一种空气中微生物的荧光标记方法及其应用与流程

本发明涉及微生物检测技术领域，特别是涉及一种空气中微生物的荧光标记方法及其应用。

背景技术

空气中悬浮的微生物统称为生物气溶胶，包括细菌、病毒、真菌及其孢子、花粉和寄生虫卵等，粒径一般为0.3至10微米，其浓度对人员健康、疾病传播具有重要影响。生物气溶胶一方面可以来源于土壤、灰尘、动植物及人类自身，由人类的日常生产生活产生；另一方面可以由生物战剂的固体或液体微粒分散在空气中所形成。

目前医学已经证明，空气中的细菌和病毒可能传播sars、h1n1流感等疾病，尤其是传染病患者、动物等排放的生物气溶胶，在传染病爆发、流行过程中起到重要作用。

正因为如此，生物气溶胶的快速灵敏检测是近些年国际研究关注的热点。目前在快速检测技术中最具前景的技术为生物气溶胶荧光分析技术。该技术的基本原理是，利用微生物活体细胞自身含有多环或杂环化学架构的特点，使其在紫外光照射下发射荧光。生物气溶胶粒荧光分析仪器吸入环境中的待测空气，利用紫外光诱导其中微生物颗粒产生荧光并由检测器探测，以统计其浓度，对生物气溶胶浓度异常波动进行报警。

然而目前技术的主要问题是，微生物的自发荧光极其微弱，甚至与很多尘埃的区别不大，在日常应用中极易被各种烟尘干扰，造成仪器的要么灵敏度低而探测不到微生物，要么误报率居高不下。因此亟须一种方法能够增强微生物的荧光，使其信号明显区分于环境尘埃。

技术实现要素：

本发明实施例的目的在于提供一种空气中微生物的荧光标记方法，以增强空气中微生物在紫外光激发下的荧光强度，同时本发明还提供了一种用于检测空气中微生物的方法及装置。具体技术方案如下：

本发明第一方面提供了一种空气中微生物的荧光标记方法，将待测空气与邻苯二甲醛蒸气接触，以使所述邻苯二甲醛蒸气与空气中微生物反应生成荧光物质，实现微生物的荧光标记。

在本发明第一方面的一些实施方式中，所述空气中的微生物包括细菌、病毒、真菌及其孢子、花粉和/或寄生虫卵。

在本发明第一方面的一些实施方式中，所述邻苯二甲醛蒸气的蒸气压力为0.3～30毫米汞柱。

在本发明第一方面的一些实施方式中，所述邻苯二甲醛蒸气的蒸气压力为56～120℃下邻苯二甲醛的饱和蒸气压。

在本发明第一方面的一些实施方式中，所述待测空气与邻苯二甲醛蒸气接触时间为30秒至30分钟。

在本发明第一方面的一些实施方式中，所述荧光物质的激发波长为340～380nm，优选为360nm。

在本发明第一方面的一些实施方式中，所述荧光物质的发射波长为390～520nm。

在本发明第一方面的一些实施方式中，所述待测空气与邻苯二甲醛蒸气在密闭容器中接触。

本发明第二方面提供了一种应用本发明第一方面所述的荧光标记方法检测空气中微生物的方法，包括：

使待测空气与邻苯二甲醛蒸气接触；

使与邻苯二甲醛蒸气接触后的待测空气进入气溶胶荧光检测器进行荧光检测。

本发明第三方面提供了一种空气中微生物的检测装置，包括加热器、反应器和气溶胶荧光检测器；所述反应器中放置有邻苯二甲醛，所述加热器与所述反应器接触，以加热邻苯二醛；所述反应器上设置有进气管和出气管，所述出气管的另一端与所述气溶胶荧光检测器连接。

本发明实施例提供的空气中微生物的荧光标记方法，可以增强标记后的微生物在紫外光激发下的荧光强度，使检测器能够有效区分空气中的微生物和其他颗粒物质，提高检测的准确度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为一种空气中微生物检测装置的结构示意图；

图2为未与邻苯二甲醛蒸气接触的含有ps微球与枯草芽孢杆菌的待测空气的荧光/粒径谱图；

图3为与邻苯二甲醛接触后的含有ps微球的待测空气的荧光/粒径谱图；

图4为与邻苯二甲醛接触后的含有枯草芽孢杆菌的待测空气的荧光/粒径谱图；

图5为与邻苯二甲醛接触后的含有ps微球与枯草芽孢杆菌的待测空气的荧光/粒径谱图；

图6为接触时间与微生物检出数量关系曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明第一方面提供了一种空气中微生物的荧光标记方法，将待测空气与邻苯二甲醛蒸气接触，以使所述邻苯二甲醛蒸气与空气中微生物反应生成荧光物质，实现微生物的荧光标记，进而能够增强空气中微生物在紫外光激发下的荧光强度。

已有研究表明邻苯二甲醛溶液和能够与含氨基的化合物反应，生成荧光物质，并能在紫外光激发下产生荧光。发明人在研究中意外地发现，邻苯二甲醛蒸气与空气中的微生物接触后也可以发生反应，并生成荧光物质，从而可以增强微生物在紫外光激发下的荧光强度，以实现微生物的荧光标记。而空气中的其他颗粒物质，例如粉尘等，则不能与邻苯二甲醛蒸气反应，不能产生荧光物质。当采用紫外光激发时，微生物表面的荧光物质被激发发出荧光，其强度要远强于其他颗粒物质的自发荧光，从而能够被荧光检测器准确地区分并检测出来。

在本发明第一方面的一些实施方式中，所述空气中的微生物包括细菌、病毒、真菌及其孢子花粉、霉菌孢子、和/或寄生虫卵。

本发明中，邻苯二甲醛蒸气可以通过加热邻苯二甲醛固体得到的。邻苯二甲醛常温下为固态，熔点为56℃左右，当其被加热至高于熔点温度时，有利于其快速蒸发进入空气；邻苯二甲醛在空气中的最终浓度取决于其在某加热温度下的饱和蒸气压，加热温度越高，其饱和蒸气压越高，邻苯二甲醛在空气中的浓度越大，越有利于加速反应，缩短反应时间；但是邻苯二甲醛蒸气浓度过高时，其对相关的标记装置、以及后续可能存在的检测装置可能具有一定的损坏作用，且过高的加热温度影响邻苯二甲醛的稳定性；综合上述因素考虑，本发明优选地采用邻苯二甲醛的加热温度范围为56～120℃，在56～120℃下，邻苯二甲醛的饱和蒸气压约为0.3毫米汞柱至30毫米汞柱(40～3900pa)。

发明人在研究中发现，邻苯二甲醛标记空气中微生物的速率受到邻苯二甲醛蒸气的浓度影响，在实际应用中，本领域技术人员可根据实际情况，具体选择最佳反应时间；在本发明第一方面的一些具体实施方式中，所述待测空气与邻苯二甲醛蒸气接触时间为30秒至30分钟。

在本发明第一方面的一些实施方式中，所述荧光物质的激发波长为340～380nm，优选为360nm。

在本发明第一方面的一些实施方式中，所述荧光物质的发射波长为390～520nm。

在本发明第一方面的一些实施方式中，所述待测空气与邻苯二甲醛蒸气在密闭容器中接触。

本发明第二方面提供了一种应用本发明第一方面所述的荧光标记方法检测空气中微生物的方法，包括：

使待测空气与邻苯二甲醛蒸气接触；

使与邻苯二甲醛蒸气接触后的待测空气进入气溶胶荧光检测器进行荧光检测。

在本发明第二方面的一些具体实施方式中，待测空气与邻苯二甲醛蒸气的反应时间为30秒-30分钟。

在本发明第二方面的一些具体实施方式中，邻苯二甲醛蒸气的蒸气压为0.3毫米汞柱至30毫米汞柱。

在本发明第二方面的一些具体实施方式中，邻苯二甲醛的加热温度为56～120℃。

本发明第三方面提供了一种空气中微生物的检测装置，如图1所示，包括加热器2、反应器1和气溶胶荧光检测器3；所述反应器1中放置有邻苯二甲醛6，所述加热器2与所述反应器1接触，以加热邻苯二醛6；所述反应器1上设置有进气管4和出气管5，所述出气管5的另一端与所述气溶胶荧光检测器3连接。

在本发明第三方面的一些具体实施方式中，所述气溶胶荧光检测器3中包括气泵7，紫外激光器8和荧光检测器9。开启气泵7，待测空气通过进气管4进入反应器1中；关闭气泵7，开启加热器2加热反应器1中的邻苯二甲醛6产生邻苯二甲醛蒸气；在反应器1中，待测空气与邻苯二甲醛蒸气发生反应；反应结束后，再次开启气泵7，反应后的待测空气通过出气管5进入气溶胶荧光检测器3中，在紫外激光器8所产生的紫外光的激发下，待测空气产生荧光，并通过荧光检测器9检测。

在本发明第三方面的一些具体实施方式中，所述反应器1为密闭容器。示例性地，反应器1可采用1000ml广口瓶，所述广口瓶采用瓶塞封闭，瓶塞上带有进气管4和出气管5，其中，进气管4伸入反应器1的一端靠近反应器1的底部，但不与固态或液态邻苯二甲醛接触；出气管5伸入反应器1的一端位于反应器1的顶部。

在本发明第三方面的一些具体实施方式中，所述加热器2的可加热温度范围为56～120℃。

在本发明第三方面的一些具体实施方式中，气溶胶荧光检测器3对待测空气中微生物进行检测的激发波长为340～380nm，优选为360nm；检测波长为390～520nm，与微生物与邻苯二甲醛蒸气所生成的荧光物质的发射波长范围相同。

在本发明第三方面的一些具体实施方式中，所述气溶胶荧光检测器3可购自商业途径，为本领域检测空气中微生物的常用荧光检测器，本发明在此不做限定。

空气中微生物检测实施例

采用本发明所述的方法，及图1所示的装置，检测混有ps微球和/或枯草芽孢杆菌的空气(待测空气)的荧光强度。

实验组：

气泵将含有ps微球和枯草芽孢杆菌的待测空气吸入装有50g邻苯二甲醛的反应器中；所述反应器容积1000ml，气泵流量6l/min；通气20秒后气泵停止工作；

加热邻苯二甲醛至70℃，使邻苯二甲醛熔化并部分蒸发，邻苯二甲醛蒸气与待测空气充分混合，反应10min；

打开气泵，将待测空气吸入气溶胶荧光分析仪(北京瑞荧仪器科技有限公司，型号bafd-02)，对待测空气进行检测，其中，激发光受限于元器件，因此选择了接近优选波长的375nm紫外光作为激发光；检测波长范围400-520nm；统计待测空气中的颗粒数量。

对照组1

除反应器中未装有邻苯二甲醛外，对照组1采用的仪器和流程与实验组完全相同。

对照组2

所述待测空气中只含有ps微球，其他参数和流程与实验组完全相同。

对照组3

所述待测空气中只含有枯草芽孢杆菌，其他参数和流程与实验组完全相同。

聚苯乙烯微球(ps微球)购自美国bangslaboratories公司,型号ps03n，由于其粒径与空气中灰尘基本一致，常用于在实验室中模拟空气中的灰尘。ps微球和枯草芽孢杆菌都存在自发荧光，对照组1的检测结果如图2所示，可见未与邻苯二甲醛蒸气接触的ps微球与枯草芽孢杆菌都出现在低荧光区间，二者无法分开；而当待测空气与邻苯二甲醛蒸气接触后，只含有ps微球的待测空气的荧光检测结果如图3所示，可见其荧光强度没有明显变化，空气中的颗粒物质仍集中于低荧光区；而只含有枯草芽孢杆菌的待测空气的荧光检测结果如图4所示，其荧光强度显著提高，空气中的颗粒物质多集中于高荧光区；可见只有微生物颗粒能够被荧光标记；实验组结

果如图5所示，可见混合有ps微球和枯草芽孢杆菌的待测空气中，细菌成分进入谱图中高荧光区间，而ps微球仍分布于低荧光区，因此很容易通过设置分割线计算待测空气中微生物颗粒的数量。

仪器将荧光强度高于200的颗粒判定为生物颗粒，将仪器统计数量与样品中细菌的真实释放数量相除，可得仪器的生物颗粒检出率。本实验中，对照组枯草芽孢杆菌的检出率为11％，而实验组枯草芽孢杆菌的检出率达到75％，可见仪器对微生物的检出率有大幅度的提高，其准确度也明显提高。

接触时间与微生物检测数量关系实施例

以室外空气作为待测空气，当不采用本发明所述方法标记待测空气时，生物气溶胶分析仪所检出生物颗粒数量约为80个/升；而采用本发明所述方法标记待测空气，在70℃下使邻苯二甲醛与待测空气接触，随着接触时间(即反应时间)的延长，检出的生物颗粒数量呈现增加趋势，结果如图6所示。发明人在研究中发现，在70℃下，当接触时间超过30分钟后，检测到的微生物数量将不再随时间延长发生变化；由此说明，邻苯二甲醛与氨基的反应，随着反应时间的延长而趋于饱和，适当延长反应时间有利于检测结果的准确性和稳定性。

本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。