猪分泌型IgA分泌片的制备与纯化复性的方法与流程

本发明属于重组蛋白领域，涉及猪分泌型iga分泌片的制备与纯化复性的方法。

背景技术：

分泌型iga(secretoryimmunoglobulina,siga)是粘膜表面的主要免疫球蛋白，它能与肠道、呼吸道等粘膜表面的病原体结合，防止病原体入侵机体。siga被称为防止粘膜感染的第一道防线，存在于肠道、呼吸道、泌尿道等外分泌液及初乳中，且初乳中的含量最高，生物学上siga含量的高低是评价机体粘膜免疫的重要指标。

分泌片(secretorycomponent，sc)是siga分子的重要组成部分，可用于区分siga和iga,可以通过sc检测siga的抗体水平。目前，sc可以从初乳中分离纯化获得，但猪初乳中sc的含量较低，纯化sc的步骤繁琐、成本高。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了猪siga分泌片的制备与纯化复性方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种猪分泌型iga分泌片的制备方法，包括以下步骤：

(1)提取样本rna，反转录合成cdna，以cdna作为模板，使用引物进行pcr扩增

反应获得扩增产物，将扩增产物切胶纯化并克隆到pmd18-t质粒上，筛选获得阳性质粒

pmd18-t-sc；

(2)用酶切下pmd18-t-sc质粒的sc基因片段，将sc基因片段克隆到pet-28a载体上，

获得阳性的重组质粒pet-28a-sc；

(3)将阳性的重组质粒pet-28a-sc转化到大肠杆菌，加入诱导剂诱导表达后收集菌体；

(4)将收集的菌体洗涤、破碎、离心，收集沉淀，并洗涤、溶解、过柱纯化得到纯化后

的重组蛋白；

(5)将纯化后的重组蛋白置于透析溶液透析；

(6)透析后将透析袋置于pbs过夜，即得猪分泌型iga分泌片。

进一步的，步骤(1)中，所述引物的核苷酸序列为：

sc-f:5’-ccggaattctcggtgtccatcagatgctacta-3’(seqidno:1)；

sc-r:5’-acgcgtcgacctgcaggtactccactcccacta-3’(seqidno:2)。

进一步的，步骤(1)中，所述扩增反应体系为：

进一步的，步骤(1)中，所述扩增反应程序为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，32个循环；72℃，10min。

进一步的，步骤(3)中，所述的诱导剂为iptg。

进一步的，步骤(3)中，所述的大肠杆菌为bl21(de3)、rosetta宿主菌的至少一种。

进一步的，步骤(3)中，所述诱导为加入1mmol/l的iptg在16℃诱导表达20小时。

进一步的，步骤(4)中，所述洗涤的洗涤液ph为7.5，其含有：2m尿素，0.1mtris-hcl，1mmedta，1mmpmsf，0.1mmdtt和1％triton-100。

进一步的，步骤(5)中，所述透析溶液包括透析溶液a～e，并依次使用透析溶液a～e进行透析，透析溶液a～e的配方如下所示：透析溶液a含有6murea，50mmtris，100mmnacl，1mmedta，5mmdtt；透析溶液b含有4murea，50mmtris，100mmnacl，1mmedta，5mmdtt；透析溶液c含有2murea，50mmtris，50mmnacl，1mmedta，5mmdtt，1mmgsh，0.5mmgssg，0.2～0.4marg；透析溶液d含有1murea，50mmtris，20mmnacl，1mmedta，5mmdtt，1mmgsh，1mmgssg，0.2～0.4marg和5％甘油；透析溶液e含有0.5murea，50mmtris，10mmnacl，1mmedta，5mmdtt，1mmgsh，1mmgssg，0.2～0.4marg和5％甘油。

进一步的，所述的透析为依次在4℃条件使用透析溶液a～e透析10小时，透析后置于ph7.4的pbs溶液中透析过夜。

上述任一项所述的方法制备的猪分泌型iga分泌片。

本发明的有益效果是：

本发明通过对不同原核表达载体和不同宿主菌的摸索，发现本发明的原核表达系统可以获得大量的sc蛋白，与现有技术的猪初乳纯化分离出的sc蛋白相比，无需精密的仪器设备，操作简便，成本低廉，表达量高；本发明制备的包涵体洗涤液去除菌体杂蛋白的效果较好，能够除去绝大部分的杂蛋白，纯化率达到85～90％，利于进行下一步的ni柱纯化；本发明制备的复性透析液降低生产成本，提高复性效率，克服了传统透析复性后复性蛋白浓度低、体积大、蛋白容易析出的缺点，透析液中加入精氨酸使透析时的蛋白浓度由0.1mg/ml～0.2mg/ml提高到2mg/ml～3mg/ml，浓度大大提高；原核表达的sc可用于制备抗sc蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体，为进一步建立siga的检测方法及粘膜免疫的研究奠定基础。

附图说明

图1为sc基因扩增的凝胶电泳图，其中m为dl2000dnamarker，1为sc基因的pcr扩增结果；

图2为pet28a-sc质粒(a)和pgex-4t-1-sc质粒(b)的酶切鉴定凝胶电泳图；

图3为不同载体间sc重组蛋白的表达，其中1为pet28a-sc质粒的诱导表达，2为pet28a-sc质粒未诱导，3为pgex-4t-1-sc质粒的诱导表达，4为pgex-4t-1-sc质粒的未诱导，m为proteinmarker；

图4为不同宿主菌间重组蛋白的表达，其中1为pet28a-sc质粒在bl21(de3)菌株中的诱导表达，2为pet28a-sc质粒在bl21(de3)菌株中未诱导，3为pet28a-sc质粒在rosetta菌株中的诱导表达，4为pet28a-sc质粒在rosetta菌株中未诱导，m为proteinmarker；

图5为sc重组蛋白分离纯化后的sds-page检测结果，其中m为proteinmarker，1为pet28a-sc重组蛋白的纯化；

图6为sc重组蛋白与抗siga的抗体特异性结合，其中m为proteinmarker，1为pet28a-sc重组蛋白与抗体特异性结合的westernblot分析，2为pet28a对照组空质粒的。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

sc蛋白原核表达重组质粒的构建

1.引物的设计

在ncbi网站下载野猪(susscrofa)多聚体免疫球蛋白受体(pigr)的基因序列，将目的基因序列运用生物信息学软件分析蛋白的信号肽、跨膜区及抗原性，根据目的基因序列，设计了大量用于sc基因pcr扩增的引物，经过大量筛选出一组灵敏度和特异性强的引物sc-f和sc-r，并且在引物sc-f和sc-r分别引入bamhi和sali酶切位点，引物的序列如下：

sc-f:5’-ccggaattctcggtgtccatcagatgctacta-3’(seqidno:1)；

sc-r:5’-acgcgtcgacctgcaggtactccactcccacta-3’(seqidno:2)。

2.sc基因片段的扩增

根据rna提取试剂盒说明书提取猪小肠组织的rna，然后进行反转录合成cdna，并利用高保真的dna聚合酶扩增sc基因片段，pcr扩增的条件为：

扩增反应程序为：95℃5min，1个循环；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃10min。

利用1％的琼脂糖凝胶对pcr扩增的条带大小进行鉴定，结果pcr扩增条带大小与预期大小相符(见图1)；再将目的基因的扩增条带进行切胶纯化，纯化后克隆到pgm18-t载体上，将获得的阳性质粒pgm18-t-sc进行酶切和测序鉴定。

3.重组质粒的构建

将测序正确的pgm18-t-sc质粒利用bamhi/sali限制性内切酶将sc基因片段切下，再分别克隆到pet28a和pgex-4t-1载体上，将获得的阳性重组质粒分别命名为pet28a-sc和pgex-4t-1-sc，经双酶切验证正确(如图2的a和b所示)。

实施例2

sc蛋白的融合表达

方法：将重组质粒pet28a-sc和pgex-4t-1-sc分别转化到表达菌株bl21(de3)中，挑取单个菌落于lb液体培养基中。检测lb液体培养基中的od260值，若od260为0.4～0.6时，加入终浓度为1mmol/l的iptg诱导，诱导条件为16℃诱导20小时，诱导后收集菌体，用sds-page对表达的重组蛋白进行鉴定。

结果：发现pet28a-sc(泳道1)的蛋白表达量高于pgex-4t-1-sc(泳道3)的蛋白表达量(图3),蛋白表达量高10-20％；再将表达量较高的pet28a-sc质粒分别转化到bl21(de3)和rosetta宿主菌中，发现rosetta宿主菌(泳道3)中的蛋白表达量高于bl21(de3)宿主菌(泳道1)，蛋白表达量高10-20％(图4)。

综上所述，本发明综合运用pet28a原核表达载体和rosetta宿主菌，可以使sc重组蛋白在体外得到大量表达，表达量比使用pgex-4t-1-sc表达载体以及bl21(de3)宿主菌高。

实施例3

sc蛋白的纯化与复性

1.sc蛋白的纯化

将实施例2的pet28a-sc质粒诱导表达后的rosetta宿主菌，用pbs洗涤2-3次后，通过超高压连续流细胞破碎机破碎菌体细胞，10000rpm离心15min，将上清和沉淀分开，并利用sds-page分别鉴定，发现重组蛋白sc主要以包涵体的形式存在。用本发明制备的洗涤液将包涵体洗涤3次后，可除去大部分菌体杂蛋白，比对照组的洗涤液纯化效果好。然后将包涵体蛋白用8m尿素溶解，再利用ni柱进一步纯化，发现几乎无杂带并且条带清晰可见，纯化率达到90％，说明蛋白纯化度高(如图5所示)。

包涵体洗涤液(ph为7.5)的组成成分为：2m尿素，0.1mtris-hcl，1mmedta，1mmpmsf，0.1mmdtt和1％triton-100。

对照组的洗涤液组成成分为：2m尿素，0.05mtris-hcl，0.15mnacl，0.5mmedta，1mmpmsf，0.1mmdtt和0.5％triton-100。

2.sc蛋白的复性

本发明采用透析的方法对重组蛋白进行复性，主要步骤如下：

(1)用去离子水冲洗透析袋，再放入到nahco3/edta煮沸，再用蒸馏水冲洗干净，将透析袋浸泡到蒸馏水中，4℃保存备用；

(2)将纯化后的浓度为2～3mg/ml的蛋白装入透析袋中，在4℃下依次放在透析溶液a～e中透析复性，每种透析溶液的透析时间为10小时，透析溶液a～e的ph均为8.0，透析液的组成成分如下：(urea为尿酸，arg为精氨酸)

(3)透析完成后将透析袋置于ph为7.4的pbs中透析过夜。

结果发现：添加了精氨酸后，透析过程中无蛋白析出。因此本发明添加了精氨酸的透析液，透析前的蛋白浓度可由0.1mg/ml～0.2mg/ml增加到2mg/ml～3mg/ml，克服了现有的透析中蛋白浓度低、蛋白体积大的缺点。

通过western-blot实验对复性后的重组sc蛋白进行鉴定，发现复性后的sc重组蛋白能够与抗siga的抗体特异性结合(如图6所示)。

本发明制备的sc重组蛋白可用于制备单克隆及多克隆抗体，为进一步建立检测siga的方法及粘膜免疫的研究奠定基础。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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广东海大畜牧兽医研究院有限公司

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