1微升的10mMdNTPs、2.5微升的10微摩尔上游引物、2.5微升的10微摩尔下游引物、1微升的上述合成的包含编码3个C-Myc蛋白的核苷酸序列基因片段(浓度为50纳克/微升)、32.5微升的超纯水(由Milli-QReferenceWaterPurificationSystem制备)和0.5微升的PhusionHigh-FidelityDNAPolymerase。扩增程序：98℃运行30秒；然后30个循环的(98℃运行10秒；60℃运行30秒；72℃运行10秒)；最后72℃运行10分钟。(4)最终在全序列合成的基因片段的N端加上SpeI酶切位点，在C端加上Eco065I酶切位点；用SpeI和Eco065I酶切该合成片段，凝胶电泳后切胶回收该片段；最后利用T4DNA连接酶连接上述酶切后回收纯化的片段；将连接反应的产物，热激转化DH5α，通过PCR鉴定得到阳性克隆；质粒载体的序列通过测序验证。本发明采用上述技术方案具有以下有益效果，相较于现有技术中pCAMBIA载体与大的蛋白融合标签融合，经常会对目标蛋白自身的功能发生干扰，不能够准确地研究蛋白的功能，本发明提供的这种C-Myc蛋白融合标签不影响蛋白功能，进而有效保证研究蛋白功能的准确性；现有技术中无小的蛋白标签pCAMBIA载体时，要想研究蛋白功能，必须要制备研究的蛋白自身的特异性抗体，但是这种方法费时费力，不利于快速地研究蛋白功能，而本发明构建这种C-Myc标签质粒载体周期时间短，成本低廉，在保证了时间性的同时又能够节约成本，非常适宜产业化推广。附图说明图1为本发明实施例一中含有C-Myc蛋白融合标签的植物表达质粒载体的遗传图谱。图2为本发明实施例一中A基因融合C-Myc蛋白标签不影响A基因对不可溶单宁生物合成的调控作用，图中，Non-extractablePAs是不可溶单宁，纵坐标为单宁的相对含量relativelevelofPAs，Col为野生型，a-1和a-2为A基因的突变体，A、B、C、D和E不同的字母表示是否有显著差异。具体实施方式实施例一：本发明公开的一种含有C-Myc蛋白融合标签的植物表达质粒载体，该载体为在植物表达质粒载体的C端含有C-Myc蛋白融合标签的植物表达质粒载体。具体地，该载体包含有三段编码C-Myc蛋白标签Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu的基因片段，所述三个C-Myc蛋白的核苷酸序列分别如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3所示。SEQIDNo.1和SEQIDNo.2之间的连接序列为SEQIDNo.10，SEQIDNo.2和SEQIDNo.3之间的连接序列为SEQIDNo.11。当然，作为本领域技术人员公知的常识，该载体还包括有转录启动子、转录终止子、卡那霉素编码序列和复制子片段，该载体的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。本发明的载体，其遗传图谱如图1所示。相较于现有技术中pCAMBIA载体与大的蛋白融合标签融合，经常会对目标蛋白自身的功能发生干扰，不能够准确地研究蛋白的功能，本发明提供的这种C-Myc蛋白融合标签不影响蛋白功能，进而有效保证研究蛋白功能的准确性，以下通过列举试验例用以说明：利用本发明的质粒载体，可以通过NcoI、BgllI和SpeI将目的基因的基因片段引入载体中，确保目的基因的核苷酸序列与C端的3个串联重复的编码C-Myc蛋白的核苷酸序列在同一读码框。我们实验室发现拟南芥A基因的两个突变体a-1和a-2中不可溶单宁的含量显著增加，过量表达A基因的3个转基因株系AOE1、AOE2和AOE3中不可溶单宁含量大幅度降低。随后，我们将A基因的全长CDS通过引物SEQIDNo.8、SEQIDNo.9PCR扩增，然后利用NcoI和SpeI酶切，连接引入本发明的质粒载体中，将最终质粒载体导入农杆菌GV3101，通过花侵染法转入拟南芥中。两个转基因株系AC-MycOE1和AC-MycOE2中不可溶单宁的含量也大幅降低，与过量表达自身蛋白的株系中不可溶单宁含量没有显著差异。这些说明C-Myc蛋白标签融合A基因后并不影响蛋白在植物体内的生物学功能。而当A基因融合到pCAMBIA1302的比较大的标签GFP后，转基因株系的不可溶单宁含量虽然与野生型相比也显著降低，但仍然显著地高于未融合标签或者融合C-Myc蛋白标签的转基因株系中不可溶单宁的含量。该试验效果如图2所示，Non-extractablePAs是不可溶单宁。纵坐标为单宁的相对含量“relativelevelofPAs”。Col为野生型，a-1和a-2为A基因的突变体。Col野生型的不可溶单宁含量作为1。A、B、C、D和E不同的字母表示是否有显著差异。不同的字母之间至少达到统计学p＜0.05水平上的显著差异。比如5个转基因株系AOE1、AOE2、AOE3、AC-MycOE1和AC-MycOE2的不可溶单宁的相对含量都是A，说明它们之间是没有显著差异的。而AGFPOE柱子上是B，说明它的不可溶单宁的相对含量是显著地高于前面5个转基因的，但它们仍然要显著地低于野生型，因为野生型柱子上面的是C。在这里需要说明的是，为了确保试验结果的稳定性，这样的试验平行重复多次，在这里只不过列举了其中一个试验用以给出示例而已。构建上述载体的方法可采用任何一种现有技术方法。另外，本实施例中无特殊说明的操作手法均为现有技术，故不在此过多解释。实施例二：本发明提供的一种含有C-Myc蛋白融合标签的植物表达质粒载体，该载体为在植物表达质粒载体的C端含有C-Myc蛋白融合标签的植物表达质粒载体。具体地，该载体包含有三段编码C-Myc蛋白标签Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu的基因片段，所述三个C-Myc蛋白的核苷酸序列分别如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3所示。该载体还包括有转录启动子、转录终止子、卡那霉素编码序列和复制子片段，该载体的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。优选的，构建所述质粒载体的方法包括如下步骤：(1)以pCAMBIA1302为出发质粒，采用SpeI和Eco065I酶切该质粒，通过凝胶电泳切胶回收9802bp的片段；(2)合成包含编码3个C-Myc蛋白的核苷酸序列，序列信息如SEQIDNo.5所示；(3)设计用于扩增包含编码3个C-Myc蛋白的核苷酸序列基因片段的扩增引物，上游引物如SEQIDNo.6所示，下游引物如SEQIDNo.7所示；采用NewEnglandBiolabs的PhusionHigh-FidelityDNAPolymerase进行扩增反应，扩增体系：50微升的总体积，包括10微升的5XPhusionHFBuffer、1微升的10mMdNTPs、2.5微升的10微摩尔上游引物、2.5微升的10微摩尔下游引物、1微升的上述合成的包含编码3个C-Myc蛋白的核苷酸序列基因片段(浓度为50纳克/微升)、32.5微升的超纯水(由Milli-QReferenceWaterPurificationSystem制备)和0.5微升的PhusionHigh-FidelityDNAPolymerase。扩增程序：98℃运行30秒；然后30个循环的(98℃运行10秒；60℃运行30秒；72℃运行10秒)；最后72℃运行10分钟。(4)最终在全序列合成的基因片段的N端加上SpeI酶切位点，在C端加上Eco065I酶切位点；用SpeI和Eco065I酶切该合成片段，凝胶电泳后切胶回收该片段；最后利用T4DNA连接酶连接上述酶切后回收纯化的片段；将连接反应的产物，热激转化DH5α，通过PCR鉴定得到阳性克隆；质粒载体的序列通过测序验证。现有技术中无小的蛋白标签pCAMBIA载体时，要想研究蛋白功能，必须要制备研究的蛋白自身的特异性抗体，但是这种方法费时费力，不利于快速地研究蛋白功能，而本发明构建这种C-Myc标签质粒载体周期时间短，成本低廉，在保证了时间性的同时又能够节约成本，以下表格内容是根据某公司的服务报价和实验周期安排，制备蛋白自身的单克隆抗体需要花费超过4万元，需要耗费37周时间。而采用C-Myc标签抗体只需花费不到1万元，10周以内的时间。本实施例中无特殊说明的操作手法均为现有技术，故不在此过多解释。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所<120>一种含有C-Myc蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法<160>11<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>30<212>DNA<213>第一段编码C-Myc蛋白标签的基因片段(2AmbystomalateralexAmbystomajeffersonianum)<400>1gaacaaaagctaatctccgaggaagacttg30<210>2<211>30<212>DNA<213>第二段编码C-Myc蛋白标签的基因片段(2AmbystomalateralexAmbystomajeffersonianum)<400>2gaacaaaaattaatctcagaagaagacttg30<210>3<211>30<212>DNA<213>第三段编码C-Myc蛋白标签的基因片段(2AmbystomalateralexAmbystomajeffersonianum)<400>3gaacaaaaattaatctcagaagaagacttg30<210>4<211>9952<212>DNA<213>本发明含有C-Myc蛋白融合标签的植物表达质粒载体的碱基序列(2AmbystomalateralexAmbystomajeffersonianum)<400>4catggtagatctgactagtgttgatgggttcggtgaacaaaagctaatctccgaggaaga60cttgaacggtgaacaaaaattaatctcagaagaagacttgaacggtgaacaaaaattaat120ctcagaagaagacttgaacggaaagctagtctaggtgtgaattggtgaccagctcgaatt180tccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtc240ttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgt300aatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacattt360aatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgt420catctatgttactagatcgggaattaaactatcagtgtttgacaggatatattggcgggt480aaacctaagagaaaagagcgtttattagaataacggatatttaaaagggcgtgaaaaggt540ttatccgttcgtccatttgtatgtgcatgccaaccacagggttcccctcgggatcaaagt600actttgatccaacccctccgctgctatagtgcagtcggcttctgacgttcagtgcagccg660tcttctgaaaacgacatgtcgcacaagtcctaagttacgcgacaggctgccgccctgccc720ttttcctggcgttttcttgtcgcgtgttttagtcgcataaagtagaatacttgcgactag780aaccggagacattacgccatgaacaagagcgccgccgctggcctgctgggctatgcccgc840gtcagcaccgacgaccaggacttgaccaaccaacgggccgaactgcacgcggccggctgc900accaagctgttttccgagaagatcaccggcaccaggcgcgaccgcccggagctggccagg960atgcttgaccacctacgccctggcgacgttgtgacagtgaccaggctagaccgcctggcc1020cgcagcacccgcgacctactggacattgccgagcgcatccaggaggccggcgcgggcctg1080cgtagcctggcagagccgtgggccgacaccaccacgccggccggccgcatggtgttgacc1140gtgttcgccggcattgccgagttcgagcgttccctaatcatcgaccgcacccggagcggg1200cgcgaggccgccaaggcccgaggcgtgaagtttggcccccgccctaccctcaccccggca1260cagatcgcgcacgcccgcgagctgatcgaccaggaaggccgcaccgtgaaagaggcggct1320gcactgcttggcgtgcatcgctcgaccctgtaccgcgcacttgagcgcagcgaggaagtg1380acgcccaccgaggccaggcggcgcggtgccttccgtgaggacgcattgaccgaggccgac1440gccctggcggccgccgagaatgaacgccaagaggaacaagcatgaaaccgcaccaggacg1500gccaggacgaaccgtttttcattaccgaagagatcgaggcggagatgatcgcggccgggt1560acgtgttcgagccgcccgcgcacgtctcaaccgtgcggctgcatgaaatcctggccggtt1620tgtctgatgccaagctggcggcctggccggccagcttggccgctgaagaaaccgagcgcc1680gccgtctaaaaaggtgatgtgtatttgagtaaaacagcttgcgtcatgcggtcgctgcgt1740atatgatgcgatgagtaaataaacaaatacgcaaggggaacgcatgaaggttatcgctgt1800acttaaccagaaaggcgggtcaggcaagacgaccatcgcaacccatctagcccgcgccct1860gcaactcgccggggccgatgttctgttagtcgattccgatccccagggcagtgcccgcga1920ttgggcggccgtgcgggaagatcaaccgctaaccgttgtcggcatcgaccgcccgacgat1980tgaccgcgacgtgaaggccatcggccggcgcgacttcgtagtgatcgacggagcgcccca2040ggcggcggacttggctgtgtccgcgatcaaggcagccgacttcgtgctgattccggtgca2100gccaagcccttacgacatatgggccaccgccgacctggtggagctggttaagcagcgcat2160tgaggtcacggatggaaggctacaagcggcctttgtcgtgtcgcgggcgatcaaaggcac2220gcgcatcggcggtgaggttgccgaggcgctggccgggtacgagctgcccattcttgagtc2280ccgtatcacgcagcgcgtgagctacccaggcactgccgccgccggcacaaccgttcttga2340atcagaacccgagggcgacgctgcccgcgaggtccaggcgctggccgctgaaattaaatc2400aaaactcatttgagttaatgaggtaaagagaaaatgagcaaaagcacaaacacgctaagt2460gccggccgtccgagcgcacgcagcagcaaggctgcaacgttggccagcctggcagacacg2520ccagccatgaagcgggtcaactttcagttgccggcggaggatcacaccaagctgaagatg2580tacgcggtacgccaaggcaagaccattaccgagctgctatctgaatacatcgcgcagcta2640ccagagtaaatgagcaaatgaataaatgagtagatgaattttagcggctaaaggaggcgg2700catggaaaatcaagaacaaccaggcaccgacgccgtggaatgccccatgtgtggaggaac2760gggcggttggccaggcgtaagcggctgggttgtctgccggccctgcaatggcactggaac2820ccccaagcccgaggaatcggcgtgacggtcgcaaaccatccggcccggtacaaatcggcg2880cggcgctgggtgatgacctggtggagaagttgaaggccgcgcaggccgcccagcggcaac2940gcatcgaggcagaagcacgccccggtgaatcgtggcaagcggccgctgatcgaatccgca3000aagaatcccggcaaccgccggcagccggtgcgccgtcgattaggaagccgcccaagggcg3060acgagcaaccagattttttcgttccgatgctctatgacgtgggcacccgcgatagtcgca3120gcatcatggacgtggccgttttccgtctgtcgaagcgtgaccgacgagctggcgaggtga3180tccgctacgagcttccagacgggcacgtagaggtttccgcagggccggccggcatggcca3240gtgtgtgggattacgacctggtactgatggcggtttcccatctaaccgaatccatgaacc3300gataccgggaagggaagggagacaagcccggccgcgtgttccgtccacacgttgcggacg3360tactcaagttctgccggcgagccgatggcggaaagcagaaagacgacctggtagaaacct3420gcattcggttaaacaccacgcacgttgccatgcagcgtacgaagaaggccaagaacggcc3480gcctggtgacggtatccgagggtgaagccttgattagccgctacaagatcgtaaagagcg3540aaaccgggcggccggagtacatcgagatcgagctagctgattggatgtaccgcgagatca3600cagaaggcaagaacccggacgtgctgacggttcaccccgattactttttgatcgatcccg3660gcatcggccgttttctctaccgcctggcacgccgcgccgcaggcaaggcagaagccagat3720ggttgttcaagacgatctacgaacgcagtggcagcgccggagagttcaagaagttctgtt3780tcaccgtgcgcaagctgatcgggtcaaatgacctgccggagtacgatttgaaggaggagg3840cggggcaggctggcccgatcctagtcatgcgctaccgcaacctgatcgagggcgaagcat3900ccgccggttcctaatgtacggagcagatgctagggcaaattgccctagcaggggaaaaag3960gtcgaaaaggtctctttcctgtggatagcacgtacattgggaacccaaagccgtacattg4020ggaaccggaacccgtacattgggaacccaaagccgtacattgggaaccggtcacacatgt4080aagtgactgatataaaagagaaaaaaggcgatttttccgcctaaaactctttaaaactta4140ttaaaactcttaaaacccgcctggcctgtgcataactgtctggccagcgcacagccgaag4200agctgcaaaaagcgcctacccttcggtcgctgcgctccctacgccccgccgcttcgcgtc4260ggcctatcgcggccgctggccgctcaaaaatggctggcctacggccaggcaatctac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