一种紫菜降压肽和紫菜降压肽提取物及应用的制作方法

本发明涉及生物活性肽技术领域，涉及一种紫菜胰蛋白酶酶解多肽的筛选鉴定和其在血管紧张素转化酶(ace)抑制剂，高血压治疗相关的药品、保健品等方面的应用。

背景技术

生物活性肽(bioactivitypeptides)又称为功能多肽(functionalpeptides)，是一类具有一定生理活性功能的多肽，其分子量通常在10kda以下，含有2-20个氨基酸。它具有多种生物功能，包括抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗疲劳、抗衰老、降血压，降血糖等生物活性。与蛋白质相比，其分子量小，低抗原性,可以被吸收。因此生物活性肽可以广泛的应用于食品、保健品、化妆品和药物的开发。

高血压是危害人类健康的一种常见疾病，也是引起心血管疾病的主要因素，其主要的危害是造成脑、心脏、肾脏等器官的损害。据世界卫生组织(who)报道，每年有超过1750万人死于心血管疾病,高血压已经变成了全球的主要死亡原因。目前我国已有的高血压患者已超过1.2亿人口，因此开发安全有效的降压药物是值得重视的研究方向。

血管紧张素转化酶(ace)是调控肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensinsystem,ras)和激肽-缓激肽系统(kallikreo-bradykininsystem,kks)的关键酶，高活性的血管紧张素转化酶(ace)或者过量的血管紧张素转化酶(ace)会造成血管的收缩，血压的升高，所以血管紧张素转化酶(ace)是重要的血压调节的靶点。

市场上的血管紧张素转化酶(ace)抑制剂类药物多具有一系列的副作用，这些药物被证明能显著的降低患者的依从性，从而增加额外的医疗费用,所以从天然的产物中开发低毒性，低抗原性，低副作用的天然降压肽十分有必要。

海洋生物的多样性和海洋环境的复杂性造就了海洋活性化合物的新颖性、生物活性多样性以及作用机制的独特性。从1960年开始，全世界大约有超过20000种的天然产物从海洋生物中获得，海洋天然产物越来越受到科学家的重视。

紫菜(porphyrahaitanensis)是一种广泛分布于海洋环境中的经济红藻，紫菜中富含多糖、蛋白质和其他活性组分,其中蛋白的含量能达到30％，这说明紫菜可以作为活性肽的重要来源。

目前已经有多种从海洋藻类中筛选出具有血管紧张素转化酶(ace)抑制作用的多肽，像石莼、小球藻、水浒苔等,但极少有从紫菜中分离得到ace抑制肽的报道。

技术实现要素：

本发明选择紫菜为原料，通过酶解，各种分离鉴定技术最终得到一种序列为thr-gly-ala-pro-cys-arg(tgapcr)的ace抑制肽。该降压肽可以采用化学合成法制备。

本发明的特定序列的紫菜ace抑制肽体外高效液相色谱法(hplc)显示良好的ace抑制活性，在自发性高血压大鼠(shrs)体内也显示出良好的降压效果。

本发明特定序列的紫菜ace抑制肽提取物的制备方法包括：将紫菜粉碎，加入体积为粉末质量20倍至40倍的水溶胀1h-4h；加入2％-5％的胰蛋白酶(ec3.4.23.4,≥250.n.f.u/mg)酶解2h-4h，酶解温度为35℃-45℃，酶解ph为7.2-8.7；过滤除去杂质，上清液用75％-85％的乙醇进行醇沉，离心或过滤除去沉淀，浓缩后冷冻或喷雾干燥；组分进一步在sephadexg-25(1.6cmx60cm)凝胶柱上分离，蒸馏水作为流动相，流速控制在0.8ml/min,自动收集器收集保留时间为35min-36min的多肽。

本发明的特定序列的紫菜ace抑制肽按照如下方法进一步鉴定，上述收集的组分使用mascot2.2将uplc-esi-q-exactivefocus-ms/ms质谱信息和紫菜转录组信息(srx1016678，下载至ncbi)进行比对，得到该多肽的序列。

本发明中的特定序列的紫菜ace抑制肽在血管紧张素抑制剂，高血压治疗相关的药品和保健品方面有广泛的应用。

附图说明

图1为紫菜降压肽tgapcr的质谱鉴定图。

图2多肽(0.5mg/ml)在不同温度处理下的ace抑制活性,图中值表示抑制率的平均值±标准偏差。

图3多肽(0.5mg/ml)在不同ph处理下的ace抑制活性,图中值表示抑制率的平均值±标准偏差。

图4多肽(0.1mg/ml和0.5mg/ml)在模拟胃肠液中处理之后的ace抑制活性。gc无胃蛋白酶的模拟胃液处理；g含胃蛋白酶的模拟胃液处理；g+ic无胃蛋白酶和胰酶的模拟胃肠液；g+i含有胃蛋白酶和胰酶的模拟胃肠液；图中值表示抑制率的平均值±标准偏差。

图5多肽抑制ace的双倒数作图(lineweaver-burkplots)，x轴为底物浓度的倒数，y轴为反应速率的倒数。

图6多肽对自发性高血压大鼠(shrs)收缩压的降低作用；灌胃剂量10mg/kg；图中值表示每个测量时间点shrs大鼠的收缩压的平均值±标准偏差。

图7多肽对自发性高血压大鼠(shrs)舒张压的降低作用；灌胃剂量10mg/kg；图中值表示每个测量时间点shrs大鼠的舒张压的平均值±标准偏差。

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明方案作进一步的具体说明：本发明的目的是以紫菜为原材料分离筛选出具有特定序列的、低毒的、活性好的ace抑制肽,该降压肽的序列为thr-gly-ala-pro-cys-arg(tgapcr)，该多肽为含有6个氨基酸残基的直链多肽，该多肽分离自紫菜的降压肽提取物，分子量为603.69da。该多肽在体外及shrs体内都显示出良好的降压活性。

实施例1：

(1)取紫菜粉末40g，加入1200ml的水室温下浸泡3h，加入800mg胰蛋白酶，酶解时需搅拌且温度控制在40℃，溶液ph调节至7.8，酶解3h之后,100℃10min灭酶。

(2)过滤除去杂质，上清液使用终体积浓度75％的乙醇进行沉淀，离心除去沉淀，上清液浓缩至20ml,冻干。

(3)醇沉得到的组分使用sephadexg-25进一步分离纯化，蒸馏水做流动相,流速控制在0.8ml/min,收集保留时间为35min-36min的组分，浓缩冻干。

(4)上述色谱纯化组分使用uplc-esi-q-exactivefocus-ms/ms进行鉴定，mascot2.2将质谱信息与紫菜转录组(srx1016678，下载至ncbi)比对，选择丰度前20且c端具有极性或较大基团残基的多肽进行合成，筛选20个多肽的ace抑制活性，得到序列tgapcr具有较好的ace抑制活性，经质谱鉴定该多肽的分子量为603.69da。

实施例2：

(1)取紫菜粉末40g，加入1600ml的水室温下浸泡2h，调节ph为8.0，温度为37℃，1200mg的胰蛋白酶加入其中，启动酶解反应，2h之后沸水10min终止反应。

(2)过滤除去杂质，使用终体积浓度80％的乙醇沉淀杂质，过滤除去杂质，浓缩至20ml冻干。

(3)上述组分使用sephadexg-25凝胶色谱分离纯化,流动相为蒸馏水，流速为0.8ml/min，收集保留时间为35min-36min的组分，浓缩冻干。

(4)使用uplc-esi-q-exactivefocus-ms/ms对收集的组分进行鉴定，mascot2.2将质谱信息与紫菜转录组(srx1016678，下载至ncbi)比对，选择丰度前20且c端具有极性或较大基团残基的多肽进行合成，筛选20个多肽的ace抑制活性，得到序列tgapcr具有较好的ace抑制活性。

实施例3：

上文对对多肽的序列进行了鉴定，下文中人工合成多肽tgapcr，纯度＞98％，下文中对tgapcr的理化性质及体内降压活性进行评估。

(一)高效液相色谱法(hplc)测定多肽体外ace抑制活性

本实施例所用的药品及仪器无特殊说明均可从商业获得。

高效液相色谱法(hplc)测定ace抑制活性的原理为:ace可以将底物马尿酰-组氨酰-亮氨酸(hip-his-leu，hhl，美国sigma公司)水解成为马尿酸,当添加酶的抑制剂时，马尿酸的生成量相应的减少，通过检测紫外波长228nm处马尿酸的吸收峰面积就可以测定抑制剂对ace的抑制率。

试剂：0.1u/ml的ace溶液(溶质为0.1m的硼酸缓冲液，ph8.3，含0.3m的nacl)；5mmol/l的hhl(溶质为0.1m的硼酸缓冲液，ph8.3，含0.3m的nacl)；

所需浓度的降压肽溶液(溶质为纯水)。

实验方法：20μl的多肽溶液和10μl的ace溶液混合，在37±0.5℃中的恒温水浴中预热5min，加入50μl的hhl充分混匀以启动反应，37℃水浴中孵育60min之后加入150μl的10mhcl终止反应，上述体系过0.22μm的滤膜，使用液相系统测定ace抑制率。

检测条件：hplc连接c18柱(4.6mmx150mmx5μm,agilent)，流动相a为含有0.05％三氟乙酸(tfa)的超纯水，流动相b为含有0.05％三氟乙酸(tfa)的乙腈，洗脱方式为梯度洗脱：10％-60％b(15min)；60％-10％b(5min)，波长228nm处检测马尿酸峰面积，ace抑制率的计算公式如下：

式中a空白为不添加抑制肽时马尿酸的峰面积，a抑制剂为添加抑制肽时马尿酸的峰面积；ic50:能抑制50％ace活性时抑制肽的浓度。

将多肽配制成为1、5、10、20、40、60、80μm的水溶液,按照上述实验方法测定tgapcr和tgap[c(o)]r的抑制率，每个浓度测定3次，取平均值，计算多肽的ic50值。

表1.不同浓度龙须菜降压肽的ace抑制率。

经测定紫菜ace抑制肽tgapcr的ic50值为23.94±0.82μm。

(三)多肽的理化性质评价

图1多肽的质谱图显示ace抑制肽tgapcr的分子量为603.69da。

(四)热稳定性和ph稳定性评价

多肽水溶液(0.5mg/ml)分别在0℃、20℃、40℃、60℃、80℃、100℃的温度下水浴处理2h，取处理完成之后的20μl的多肽溶液按上述方法测定其ace抑制活性，每个温度下测定3次。

多肽分别溶于ph为2、4、6、8、10、12的溶液中至5mg/ml，室温处理2h(ph2-6的多肽溶解液使用hcl配制，ph8-12的多肽溶解液使用naoh配制)，用1m的hcl和1m的naoh中和多肽溶液，中和的多肽溶液20μl按上述方法测定其ace抑制活性，每个ph下测定3次。

附图2和附图3显示紫菜ace抑制肽tgapcr能够在较宽的温度和ph范围内仍保湿稳定的ace抑制率(88％±3％)，该多肽具有温度和ph稳定性。

(五)模拟胃肠液降解稳定性评价

体外模拟胃肠液降解可以评价该多肽能否在进入血液时仍能够保持其完整性和活性。多肽使用0.1mkcl-hcl(ph2.0)溶液溶解使多肽最终浓度为0.1mg/ml和0.5mg/ml。每毫升上述多肽溶液加入胃蛋白酶(≥250u/mg)0.8mg，混匀，该溶液在37℃水浴中孵育4h，100℃灭酶10min，12000rpm离心5min，除去沉淀，上清液20μl来测定ace抑制活性；1m的naoh调节剩余溶液近中性，剩余的上清液添加胰酶(8xusp)，每毫升溶液加入10mg的胰酶，同样37℃水浴中孵育4h，100℃10min灭酶，离心处理，上清液20μl测定ace抑制活性；每次取样测定3次。

附图4显示紫菜ace抑制肽tgapcr(0.1mg/ml和0.5mg/ml)在经过模拟胃肠液处理之后抑制率未出现显著性的差异，这说明该多肽能够在抵抗模拟胃肠液的降解，在模拟胃肠液中保持其结构稳定性及ace抑制活性。

(六)多肽的抑制模式考察

配制浓度为1mg/ml、0.5mg/ml和0mg/ml的多肽水溶液，用0.1m的硼酸缓冲液(ph8.3,含0.3m的nacl)配制浓度分别为4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml和0.5mg/ml的马尿酰-组氨酰-亮氨酸(hhl)溶液，不同浓度的多肽溶液分别于不同浓度的hhl底物按上述方法测定ace的抑制活性，双倒数作图法测定来确定抑制肽的抑制模式，其中，x轴表示底物浓度的倒数；y轴为平均每分钟生成的马尿酸的浓度。

附图6显示，km不变(斜线与x轴的交点)，这是非竞争性抑制剂的显著特征，随着抑制肽浓度的升高，反应速率(vmax)降低，说明抑制肽降低了ace的催化效率，使单位时间内产物马尿酸的生成量减少。综上紫菜ace抑制肽tgapcr为ace的非竞争性抑制剂，该多肽不与底物竞争活性部位,但是会影响酶对底物的催化。

表3显示紫菜ace抑制肽tgapcr的抑制常数为0.86±0.06mm，抑制常数(ki)表示抑制肽与ace的解离速率，抑制常数越小说明多肽与ace解离速率越慢，越能更好的发挥抑制作用。

表3.多肽的动力学参数

(七)自发性高血压大鼠(shrs)单次给药后降压效果评价

卡托普利北京索莱宝科技有限公司(纯度＞99.0％)

自发性高血压大鼠(shrs)北京维通利华实验动物有限公司

大鼠尾动脉无创血压测量系统coda肯特科技有限公司

自发性高血压大鼠shrs(雄性，10周龄，体重250-300g，无特异性病原体)购买自北京维通利华实验动物有限公司，shrs的喂养环境为：温度22±2℃、12h的日夜循环、定时喂养。shrs被分为3组(空白组、多肽组、阳性对照组)，每组有6只。

当大鼠的收缩压高于180mmhg时可正式开始试验，空白为生理盐水，阳性对照选择卡托普利，多肽和阳性对照使用生理盐水溶解，灌胃剂量为10mg/kg，大鼠尾动脉无创血压测量系统coda测定灌胃后0、1、2、4、6、8h的收缩压和舒张压，每次测量重复10次，每个测量时间点的血压值采用spss17.0版本进行处理；为了比较组间的平均差异，采用了单因素方差分析，结果显示为平均值±标准偏差,p<0.05为有统计学意义。

附图7显示tgapcr能够在灌胃2h产生最大的降低收缩压的作用，它能最大程度地将收缩压从205mmhg降低至178mmhg(28mmhg)；除此之外，tgapcr还能对舒张压产生影响，tgapcr能在2h-4h之间维持shrs较低的舒张压,4h之后开始恢复到之前的水平145mmhg。

以上结果表明：紫菜ace抑制肽tgapcr对ace有较强的抑制活性；该多肽能保持温度、ph、模拟胃肠液和ace降解的稳定性；酶动力学显示该多肽为ace的非竞争性抑制剂；除此之外，该多肽还能显著的降低shrs的血压。紫菜ace抑制肽tgapcr将广泛应用于高血压治疗相关的药品和保健品开发。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细的说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。