一种猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋反应等温检测试剂及检测方法与流程

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋反应(reversetranscriptionpolymerasespiralreaction，rt-psr)等温检测试剂及检测方法。

背景技术：

猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，ped)是由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)引起的，病毒粒子呈圆形或椭圆形，属于冠状病毒科，表面有囊膜，囊膜上有放射状纤突，囊膜内为核衣壳蛋白与rna形成的蜷曲缠绕状结构。pedv能够引起各个年龄阶段的猪感染，临床症状与传染性和胃肠炎病毒(tgev)引起的症状类似，主要包括腹泻、呕吐、严实4、脱水及体重减轻等，仔猪的临床症状较为严重，出现大量的死亡，死亡率最高可达100％，给养猪业带来巨大的经济损失。

pedv的爆发首先在英国被报道，cv777毒株在比利时被分离发现，1978年被认为是造成比利时爆发ped的元凶，证实了区别于tgev的存在，在1982年，被证实命名为pedv，此后的40年里，pedv在欧洲、亚洲、美洲等众多养猪国家相继爆发，并造成相当大的经济损失。在亚洲，我国在1973年就有关于ped的报道，描述了类似于临床症状的一种疾病，但直到1984年引起这种疾病的病原才被分离发现。2010年之前，尽管ped在我国时有发生，但呈现散发性和区域性特点。2010年我国南部省份爆发了高致病的ped，并迅速蔓延至全国，仔猪的死亡率高达100％。在日本，首先检测到ped是在1982年，且在2013年，高致病性ped在日本爆发。1992年，在韩国报道出现ped，2004-2013年ped在韩国得到控制，未出现大范围的爆发。但在2013年，韩国出现了高致病性毒株的爆发。在亚洲其他地区如：泰国、菲律宾等也有ped的相关报道，且在2013年前后相继爆发高致病性ped。

ped的流行通常表现为对新生哺乳仔猪易感，且造成严重的后果，同时，ped还与其他致病源共感染，例如：大肠杆菌感染、猪圆环病毒2型tgev和轮状病毒。新生仔猪体重减轻、水样腹泻、呕吐、脱水、高死亡率，粪便呈黄白色有酸臭味是ped的典型症状。组织学病变包括急性、弥漫性、严重的萎缩性肠炎，浅表上皮细胞的轻度空泡化及结肠、盲肠的上皮水肿；急性感染期间，在空肠的绒毛尖端或整个绒毛上观察到空泡化的细胞或大块细胞剥落，萎缩的绒毛通常与退化或再生的扁平上皮融合及覆盖在上面，在固有层细胞中有明显的炎性细胞浸润。pedv感染的的早期(即潜伏期)感染猪表现出正常的绒毛长度，但空泡状细胞坏死已经开始出现；腹泻发生后的1-3天，受感染的猪表现出严重的绒毛缩短；感染后期(临床症状出现后84-120h)持续的细胞坏死导致中度到重度的绒毛萎缩。

pedv主要编码4中结构蛋白s、e、m、n，这几种蛋白构成病毒粒子的基本结构，并在病毒的复制、扩增中发挥重要的作用。除结构蛋白外，在病毒复制、装配过程中多种非结构蛋白同时发挥着重要的作用。pedv上的orf1a及orf1b编码的非结构蛋白，多聚蛋白pp1a和pp1b。多聚蛋白在多种酶的作用下被切割成16种成熟的复制酶，这些酶一般被称为非结构蛋白，被命名为nsp1-nsp16，他们的主要功能是参与rna的合成、病毒的复制及病毒与宿主之间的反应。orf3位于s基因和e基因之间，编码一种非结构辅助蛋白，这种蛋白是一个离子通道蛋白，能够提高病毒的产量影响病毒粒子的释放和致病力，研究表明缺失orf3蛋白可能导致病毒毒力减弱；目前市场上所有的疫苗株中，orf3在相似的部位均存在缺失，因此，orf3可以作为区分强弱毒株的一个标志，用于临床诊断和流行病学调查。

目前pedv的诊断方法主要分为两类：病原学诊断及血清学诊断；病原学诊断主要针对病毒的核酸及蛋白，血清学诊断主要针对免疫反应后产生的抗体。近年来，由于高致病性pedv在全球的爆发，更加快速准确的检测方法一直是人们追求的方向；同时，pedv可以同多种疾病共同感染，且引起的临床症状相似，通过普通的手段难以区分，所以，实验室诊断技术显得尤为重要。

技术实现要素：

为克服普通检测效率低、难操作、成本高的缺陷，本发明的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋反应等温检测试剂及检测方法，应用该方法进行检测时，检测时间短，特异性和敏感性高，等温反应不需要特殊仪器，操作方便且成本低。

本发明的第一个目的是提供用于检测猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋反应扩增引物组，所述引物组由以下引物组成：

上游引物s1：5’-tattatgttggcagcgcgtt-3’；

下游引物s2：5’-tgccgtcataataagctgct-3’；

上游引物s3：5’-acgaattcgtacatagaagtatag-tattatgttggcagcgcgtt-3’；

下游引物s4：5’-gatatgaagatacatgcttaagca-tgccgtcataataagctgct-3’；

本发明的第二个目的是提供一种猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋扩增反应等温检测试剂，所述试剂包括权利要求1所述的引物组。

作为优选，所述试剂还包括如下组分：10×bstbuffer反应缓冲液、dntps、mg²⁺、bstdna聚合酶、amv反转录酶、depc水、模板rna和显色试剂。

作为优选，所述试剂中mg²⁺的浓度为6mm。

作为优选，所述试剂中dntps的浓度为1.5mm；作为优选，所述试剂中显色试剂为酚红与甲酚红混合指示剂。

作为优选，所述试剂还包括阳性对照。

本发明的第三个目的是提供一种猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋扩增反应等温检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的反转录聚合酶螺旋扩增反应等温检测试剂。

本发明的第四个目的是提供上述等温检测试剂或等温检测试剂盒在如下任一中的应用：

(1)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测猪流行性腹泻病毒；

(2)制备用于检测或辅助检测猪流行性腹泻病毒的产品；

(3)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测待测动物样品是否感染猪流行性腹泻病毒；

(4)制备用于检测或辅助检测待测动物样品是否感染猪流行性腹泻病毒的产品；

(5)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测待测病毒是否为猪流行性腹泻病毒；

(6)制备用于检测或辅助检测待测病毒是否为猪流行性腹泻病毒的产品。

本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助检测待测动物样品是否感染猪流行性腹泻病毒的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：

(1)从待测动物样品中提取基因组rna作为模板，采用上述的等温检测试剂或上述的等温检测试剂盒进行反转录聚合酶螺旋反应，得到扩增产物；作为优选，所述聚合酶螺旋反应的反应条件为恒温42℃作用0.5小时，随后62℃作用1小时；

(2)按照下述任一方法确定待测动物样品是否感染猪流行性腹泻病毒：

a、扩增产物呈现橙黄色则待测动物样品感染猪流行性腹泻病毒；扩增产物呈现紫红色则待测动物样品未感染猪流行性腹泻病毒；

b、将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带呈梯状分布，则待测动物样品感染猪流行性腹泻病毒；仅有引物二聚体阴影带，则待测动物样品未感染猪流行性腹泻病毒。

本发明的第六个目的是提供一种检测或辅助检测待测病毒为猪流行性腹泻病毒的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：

(1)从待测病毒中提取基因组rna作为模板，采用上述的等温检测试剂或上述的等温检测试剂盒进行反转录聚合酶螺旋反应，得到扩增产物；作为优选，所述聚合酶螺旋反应的反应条件为恒温42℃作用0.5小时，随后62℃作用1小时；

(2)按照下述任一方法确定待测病毒是否为猪流行性腹泻病毒：

a、扩增产物呈现橙黄色则待测病毒是猪流行性腹泻病毒；扩增产物呈现紫红色则待测病毒不是猪流行性腹泻病毒；

b、将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带呈梯状分布，则待测动物病毒是猪流行性腹泻病毒；仅有引物二聚体阴影带，则待测病毒不是猪流行性腹泻病毒。

本发明的有益效果如下：

1.本发明使用两对特异性引物，两个识别区域，相对现有的检测方法，简便且特异性高。

2.本发明检测猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋反应等温检测体系具有高灵敏性：将抽提出的猪流行性腹泻病毒rna进行10倍递进稀释后作为反应模板，以同样的模板浓度用普通pcr方法进行检测，结果表明：反转录聚合酶螺旋反应方法比常规rt-pcr扩增的方法至少高10倍。由此可见，本方法具有更高的灵敏度。

本发明检测猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋反应方法具有高特异性：将临床上常见的禽类病毒性疾病：csfv(猪瘟)及prrsv(猪繁殖与呼吸综合征病毒)、tgev(猪传染性胃肠炎)、prv(猪伪狂犬病)、猪圆环2型(pcv2)、猪细小ppv和猪流行性腹泻病毒(pedv)分别作为检测对象，用本发明的方法进行检测，仅pedv为阳性，具有高特异性。

本发明检测猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋反应方法具有快速性：相对普通rt-pcr反应数小时的反应时间和检测时间，本发明检测方法仅需恒温条件下1.5小时即可完成整个反应和结果判定。

本发明检测猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋反应具有可操作性：相对于常规rt-pcr，猪流行性腹泻病毒聚合酶螺旋反应不需要昂贵的pcr仪，只需要一个简单的恒温水浴锅即可完成反应；且结果可以直接肉眼判定，无需凝胶电泳等特殊仪器，因此本发明反应体系具有较强的可操作性。

3.本发明检测方法容易操作，成本低廉，可广泛应用。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为pedvorf3基因保守区rt-psr扩增图。

图2为rt-psr添加核酸染料的变色结果图。

图3为pedvrt-psr反应特异性试验图。

图4为pedvpsr反应产物的酶切鉴定结果图。

图5为pedvpsr反应灵敏度试验图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

1、试剂相关材料

猪流行性腹泻病毒为实验室分离保存毒株。病毒基因组dna/rna提取反应体系(北京全式金生物技术有限公司)，betaine(sigma公司)，bstdna聚合酶及10×bstbuffer反应缓冲液(biolabsinc公司)，dntp(clontech公司)，mg²⁺及dl2000(takara公司)。显色试剂为0.025mm酚红和0.08mm甲酚红混合染色液，均购自solarbio公司。

2、psr引物的设计与合成

参考目前已发表的猪流行性腹泻病毒序列，针对pedv病毒属的保守区域orf3区域，利用在线设计软件primerpremier5.0分别设计2条引物用于rt-pcr对照和反转录，包括s1和s2(s1、s2引物分别与反向互补的保守性序列相连，以利于成环和链置换反应的进行)，以及2条引物(s3和s4)用于螺旋扩增，s3和s4引物5‘端反向互补序列由植物基因中调取改造，无任何动物基因匹配序列，并包含gaattc(ecori酶切位点序列)利于后续扩增产物的酶切鉴定，序列分别如下：

上游引物s1：5’-tattatgttggcagcgcgtt-3’；

下游引物s2：5’-tgccgtcataataagctgct-3’；

上游引物s3：5’-acgaattcgtacatagaagtatag-tattatgttggcagcgcgtt-3’；

下游引物s4：5’-gatatgaagatacatgcttaagca-tgccgtcataataagctgct-3’；

其中：gaattc(ecori酶切位点序列)。

设计完成的引物由北京奥科生物工程公司合成，合成后的引物用depc水稀释成10mmol/ml溶液，-20℃保存。

3、病毒基因组提取

利用北京全式金生物技术有限公司的病毒基因组dna/rna提取反应体系，提取细胞培养猪流行性腹泻病毒液、疑似有猪流行性腹泻病毒感染的患病动物组织样品、特异性对照病毒样品的病毒基因组rna/dna(即阳性对照)。

4、猪流行性腹泻病毒rt-psr反应体系的建立

猪流行性腹泻病毒反转录等温检测试剂包括如下组分：

其中，阳性对照为猪流行性腹泻病毒样品的基因组rna。

显色试剂为酚红与甲酚红混合指示剂。

将上述组分混匀后放置于pcr仪内或者水浴锅中恒温42℃作用0.5小时，随后62℃作用1小时；反应结束后，可以将扩增产物用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml的溴化乙锭)电泳检测，电泳条件为80v、30min；也可直接肉眼观察其颜色变色，两者判定结果一致。肉眼观察时，阳性结果显示为橙黄色，阴性结果显示为紫红色。

电泳检测结果如图1所示，电泳条带呈梯状分布，与理论结果相符，阴性对照的扩增结果只有引物二聚体出现。图2的颜色变化分别显示了扩增结果的肉眼可观察性，自然光下阳性管为橙黄色，而阴性管保持紫红色。

图1为pedvorf3基因保守区rt-psr扩增图。其中m：dna分子量标准dl2000；1：pedv毒株扩增结果；2：阴性对照。

图2为rt-psr添加核酸染料的变色结果(此染料为反应前加入)图。其中1-6为橙黄色，7为紫红色。橙黄色为阳性，紫红色为阴性对照。

5、猪流行性腹泻病毒rt-psr检测方法条件的优化

5.1反应时间优化

配置反应体系，每个时间条件的样品设置3个重复，恒温42℃作用0.5小时后，分别在恒温水浴锅中反应40min、50min、60min、70min后取出，待反应产物全部取出后，各取5μl产物，用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml的溴化乙锭)电泳对反应产物进行检测。

5.2反应温度的优化

配置反应体系，每个温度条件样品设置3个重复，恒温42℃作用0.5小时后，分别在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃五个反应温度中反应1小时后，反应结束后各取5μl产物进行2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml的溴化乙锭)电泳检测。

5.3反应中各重要组分浓度的优化

在25μl反应体系中，引物浓度、反应所需酶单位与所用模板浓度不变，改变组分mgso4的浓度，摸索mgso4浓度对扩增效率的影响，加入量依次为为7mm、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0mm，每个浓度梯度设置3个重复。待所有浓度梯度反应结束后，进行2％琼脂糖凝胶电泳检测；设置不同dntps浓度的反应体系优化，其梯度设置为1.8mm、1.5mm、1.2mm、0.9mm、0.6mm，所有分组反应都以去离子水作为模板设阴性对照，每个浓度梯度设置3个重复。待所有浓度梯度反应结束后，进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。

6、猪流行性腹泻病毒psr等温检测方法的优化结果

6.1反应时间优化结果：当反应时间不同时，会随着时间延伸电泳条带越来越明显，在恒温水浴锅中反应60min时，结果最佳。

6.2反应温度优化结果：当反应温度不同时，会出现电泳条带亮度差异，在62℃下反应时，效果最佳。

6.3反应中各重要组分浓度的优化结果：

当mgso4浓度不同时，会出现电泳条带亮度差异，当mgso4浓度为6mm时，效果最佳。

当dntps浓度不同时，会出现电泳条带亮度差异，当dntps浓度为1.5mm时，效果最佳。

6.4优化体系和条件

通过上述条件的优化，猪流行性腹泻病毒反转录聚合酶螺旋反应方法的最后优化的体系为：

猪流行性腹泻病毒反转录聚合酶螺旋反应检测试剂包括如下组分：

聚合酶一螺旋方法的反应条件为恒温42℃作用0.5小时，随后62℃作用1小时。

6.5猪流行性腹泻病毒反转录聚合酶螺旋反应检测试剂盒：25μl检测体系的猪流行性腹泻病毒反转录聚合酶螺旋反应反应体系包括如下组分：

7、psr的特异性试验

以临床上常见的猪类病毒性疾病：csfv(猪瘟)及prrsv(猪繁殖与呼吸综合征病毒)、tgev(猪传染性胃肠炎)、prv(猪伪狂犬病)、猪圆环2型(pcv2)和猪细小(ppv)作为检测对象，用本发明的pedv引物进行psr检测，来验证其反应的特异性，并设置阳性对照，结果参见图3。

psr检测的反应体系包括如下组分：

其中，阳性对照为猪流行性腹泻病毒模板dna，其为使用病毒dna/rna提取反应体系提取的猪流行性腹泻病毒基因组dna。

扩增结果显示只有阳性对照出现梯状条带，其他6种病毒均未出现，说明以其它病毒作为模板时没有阳性扩增，本发明设计的pedvpsr引物具有高度的特异性。

图3为pedvrt-psr反应特异性试验图。其中m：dna分子标准量标准dl2000；泳道1～7分别为pedvrt-psr特异性引物检测阳性对照(pedv)、csfv及prrsv、tgev、prv、pcv2和ppv的结果，8为阴性对照。

7.1扩增产物的酶切鉴定

为进一步验证扩增反应的特异性，将rt-psr反应后产物进行酶切鉴定，在20μl反应体系中加入以下组分，用ecori对阳性psrp产物进行消化。

将上述反应产物混匀后，37℃反应2h，反应后取出5μl产物，用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml的溴化乙锭)对酶切产物进行检测。

结果：理论计算中，pedv扩增产物经内切酶ecori消化后，应成为三条大小分别为50bp，220bp和260bp的主带。图4中结果与理论值完全相符，说明本发明建立的检测方法具有很好的特异性。

图4为pedvpsr反应产物的酶切鉴定结果图。其中m：dna分子标准量标准dl2000；1：pedvpsr终产物；2：内切酶ecori消化后的结果。

8、pedv的敏感性试验

取抽提出的病毒液dna产物进行10倍递进稀释至10^-7，并分成两部分，一部分用优化后的psr方法检测，加入显色液后直接肉眼观察，测定该方法的敏感性；另一部分用常规pcr方法检测，将两者检测结果进行比较，参见图5的a和b图，以验证其反应的敏感性。

结果表明：rt-psr方法比常规rt-pcr扩增的方法至少高10倍。由此可见，本发明rt-psr方法具有更高的敏感性。

图5为pedvpsr反应灵敏度试验图，其中m：dna分子标准量标准dl2000；其中，a图为普通pcr方法，b图为本发明的psr方法。a、b图中1～6分别为模板稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，7为阴性对照。

9、rt-psr实际应用的符合性

临床采集疑似猪流行性腹泻病毒的组织病样，提取样品基因组，利用本发明建立的psr检测方法和常规的pcr以及荧光定量pcr方法进行检测，通过对三种方法实际应用中检测结果比较，验证rt-psr的符合性。

结果表明：利用本发明的猪流行性腹泻病毒反转录聚合酶等温螺旋反应反应体系和常规pcr以及荧光定量pcr对获得的样品进行检测，发现本发明的rt-psr的检出率高于传统的pcr方法，与荧光定量pcr方法检出率较为相近，且传统的rt-pcr和荧光定量rt-pcr检出的阳性样品都可以被本发明的psr方法所检出。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。