ctDNA建库试剂盒和建库方法与流程

本发明属于分子基因学领域，具体涉及一种ctdna建库试剂盒和建库方法。

背景技术

ctdna，即循环肿瘤dna，是体内循环肿瘤细胞和肿瘤组织在细胞代谢时留在血浆中的残留物。科学研究发现，利用测序技术对ctdna进行高通量分析，即可根据基因突变信息来指导抗肿瘤药物选用、疗效评估、预后判断，甚至早期发现和早期诊断。然而，血浆中的ctdna浓度极低，且多为小片段分子，提取困难，丢失量大，检测灵敏度低，这为测序文库的制备带来了挑战。目前市场上ctdna建库的方法是在双链dna末端补平加a，然后再加接头进行扩增。然而，由于ctdna的高度片段化特点，导致部分ctdna无法补平加接头，造成了ctdna的损耗，使一些基因突变位点无法被检测到，限制了检测灵敏度。

申请号为cn201710116455.3的专利申请，试图通过单链连接酶解连接接头决上述问题，虽然提高了一定的检测灵敏度，但是单链连接酶对单链dna分子具有很强的环化作用，并且单链连接酶连接时对dna单链末端存在碱基偏好性由强到弱依次为t>a>g>c，从而影响了检测灵敏度，因此仍然需要更加行之有效的方案以弥补现有技术的不足。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于提供一种高灵敏性的ctdna建库的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种ctdna建库试剂盒，包括发卡接头a、双链接头b和引物组；

所述发卡接头a包括接头a1和接头a2，接头a1和接头a2的序列分别为seqidno.1和seqidno.2，且接头a2的3′端用生物素修饰；

所述双链接头b包括接头b1和接头b2，接头b1和接头b2的序列分别为seqidno.3和seqidno.4；

所述引物组包括扩增引物和接头引物，扩增引物的序列号为seqidno.5，接头引物的序列为seqidno.6-7。

所述seqidno.1-7所示的引物如下表所示：

上述技术方案产生的有益效果在于：上述试剂盒提供了构建ctdna文库需要的接头和特异性引物，可高效的制备用于illumina等测序平台的ctdna文库，提高ctdna测序通量和测序准确性。

本发明的另一个目的是利用上述试剂盒构建ctdna文库的方法，包括如下步骤：

(1)提取游离ctdna片段；

(2)对ctdna片段进行去磷酸化与变性反应；

(3)将步骤(2)中的产物和t4dna连接酶、发卡接头a混合进行接头连接反应，并进行纯化；

(4)将步骤(3)中的产物和引物混合进行退火和延伸反应，并进行纯化；

(5)将步骤(4)中的产物和t4dna连接酶、双链接头b混合进行接头连接反应，并进行纯化、洗脱；

(6)将步骤(5)中的产物和接头引物混合进行pcr扩增，得到ctdna文库。

dna文库制备是高通量测序的核心环节，文库的产量与质量直接决定了测序数据的产量与质量。

附图说明

图1是本发明的建库方法原理图；

具体实施方式

为进一步说明本发明公开的技术方案，以下通过2个实施例来说明：

实施例1：ctdna建库试剂盒

本发明提供了一种ctdna建库试剂盒产品，在试剂盒中包括有：

用于连接和标识变性后的单链ctdna的发卡接头a，所述发卡接头a包括接头a1和接头a2，且接头a2的3′端用生物素修饰；

用于连接单链ctdna和发卡接头a或双链接头b的t4dna连接酶和用于t4dna连接酶的缓冲液；

用于连接双链ctdna的双链接头b，所述双链接头b包括接头b1和接头b2；

用于扩增ctdna的扩增引物cl130和用于扩增文库分子以进行文库检测的接头引物is7和is8：

其中，所述发卡接头a由如下方法制得：

对如下体系进行pcr，95℃反应10s，然后以0.1℃/s降温到14℃，得到双链接头a。

所述双连接头b由如下方法制得：

对如下体系进行pcr，95℃反应10s，然后以0.1℃/s降温到14℃，得到双链接头b。

反应体系如下：

所述试剂盒还包括如下试剂：

缓冲a液(50ml):

缓冲b液(50ml):

严谨性洗脱缓冲液(50ml):

49.5ml灭菌蒸馏水

250μl20％(wt/vol)sds

250μl20×sscbuffer；

终止液(100μl):

98μl0.5medta(ph8.0)

2μltween20；

te缓冲液(50ml):

49.4ml灭菌蒸馏水

500μl1mtris-hcl(ph8.0)

100μl0.5medta(ph8.0)；

tet缓冲液(50ml):

在使用中为了更加进一步增加试剂盒的便易性，在试剂盒中还可以添加如下成分：10×t4rnaligationbuffer，2％tween，fastap，peg-8000(50％)，t4dnaligase，100mmatp，5×klenowreactionbuffer，dntpmix(25mmeach)，extensionprimercl130(100μm)，1％tween-20，10×t4dnaligationbuffer，peg-4000(50％)，library，mix。

实施例2：

一种ctdna建库的方法，包括如下步骤：

(1)提取游离ctdna片段

根据qiagen公司提供的qiaampcirculatingnucleicacidkit(50)试剂盒的使用说明书，使用该试剂盒对血浆中游离的ctdna进行提取，得到ctdna。

(2)对ctdna片段进行去磷酸化与变性反应

向pcr管中加入如下成分：

使用pcr仪，先37℃反应10min，然后95℃反应2min；

取出pcr管，迅速将其放入到冰水混合物中，冰浴至少1min，取出后离心，室温保存，得到去磷酸化与变性后的ctdna。

(3)将步骤(2)中的产物和发卡接头a混合进行接头连接反应，并进行纯化

向pcr管中加入如下成分：

使用pcr仪，先37℃反应1h，然后95℃反应1min；

连接产物在-20℃下保存；

通过涡流悬浮磁珠，向1.5ml离心管中转移12μl磁珠；

用磁力架固定磁珠，移去上清液，用500μl的磁珠缓冲液分两次冲洗磁珠(每次250μl)；

使用pcr仪，连接产物在95℃下反应1min；

迅速对连接产物冰浴至少1min，取出离心；

将连接产物转移至含有磁珠的离心管中，室温旋转20min，离心；

用磁力架固定磁珠，移去上清液，磁珠依次用200μl的缓冲a液和缓冲b液冲洗。

(4)将步骤(3)中的产物和引物混合进行退火和延伸反应，并进行纯化

用磁力架固定磁珠，移去上清液，加入如下成分，操作过程中通过涡流悬浮磁珠；

将上述体系置于65℃的恒温金属浴中热处理2min，再冰浴1min；

加入2μl的klenowfragment，混匀，37℃的恒温金属浴中热处理27min，取出离心；

用磁力架固定磁珠，移去上清液，用200μl的缓冲a液冲洗一次；

将磁珠重悬在100μl的严谨性洗脱缓冲液中，然后将该体系置于45℃的恒温金属浴上热处理3min；

用磁力架固定磁珠，移去上清液，用200μl的缓冲b液冲洗一次。

(5)将步骤(4)中的产物和双链接头b混合进行接头连接反应，并进行纯化、洗脱

用磁力架固定磁珠，移去上清液，加入如下成分，操作过程中通过涡流悬浮磁珠；

对上述体系震荡混匀，加入2μlt4dnaligase，混匀，室温反应30min；

用磁力架固定磁珠，移去上清液，用200μl的缓冲a液冲洗一次；

将磁珠重悬在100μl的严谨性洗脱缓冲液中，然后将该体系置于45℃的恒温金属浴上热处理3min；

用磁力架固定磁珠，移去上清液，用200μl的缓冲b液冲洗一次；

用磁力架固定磁珠，移去上清液，向体系中加入25μl的tetbuffer，操作过程中用涡流保持磁珠悬浮；

将上述体系转移到0.2ml的pcr管中，离心；

使用pcr仪，使上述体系在95℃下反应1min；

迅速将上述体系放转移至96孔的磁力架上；并将上清液转移到0.2ml的pcr管中。

(6)将步骤(5)中的产物和接头引物混合进行pcr扩增，得到ctdna文库

向pcr管中加入如下成分：

使用pcr仪，反应程序如下：

(7)测序

通过illumina测序仪对pcr产物进行测序，证明了本发明的可行性。

序列表

<110>安徽安科生物工程(集团)股份有限公司

<120>ctdna建库的试剂盒和建库方法

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>10

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

pho-agatcggaag[c3spacer]10[teg-biotin](teg=triethyleneglycolspacer)10

<210>2

<211>10

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

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<210>3

<211>11

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

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<210>4

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

[phosphate]ggaagagcgtcgtgtagggaaagag*t*g*t*a(*=phosphothioatelinkage)29

<210>5

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct34

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

acactctttccctacacgac20

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gtgactggagttcagacgtgt21