一种磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物，其制备方法及应用与流程

本发明属于生物医药领域，涉及一种多肽修饰的脑靶向化药递送系统及其应用，具体涉及一种对血脑屏障高穿透性狂犬病毒糖蛋白(rabiesvirusglycoprotein,rvg)衍生肽与磷脂-聚乙二醇连接构成的脑靶向递送系统及其应用。

背景技术：

脑是人体重要器官，是生命机能的调节器。脑部疾病已严重危害人类健康，脑部疾病种类繁多，发病机制复杂，且由于血脑屏障(bloodbrainbarrier,bbb)的存在，治疗难度较大。血脑屏障是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障，这些屏障能够阻止某些物质由血液进入脑组织。这种结构可使脑组织少受甚至不受循环血液中有害物质的损害，从而保持脑组织内环境的基本稳定，对维持中枢神经系统正常生理状态具有重要的生物学意义。但是bbb同时也可拒绝大部分的药物入脑，使得药物难以到达脑部病灶。为克服跨bbb难题，实现脑部疾病的有效治疗，目前已有报道的方法包括：脑部注射给药(如颅腔内给药)、动脉注射高渗物质暂时打开bbb、将水溶性药物制成脂溶性前药、主动靶向分子介导跨过bbb等。

二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)，作为科学研究中广泛使用的一种双亲性磷脂-peg共轭物，含有亲水性peg和疏水性dspe。如此独特的dspe-peg分子，可以作为辅助型材料用来表面功能化一系列的药物传递系统如基于磷脂的纳米粒子、基于聚合物的纳米粒子、基于无机材料的纳米粒子等。peg的引入可以降低免疫原性和抗原性，并可达到长循环的功能；dspe用于作为纳米粒子的疏水性结构以便有效装载药物。

嵌段聚合物胶束是药剂学纳米体系研究的重要领域之一，近年来发展迅速。利用两亲型聚合物通过自组装方式形成纳米胶束，药物可以加载于内部疏水核心，也可加载于外部亲水层。

阿霉素(dox)，具有较强的抗肿瘤作用，可以直接作用于dna，插入dna的双螺旋链，使后者解开，改变dna的模板性质，抑制dna聚合酶从而既抑制dna合成，也抑制rna合成。此外，阿霉素具形成超氧基自由基的功能，并有特殊破坏细胞膜结构和功能的作用，是一款经典的广谱抗癌药物。阿霉素的多种制剂临床应用于治疗急性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、骨肉瘤及软组织肉瘤、肺癌等多种恶性肿瘤。但因其不能透过血脑屏障，其对脑胶质瘤的治疗作用不大。

主动靶向分子主要是能特异性地结合bbb上的受体或转运体一类分子。采用主动靶向分子修饰的给药系统可模拟bbb上的受体或转运体介导相应内源性的配体或底物跨过bbb转运的过程，此方法能够极大程度地降低脑部损伤，并且可以增加药物的脑部摄取效率。

狂犬病毒糖蛋白衍生的由29个氨基酸构成的多肽rvg-29是一种主动靶向分子，可特异性的与血脑屏障上的乙酰胆碱受体进行特异性结合，介导药物跨过血脑屏障，但由于29个氨基酸结构过长，对所形成的纳米颗粒粒径有一定影响。本课题组前期对狂犬病毒糖蛋白衍生肽结构及靶向效率进行考察，筛选出由15个氨基酸构成，脑靶向效率与rvg-29相当的狂犬病毒糖蛋白衍生肽片段。本课题组前期构建了以rvg-15为靶头修饰的脑靶向载体递送核酸入脑，用以治疗脑胶质瘤，体外实验与体内实验均得到较好效果(黄伟.一种狂犬病毒糖蛋白衍生肽修饰的脑靶向核酸递送载体及其应用：中国，201710277357.8[p].2017-4-25.)。本发明将该狂犬病毒糖蛋白衍生肽rvg-15修饰聚乙二醇-磷脂，构建pe-peg-rvg-15载药系统，可包载递送传统化药入脑，对那些体外有效但体内难以跨越bbb的药物入脑治疗脑部疾病提供了一个种新方法。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是克服现有脑靶向给药系统的缺陷和不足，提供一种狂犬病毒糖蛋白衍生肽修饰的脑靶向递送载体及其应用，为解决本发明的技术问题，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种脑靶向载体磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物，其中狂犬病毒衍生肽(rvg-15)可通过n型乙酰胆碱受体介导跨血脑屏障，入脑效率与经典阳性对照药rvg-29相当，而长度缩短近一半，可大幅缩减合成成本，并有利于减小聚合物粒径。rvg-15的氨基酸序列如序列表1所示，所用的氨基酸可为d型或l型，优选l型。聚乙二醇的聚合度n为5～450，优选8～230，进一步优选18～115，更优选25～55，进一步更优选30～50，最优选40～45，进一步最优选45。r为磷脂基。其中磷脂r可为自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)基、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)基、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(dmpe)基、二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)基、二月桂酰磷脂酰乙醇胺中(dlpe)基。优选二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)基。

其中，r基的结构如下：

二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)基：

二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)基：

二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(dmpe)基：

二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)基：

二月桂酰磷脂酰乙醇胺(dlpe)基：

本发明中选用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)，也可用二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二月桂酰磷脂酰乙醇胺(dlpe)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)替代，反应条件与使用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)相同。

本发明中在dspe-peg末端引入马来酰亚胺基团(mal)，rvg-15末端引入半胱氨酸(cys)，二者可通过加成反应得到聚合物dspe-peg-rvg-15，反应如图1示

优选的制备方法如下：

(1)取摩尔比略大于1：1的rvg-15-cys和dspe-peg2000-mal溶于ph为8的hepes，氮气保护下搅拌下常温反应16h。

(2)选用截留分子量为200-25000的透析袋进行透析，优选截留分子量为12000的透析袋。去离子水中透析，透析时间为24h。

(3)液体冷冻干燥后得冻干粉备用，即得脑靶向复合物磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽(dspe-peg2000-rvg-15)。

本发明将peg修饰的磷脂类聚合物与具有血脑屏障穿透性的狂犬病毒衍生肽相结合，制备了具有主动靶向作用的长循环载体材料，可以直接或者再经过其他途径用于药物载体、基因载体等用途。

本发明的再一个方面，提供了上述的磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物在作为体内、体外递送载体的应用。

在一个实施方案中，参照梁伟等人的文献(参见yiguangwang,etal,pharmaceuticalresearch,vol.27,no.2,february2010)，用聚合物包载阿霉素，并进行粒径、透射电镜、包封率的测定。其方法步骤如下：

取dspe-peg2000-rvg-15于去离子水中，加入dspe-peg2000，恒温水浴，再加入阿霉素(dox)，继续恒温水浴30min，即得dspe-peg2000-rvg-15/dox胶束。其中优选dspe-peg2000-rvg-15与dspe-peg2000的质量比为1：5，1：10，1：20，1：50；最优选为1：10。dspe-peg2000-rvg-15可通过搅拌、加热、超声助溶，优选超声助溶。dspe-peg2000-rvg-15与dspe-peg2000共恒温水浴温度可为25℃，40℃，50℃和60℃，优选50℃，水浴时间优选30min。

本发明提供的磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物作为体外递送载体的应用，其方法和步骤如下：

(1)体外释放实验

将阿霉素胶束溶液转移至透析袋中，两端扎紧后置于10ml的相应ph值(5.0和7.4)的等渗同ph的bs缓冲液中，以中国药典2015版四部溶出度测定法之第三法(小杯法)的装置和方法37℃恒温振荡，回旋速度为100rpm。定时取出0.5ml释放介质，同时补充同温同体积新鲜释放介质。取出的释放介质离心(12000rpm，10min)，取上清液应用高效液相色谱法测定盐酸阿霉素的累积含量。

(2)细胞增殖抑制

将材料冻干制剂用培养液稀释成预定浓度的溶液。每个浓度设6个复孔，并设对照组和调零组。将适量对数生长期的细胞接种于96孔板中，继续培养24h后，介质以含有不同药物浓度的新鲜培养液替换，分别继续培养24h或48h。每孔加入cck-8试剂20μl。继续孵育2h，于450nm处测定吸收值，并以650nm为参考波长。计算细胞活力，公式如下：

细胞活力(％)＝[(od实验-od调零)/(od对照-od调零)]×100

本发明提供的磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物作为体内递送载体的应用，其方法和步骤如下：

(1)以dir为荧光探针，peg-dspe-rvg-15：mpeg-dspe＝1:9或者0:1，采用薄膜分散法制备dir胶束。

(2)取6周龄的雌性icr小鼠，将小鼠随机分为2组，分别尾静脉注射(1)中所制的dir胶束200μl。注射1、4h和24h后，将小鼠用异氟烷麻醉，用小动物活体成像仪观察体内荧光现象。

有益效果：

1、本发明制备的纳米材料具有穿透血脑屏障的功能，解决了载药入脑的脑部疾病治疗的瓶颈问题。

2、本发明制备跨的bbb纳米材料核心狂犬病毒衍生肽由15个氨基酸构成，细胞摄取效率稍差于阳性对照rvg-29，但肽链长度减小一半，更有利于形成小粒径的纳米粒，便于实现脑靶向递送，且极大节约了生产成本。

3、本发明制备纳米材料具有良好的生物相容性和血液长循环的功能，可大幅降低一些化药的毒副作用。

4、本发明制备的纳米材料可包载多种无法跨bbb的化药，对开发那些体外药理活性好，但体内无法跨bbb入脑发挥作用的传统药物提供了一个新途径。

附图说明

图1：rvg-15-cys和dspe-peg2000-mal的反应式

图2：rvg-15-cys的基质辅助激光解吸电离飞行时间(maldi-tof-ms)图谱

图3：dspe-peg2000-mal的maldi-tof-ms图谱

图4：dspe-peg2000-rvg-15的maldi-tof-ms图谱

图5：rvg-15-cys的傅立叶变换红外图谱

图6：dspe-peg2000-mal的傅立叶变换红外图谱

图7：dspe-peg2000-rvg-15的傅立叶变换红外图谱

图8：dspe-peg2000/dox的动态光散射(dls)粒径分布图

图9：dspe-peg2000-rvg-15/dox的dls粒径分布图

图10：dspe-peg2000/dox胶束透射电镜图

图11：dspe-peg2000-rvg-15/dox胶束透射电镜图

图12：不同ph下dspe-peg2000/dox和dspe-peg2000-rvg-15/dox中dox的释放曲线。

图13：dspe-peg2000-rvg-15对大鼠c6细胞的活力抑制结果图

图14：阴性对照组对c6细胞迁移能力的影响结果图

图15：dspe-peg2000/dox对c6细胞迁移能力的影响结果图

图16：dspe-peg2000-rvg-15/dox对c6细胞迁移能力的影响结果图

图17：icr小鼠尾静脉注射dspe-peg2000/dir1h、4h、24h体内荧光变化情况

图18：icr小鼠尾静脉注射dspe-peg2000-rvg-15/dir1h、4h、24h体内荧光变化情况

具体实施方式

实施例1：dspe-peg2000-rvg-15的合成

称取19mgdspe-peg2000-mal、30mgrvg-15-cys于10mlph为8的hepes缓冲液中，氮气保护下室温搅拌反应16h，反应式如图1所示。反应结束后，装入截留分子量为12000的透析袋去离子水中透析24h。液体冷冻干燥得到dspe-peg2000-rvg-15粉末。

取冻干后的dspe-peg2000-rvg-15和反应物基质辅助激光解吸电离飞行时间(maldi-tof-ms)测分子量，结果见图2-4。从图2-4可知，rvg-15-cys的分子量约为1964，dspe-peg2000-mal的分子量约为2875，目标产物dspe-peg2000-rvg-15约为4844，接近两反应物的分子量和，说明得到目标产物。

取冻干后的dspe-peg2000-rvg-15和反应物进行傅立叶变换红外图谱分析，结果如图5-7所示。结果表明，rvg-15-cys在3300左右处的s-h键伸缩振动产生的强峰在产物消失，也可说明反应成功。

实施例2：聚合物包载阿霉素的dspe-peg胶束的制备

取2.5mgdspe-peg2000-rvg-15于去离子水中，超声助溶。加入dspe-peg200022.5mg，50℃恒温水浴30min，再加入5mg阿霉素(dox)，继续50℃恒温水浴30min，即得dspe-peg2000-rvg-15/dox胶束。另制取不带rvg-15的dspe-peg2000/dox胶束作为阳性对照，制备方法如上。制得的dspe-peg2000-rvg-15/dox胶束与dspe-peg2000/dox胶束分别用超速离心法测包封率和载药量；分别过0.22μm水性滤膜，马尔文纳米粒度仪测胶束粒径。

胶束粒径分布图如图8图9所示，dspe-peg2000/dox粒径为13.11nm；包封率为95.09％；载药量为14.41％。dspe-peg2000-rvg-15/dox粒径为13.97nm；包封率为94.76％；载药量为14.43％。与参照梁伟等人的文献报道结果相近。

透射电镜观察两种胶束的形态，结果如图10，11所示。结果表明两种胶束在电镜视野下均呈球形，颗粒较圆整，粒径在15nm作用，与马尔文粒径仪给出的结果相一致。

实施例3：包载阿霉素的聚合物胶束体外累计释放度的测定

将阿霉素胶束溶液(含盐酸阿霉素1mg)转移至透析袋中，两端扎紧后置于10ml的相应ph值(5.0和7.4)的等渗pbs缓冲液中，以中国药典2015版四部溶出度测定法之第三法(小杯法)的装置和方法，37℃恒温振荡，回旋速度为100rpm。在0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、27、30、33、36、48、56、71、79h定时取出0.5ml释放介质，同时补充同温同体积新鲜释放介质。取出的释放介质离心(12000rpm，10min)，应用高效液相色谱法测定盐酸阿霉素的累积含量。

如12显示，随着ph值的降低，盐酸阿霉素释放速率增加。这种释放性质提示在肿瘤ph较低的微环境下该聚合物释放药物的效率比其他正常环境下高，进而可说明该系统对正常组织的毒副作用较低。

药理实验：

实验例1：聚合物细胞毒性试验

细胞毒性评价实验采用cck-8法测定。取对数生长期的c6细胞，以5×10³/孔或3×10³/孔的密度接种于96孔板，于37℃、5％co2孵育24h。分别加入dspe-peg-rvg-15浓度为100、75、50、25、10、7.5、5、2.5、1μg/ml的rpmi-1640培养液100μl，继续孵育24h或48h。孵育结束后，吸去培养液，每孔加入含10％cck-8的培养液100μl，孵育2h后于酶标仪450nm处测定od值。

细胞活力(％)＝(od实验孔-od调零孔)/(od对照孔-od调零孔)×100％。

结果如图13所示，与不同浓度的dspe-peg-rvg-15的细胞活力均高于90％，表明聚合物毒性较小，具有良好的安全性。

实验例2：dspe-peg2000-rvg-15/dox抑制细胞迁徙能力考查

将对数生长期的c6细胞以1.5×10⁵个/ml的密度接种于12孔板中，于37℃，5％co2条件下培养24h，用10μl枪头与细胞表面垂直划痕，每孔1条，用pbs洗去悬浮细胞和杂质，于显微镜下拍照，记录为0时刻划痕。向副孔中分别加入0.5μmg/ml的dspe-peg2000-rvg-15/dox和dspe-peg2000/dox，继续于37℃，5％co2条件下培养，24h后显微镜下拍照，观察划痕愈合情况，以考察dspe-peg2000-rvg-15/dox胶束对c6细胞的横向迁移的抑制能力。结果如图14-16所示。结果表明dspe-peg2000-rvg-15/dox组对划痕愈合抑制情况明显强于空白对照组和dspe-peg2000/dox组。

实验例3：磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物在体内穿透血脑屏障的效率

以dir为荧光探针，peg-dspe-rvg-15：mpeg-dspe＝1:9或者0:1，采用薄膜分散法制备dir胶束。

取6周龄的雌性icr小鼠，将小鼠随机分为2组，分别尾静脉注射上述所制的dir胶束200μl。注射1、4h和24h后，将小鼠用异氟烷麻醉，用小动物活体成像仪观察体内荧光现象。

结果如图17、18所示。结果表明注射peg-dspe-rvg-15/dir的小鼠24小鼠后入脑效果明显，而peg-dspe/dir入脑能力很小，进一步表明rvg-15连接到载体上后可显著提高纳米胶束穿透血脑屏障的能力，确证了rvg-15修饰的纳米胶束具有脑靶向性能。

序列表

<110>中国医学科学院药物研究所

<120>一种磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物，其制备方法及应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>15

<212>prt

<213>狂犬病毒(rabiesvirus)

<400>1

tyrthriletrpcysaspilephethraspserargglnlysarg

151015