用于小麦赤霉病抗性检测的KASP引物组及其应用的制作方法

本申请涉及小麦育种领域，特别是一种用于小麦赤霉病抗性检测的kasp引物组及其应用。

背景技术：

小麦赤霉病(fusariumheadblight,fhb)是由镰孢属(fusariumspp.)引起的一种世界性小麦穗部病害，不仅造成产量损失，且其引起的真菌毒素还严重危害人畜健康。随着全球性气候变暖、耕作制度以及耕作方式的改变，小麦赤霉病正向黄淮麦区、北方麦区、西南麦区和西北麦区扩展，且大流行频率不断增加，2000至2012年，我国有9个年份赤霉病的发生面积超过3.3×10⁶hm²。改变耕作制度和栽培技术难以解决赤霉病的侵染和蔓延，依赖化学防治尽管对控制赤霉病的大发生和大流行取得了一定成效，但不可避免地造成成本增加和环境污染，有悖于绿色发展理念，因此培育抗病品种成为减轻赤霉病危害的主要途径。

国内外对赤霉病的抗性遗传进行了大量研究，发现多个赤霉病抗性qtl，并命名7个抗赤霉病基因。由于抗性效应及稳定性等方面原因，目前广泛应用的仅有位于3bs染色体上的fhb1位点，为了应对生产需求，新的赤霉病抗性基因亟待挖掘。长江中下游麦区是我国最早开展赤霉病抗性育种的区域，其代表性系列品种宁麦、扬麦、镇麦等均具有较高的赤霉病抗性，部分品种含有fhb1，系谱研究表明其fhb1多源于宁麦9号。

单核苷酸多态性(snp)标记，是继限制性片段长度多态性(rflp)和简单重复序列(ssr)之后的第3代分子标记，具有密度高、代表性强、遗传稳定性好和自动化程度高等优点，因此在遗传研究中具有广阔的应用潜力。在大量测序数据积累的基础上,芯片技术得到快速发展，相继开发出小麦illuminaiselect9k、illuminaiselect90k、affymetrixaxiom660k等芯片，并广泛应用于小麦遗传连锁图谱的构建、群体结构和连锁不平衡分析等研究。竞争性等位基因特异性pcr(kompetitiveallelespecificpcr，kasp)标记是针对基因组dna样品，通过引物末端碱基的特异匹配来对snp以及indel位点进行精准的双等位基因分型的pcr技术，目前广泛应用在水稻、小麦、大豆等作物的分子标记辅助选择中。

扬麦158是90年代长江中下游麦区的主推品种，同时也是重要的亲本材料，其赤霉病抗性达到中抗水平，但经鉴定其中不含fhb1，目前，针对扬麦158系的赤霉病抗性检测引物尚未见报道。

技术实现要素：

针对上述问题，本身提供一组针对扬麦158的小麦赤霉病抗性检测的kasp引物组及其应用，

小麦赤霉病抗性检测的kasp引物组，包括核苷酸序列如seqidno.1所示的前引物allelefam、核苷酸序列如seqidno.2所示的前引物allelehex、核苷酸序列如seqidno.3所示的后引物common。

上述kasp引物组在检测小麦赤霉病抗性中的应用，其具体步骤如下：利用上述kasp引物组配制成pcr检测体系并进行pcr扩增，再利用多功能酶标仪检测pcr扩增产物并以klustercallersoftware软件对5a染色体48.2cm处的标记excalibur_c6567_743进行基因分型，该位点等位变异为t/g，含有等位基因g的小麦赤霉病抗性显著高于含有等位基因t的小麦。扬麦158含有的优势等位变异为g，与前引物allelehex结合，t为非优势等位变异，可与前引物allelefam结合，从而利用kasp引物组将二者区分。

所述pcr检测体系(5μl)：包括2.5μldna(30ngμl^-1),kaspmix2.5μl(lgcgenomics,hoddeston,uk)和0.07μlkaspassaymix；

其中，kaspassaymix配制方法如下：每100μlkaspassaymix包含浓度为100μm的前引物allelefam(seqidno.1)12μl、浓度为100μm的前引物allelehex(seqidno.2)12μl、浓度为100μm的后引物common(seqidno.3)30μl、加入ddh2o补足至100μl。

pcr扩增程序：94℃热激活15min；94℃变性20s,61～55℃退火和延伸60s,10个循环(touch-down,每循环降低0.6℃)；94℃变性20s,55℃退火和延伸60s,26个循环。

本发明同时还提供了一种用于检测小麦赤霉病抗性的基因盒，包括：2.5μldna(30ngμl^-1),kaspmix2.5μl(lgcgenomics,hoddeston,uk)和0.07μlkaspassaymix；

其中，kaspassaymix配制方法如下：每100μlkaspassaymix包含浓度为100μm的allelefam12μl、浓度为100μm的allelehex12μl、浓度为100μm的后引物30μl、加入ddh2o补足至100μl。

本发明利用illuminaiselect90k芯片对宁麦9号×扬麦158的282份重组自交系进行基因组扫描，构建遗传图谱，结合3个环境的表型鉴定数据进行qtl定位，最终在5a染色体上检测到一个来源于扬麦158的稳定抗性位点，进一步转化为kasp标记，并验证其对赤霉病抗性影响显著，可应用于育种选择。

附图说明

图1为遗传图谱示意图。

图2为实施例1kasp标记扩增检测结果示意图。

图3为实施例2基因分型检测结果示意图。

具体实施方式

遗传定位使用的宁麦9号×扬麦158的282份重组自交系群体由江苏省农业科学院粮食作物研究所保存。

标记验证使用的46份品种材料由江苏省农业科学院粮食作物研究所收集并保存。

赤霉菌由江苏省农业科学院植物保护研究所提供。

实施例1扬麦158的稳定抗性位点筛选

1、筛选方法

本实施例以源自于宁麦9号×扬麦158的282份重组自交系(rils)为材料，2015-2016生长季将所有rils及其亲本种植于江苏省农科院院内试验基地，单行区,行长2.0m,行距0.3m,每行50粒,2次重复。单花滴注的赤霉菌孢子液10μl,孢子浓度为5×10⁵ml^-1。在始花期,每个株系接种10穗,套袋保湿72h后,在弥雾保湿条件下继续生长,接种后21d调查病小穗数,作为赤霉病抗性评价指标。2016-2017生长季在江苏省农科院院内试验基地(玄武)及六合试验基地(六合)两个地点采用同样方法进行重复鉴定。利用excel2016对表型数据进行初步统计处理，用ibmspss19.0进行相关分析及方差分析。

采用ctab法从试验材料植株幼嫩叶片中分离dna(具体方法参见文献：doyle,j.j.(1987).arapiddnaisolationprocedureforsmallamountsoffreshleaftissue.phytochembull19,11-15.)，利用illumina90k基因芯片(参见文献：wang,s.,wong,d.,forrest,k.,allen,a.,chao,s.,huang,b.e.,maccaferri,m.,salvi,s.,milner,s.g.,andcattivelli,l.(2014).characterizationofpolyploidwheatgenomicdiversityusingahigh-density90000singlenucleotidepolymorphismarray.plantbiotechnologyjournal12,787-796.)对试验材料进行基因组扫描，构建遗传连锁图，综合基因型与表型数据，使用icimapping4.1的完备区间作图方法(icim)进行qtl定位，统计在多环境中稳定检测到的位点，并进行标记转化，在品种材料中进行验证。

2、筛选结果

通过上述筛选方法检测到一个来源于扬麦158的稳定抗性位点，位于5a染色体48.2cm处(图1箭头标记处)，excalibur_c6567_743为其紧密连锁标记(如图1所示)，其等位变异为t/g，扬麦158含有的优势等位变异为g。

为了能够进一步验证并利用此标记，申请人其转化为kasp标记，包括两条前引物(allelefam、allelehex)与一条后引物(common)，序列分别如下，

allelefam(seqidno.1)：gaaggtgaccaagttcatgctcgactaatttaaacttggagctgtgat；

allelehex(seqidno.2)：gaaggtcggagtcaacggattgactaatttaaacttggagctgtgag；

common(seqidno.3)：gttcatacctacacccgtactgacaa。

并进行pcr扩增反应，反应体系及扩增程序如下：

pcr体系(5μl)：包括2.5μl样品dna(30ngμl^-1),kaspmix2.5μl(lgcgenomics,hoddeston,uk)和0.07μlkaspassaymix；

其中，kaspassaymix配制方法如下：每100μlkaspassaymix包含浓度为100μm的allelefam12μl、浓度为100μm的allelehex12μl、浓度为100μm的后引物30μl、加入ddh2o补足至100μl。

pcr程序：94℃热激活15min；94℃变性20s,61～55℃退火和延伸60s,10个循环(touch-down,每循环降低0.6℃)；94℃变性20s,55℃退火和延伸60s,26个循环。

利用多功能酶标仪(pherastar，mglabtech,germany)检测pcr扩增产物，并使用klustercallersoftware(lgcgenomics,beverly,usa)进行基因分型(参见文献：wuj,lius,wangq,zengq,muj,huangs,yus,hand,kangz(2018)rapididentificationofanadultplantstriperustresistancegeneinhexaploidwheatbyhigh-throughputsnparraygenotypingofpooledextremes.theoreticalandappliedgenetics131:43-58)。

从282份rils中随机选取46份材料按如上方法进行kasp标记扩增检测，检测结果如图2所示。图2中，红色为携带优势等位变异g(+)，蓝色为携带非优势等位变异t(-)，且分型结果良好，材料分型与芯片检测数据完全一致，说明kasp标记开发成功，可进一步应用于育种材料检测。

实施例2kasp引物组基因组分型鉴定

利用实施例1获得的kasp引物组对46份品种材料(表1)进行基因分型(检测结果见图3及表1所示)，并结合表型鉴定数据进行统计分析(t检验)，统计软件采用spss19.0，结果如表2所示。

表1小麦材料分型检测结果1

表1中，“+”表示携带优势等位变异g，“-”表示携带非优势等位变异t。

表2小麦材料分型鉴定结果

表2中，t、p代表统计参数。

t检验显示携带优势等位变异g的材料赤霉病小穗数显著低于含非优势等位变异t的材料，表明含有等位基因g的小麦赤霉病抗性显著高于含有等位基因t的小麦，证明该kasp引物组可有效的帮助进行赤霉病筛选。

序列表

<110>江苏省农业科学院

<120>用于小麦赤霉病抗性检测的kasp引物组及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gaaggtgaccaagttcatgctcgactaatttaaacttggagctgtgat48

<210>2

<211>47

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gaaggtcggagtcaacggattgactaatttaaacttggagctgtgag47

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gttcatacctacacccgtactgacaa26