肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)结合剂类及其用途的制作方法
相关申请案的交叉引用
本申请案主张2015年2月3日提交申请的美国临时申请案第62/111,404号、2015年4月27日提交申请的美国临时申请案第62/153,272号、2015年4月28日提交申请的美国临时申请案第62/154,008号、2015年9月15日提交申请的美国临时申请案第62/218,956号及2015年11月24日提交申请的美国临时申请案第62/259,129号的优先权利益，各篇申请案的全部内容在此以引用方式并入本发明。
本发明大致上关于结合肿瘤坏死因子受体超家族成员的药剂，尤其是包含gitrl、ox40l或cd40l的胞外结构域的药剂。本发明亦关于使用该药剂来调节免疫反应及/或治疗疾病(诸如癌症)的方法。
背景技术：
免疫疗法的基础为操作及/或调节免疫系统，包括先天免疫反应及后天免疫反应。该免疫疗法的总体目标为藉由控制对“外来作用剂”(例如病原体或肿瘤细胞)的免疫反应来治疗疾病。然而，在某些情况下，免疫疗法是用于治疗可能由针对通常存在于体内的蛋白质、分子及/或组织的异常免疫反应产生的自体免疫疾病。免疫疗法可包括用于诱导或增强特定免疫反应或用于抑制或减少特定免疫反应的方法。
免疫系统为由许多细胞类型组成的高度复杂的系统，这些细胞类型包括，但不限于t细胞、b细胞、天然杀手细胞、抗原呈递细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞。这些细胞具有控制其交互作用和反应的复杂且微妙的系统。该细胞同时利用活化和抑制机制及反馈回路(feedbackloop)以约束反应且不允许不受控制的免疫反应的负面后果(例如自体免疫疾病或细胞因子风暴)。
癌症免疫监视的概念是基于免疫系统能够识别肿瘤细胞、启动免疫反应并抑制肿瘤发展及/或进展的理论。然而，很明显地，许多癌细胞已发展出逃避免疫系统的机制，该机制可允许肿瘤不受抑制地生长。癌症/肿瘤免疫疗法(免疫肿瘤学)聚焦于研发能够活化及/或增强免疫系统的新药剂及新型药剂，以达成更有效地攻击肿瘤细胞，导致增加肿瘤细胞灭杀及/或抑制肿瘤生长。
技术实现要素：
属于肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)及其配体(tnfsf)的蛋白质密切参与免疫系统细胞的活化、分化和存活。tnfrsf成员包括，但不限于4-1bb、baff、bcma、cd27、cd30、cd40、dcr3、dctrailrl、dctrailr2、dr3、dr6、eda2r、edar、fas(cd95)、gitr、hvem、淋巴毒素βr、ngfr、骨保护素(osteoprotegerin)、ox40、rank、relt、taci、tnfrh3、tnfrl、tnfr2、trailrl、trailr2、trailr3、trailr4、troy及tweakr。tnf族配体的受体为含有数个富含半胱胺酸的胞外结构域的寡聚型、第i型或第ⅲ型跨膜蛋白。这些受体中有数种亦含有胞内死亡结构域(dd)，该胞内死亡结构域在配体结合后募集凋亡蛋白酶(caspase)交互作用蛋白以起始凋亡蛋白酶活化的外部途径。其他缺乏死亡结构域的tnf超家族受体结合tnf受体相关因子并活化可导致增殖或分化的胞内信号传导途径。这些受体也可启动细胞凋亡，但其是经由间接机制如此做。除了调节凋亡外，若干tnf超家族受体参与调节免疫细胞功能，诸如b细胞稳态和活化、天然杀手细胞活化及t细胞共刺激。若干其他tnf超家族受体调节细胞类型特异性反应，诸如毛囊发育及破骨细胞发育。
tnfsf成员包括，但可不限于4-1bb配体、april、baff、cd27配体、cd30配体、cd40配体(cd40l)、eda、eda-a1、eda-a2、fas配体(cd95l)、gitr配体(gitrl)、light、淋巴毒素、淋巴毒素β、淋巴毒素α、ox40配体(ox40l)、tl1a、tnf-α、trail、trance和tweak。大多数tnf配体为第ⅱ型跨膜蛋白，其胞外结构域可被特定金属蛋白酶裂解以产生可溶性细胞因子。除了淋巴毒素β(其与tnf-β形成异质三聚体)和baff(其与april形成异质三聚体)外，经裂解和未经裂解的配体作为非共价同型三聚体为活跃的。tnf族配体的特征为具有不同长度的茎来连接跨膜结构域与核心区，其含有tnf族配体的标志结构，tnf同源结构域(thd)或tnf结构域。该tnf结构域为具有“卷筒夹心”拓扑结构的反平行β-折叠片三明治形式。β链内的保守型残基提供特定的跨次单位接触，此可稳定该三聚体结构。在连接相邻的β链的环中的序列为家族成员特异性的且对于赋予受体特异性是重要的。有趣的是，与其他tnf族成员相比较，gitrl(糖皮质激素诱导的tnf相关配体；tnfsf18)似乎为联结相对松散的三聚体并显示出亦以二聚体状态存在。再者，有证据表明，gitrl三聚体本身可联结以形成“超团簇(supercluster)”(zhouetal.,2008,pnas,105:5465-5470)。gitrl相交联以稳定三聚体的形成，而导致活性增强(wyzgoletal.,2009,j.immunol.183:1851-1861)。这些结果表明gitrl可以二聚体至三聚体、至三聚体的超团簇的一系列寡聚体状态存在，而这些状态可能导致一系列分别从微弱至强劲的gitr活性。
由于靶向tnfr超家族的成员的激动剂抗体通常为二聚体分子，该抗体的每个臂结合一个tnfr次单位，本发明者推测其可能无法完全再现该天然三聚体型tnf族成员的信号传导影响。鉴于该数据表明gitrl可透过改变gitrl的寡聚化状态来达到截然不同的信号传导水平，推测将该gitrl以稳定的三聚体形式呈现的治疗剂在引出信号传导时可能较激动剂gitr抗体更加活跃，因此该等三聚体型gitrl形式可能为优越的免疫治疗剂。此外，可提供二或多个gitrl三聚体的治疗剂被假设为可能影响gitrl“超团簇”且较激动剂gitr抗体更有效。相信，相较于tnfr激动剂抗体，对大多数(若非全部的话)tnfr配体而言此理论是正确的。
由于gitrl为组织相对松散的三聚体，因此达成有效生产稳定的治疗性gitrl三聚体的方式并不清楚。一种稳定该gitrl三聚体的策略为将该三聚体的三个次单位以单一多肽的形式表现。先前已证明tnf族成员可以单链三聚体形式表现(美国申请案刊物第2007/0286843和2011/0162095号)。然而，先前的单链tnf族成员三聚体变体的主要缺点为引进交互连接该三聚体的三个次单位的外源性接头序列。该等接头可将可能的不稳定性和易变性引入该三聚体及/或提供可能的免疫原性来源，因为该接头为外来序列。
本发明者检查人gitrl三聚体的晶体结构并观察到来自一个单体的n端氨基酸残基和来自第二单体的c端氨基酸残基彼此极为靠近。这表明非常短的氨基酸残基跨距(例如仅3-7个残基)可能足以桥接各单体之间的距离，因而不需要长的肽接头而能够生产单链gitrl三聚体。当进一步分析gitrl时，可察知该蛋白质的跨膜结构域和tnf同源结构域之间存有具数个氨基酸的“茎”。据推测，利用此短茎区桥接从gitrl单体的c端至相邻gitrl单体的n端的距离是可能的，并可以此方式构建完全没有外源肽接头序列的单链gitrl三聚体。
tnf超家族的其他配体具有类似结构，然而该茎区的大小和氨基酸组成随着各配体而变化。此外，各tnfsf配体的天然三聚体结构有点独特且在各tnfsf配体方面，各单链三聚体型融合蛋白正确折叠所需的茎区量可能不同。对于某些tnfsf配体而言，尤其是当该茎区很长时，仅可使用茎区的片段来产生单链三聚体。
本发明提供结合人肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)成员的各种多肽和药剂。如本文所使用的术语“药剂”包括，但不限于多肽、融合蛋白、同型二聚体分子及异质二聚体分子。于一些实施方式中，多肽或药剂结合人糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子相关蛋白(gitr)。于某些实施方式中，该多肽或药剂为gitr激动剂。于一些实施方式中，该结合gitr的多肽或药剂为可溶性gitr配体(gitrl)。于一些实施方式中，该多肽或药剂结合人ox40。于某些实施方式中，该多肽或药剂为ox40激动剂。于一些实施方式中，该结合ox40的多肽或药剂为可溶性ox40配体(ox40l)。于一些实施方式中，该多肽或药剂系结合人cd40。于某些实施方式中，该多肽或药剂为cd40激动剂。于一些实施方式中，该结合cd40的多肽或药剂为可溶性cd40配体(cd40l)。本发明提供使用本文所描述的多肽或药剂的方法。于一些实施方式中，本发明提供使用该多肽和药剂来进行癌症免疫疗法或免疫肿瘤学的方法。于一些实施方式中，该多肽和药剂系用于诱导、活化、促进、增加、加强或延长免疫反应的方法中。于一些实施方式中，该多肽和药剂系用于诱导、活化、促进、增加、加强或延长对癌症、肿瘤及/或肿瘤细胞的免疫反应的方法中。于一些实施方式中，该多肽和药剂用于抑制肿瘤或肿瘤细胞生长的方法中。于一些实施方式中，该多肽和药剂用于治疗癌症的方法中。于一些实施方式中，该方法包含抑制癌细胞生长。本发明还提供包含本文所描述的药剂的组成物。于一些实施方式中，该组成物为包含本文所描述的多肽和药剂的医药组成物。本发明还提供编码该多肽和药剂的多核苷酸及生产该药剂的方法。
于一方面中，本发明提供包含人肿瘤坏死因子受体配体超家族(tnfsf)蛋白的胞外结构域或其能够结合该tnfsf蛋白的受体的片段的第一、第二和第三拷贝的多肽。于一些实施方式中，本发明提供的多肽包含人肿瘤坏死因子受体配体超家族(tnfsf)蛋白的胞外结构域或其能够结合该tnfsf蛋白的受体的片段的第一、第二和第三拷贝，其中该胞外结构域或其片段的第一、第二或第三拷贝中至少一者包含该tnfsf蛋白的茎区(stalkregion)。于一些实施方式中，该tnfsf蛋白系选自由下列所组成的群组：gitrl、ox40l、4-1bb配体、april、baff、cd27配体、cd30配体、cd40配体、eda、eda-a1、eda-a2、fas配体、light、淋巴毒素、淋巴毒素β、淋巴毒素α、tl1a、tnf-α、trail、trance及tweak。于一些实施方式中，该tnfsf蛋白为gitrl且该胞外结构域的片段的任何拷贝为gitr结合片段。于某些替代的实施方式中，该tnfsf蛋白为ox40l且该胞外结构域的片段的任何拷贝为ox40结合片段。于某些替代的实施方式中，该tnfsf蛋白为cd40l且该胞外结构域的片段的任何拷贝为cd40结合片段。于一些实施方式中，该胞外结构域或其片段的至少一个、至少二个或所有三个拷贝包含该胞外结构域的茎区。于一些实施方式中，该多肽进一步包含fc区。本发明提供包含或由本文所描述的多肽所组成的多肽和药剂，包括，但不限于同型二聚体药剂、异质二聚体药剂及双特异性药剂。
于一些实施方式中，该多肽包含人肿瘤坏死因子受体配体超家族(tnfsf)蛋白的胞外结构域或其能够结合tnfsf蛋白受体的片段的第一、第二和第三拷贝，其中该胞外结构域或其片段的第一、第二或第三拷贝中至少一者包含该tnfsf蛋白的茎区。于一些实施方式中，该tnfsf蛋白的胞外结构域包含茎区或该茎区的片段。于一些实施方式中，该胞外结构域仅包含该茎区的短片段。于一些实施方式中，该茎区为约4至20个氨基酸。于一些实施方式中，该茎区为约4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。于一些实施方式中，该胞外结构域包含的茎区(例如4至10个氨基酸)紧接在tnf同源结构域的上游。于一些实施方式中，该胞外结构域包含茎区(例如4至10个氨基酸)，该茎区邻接该tnf同源结构域。
于另一方面中，本发明提供结合gitr(tnfrsf18)的多肽和药剂。于一些实施方式中，该多肽或药剂结合人gitr。于一些实施方式中，该多肽或药剂结合小鼠gitr。于一些实施方式中，该多肽或药剂为可溶性蛋白。于一些实施方式中，该多肽或药剂为结合人gitr的可溶性蛋白。于一些实施方式中，该多肽或药剂为融合多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个gitrl的胞外结构域或片段的拷贝。如本文所用户，蛋白质的胞外结构域或其片段的“拷贝”一般是指该蛋白的胞外结构域或其片段的单体。例如，gitrl的胞外结构域或其片段的拷贝一般是指该gitrl的胞外结构域或其片段的单体。因此，该胞外结构域的数个“拷贝”一般是指该gitrl的胞外结构域的二聚体(2个拷贝)或胞外结构域的三聚体(3个拷贝)。于一些实施方式中，该拷贝为已知序列的精确复制体的多肽(例如与该天然胞外结构域具有100％的序列同一性)。于某些替代的实施方式中，该拷贝的一或多者包含突变(诸如保守型取代)，只要该多肽或融合多肽保留结合该受体(即，gitr)的能力。例如，于某些实施方式中，该拷贝可为与该天然胞外结构域或其片段具有至少约98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个人gitrl的胞外结构域或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个小鼠gitrl的胞外结构域或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人gitrl的胞外结构域的至少第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人gitrl的胞外结构域或其gitr结合片段的第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人gitrl的胞外结构域的至少第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该胞外结构域中至少一者包含gitrl的“茎区”。于一些实施方式中，该gitrl的“茎区”为lqletak(seqidno：32)。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人gitrl的胞外结构域的至少第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中每一胞外结构域各自包含gitrl的“茎区”。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含该人gitrl的胞外结构域的第一、第二和第三拷贝中至少一者的单链融合多肽，其中仅该第二和第三胞外结构域包括gitrl的“茎区”。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人gitrl的胞外结构域或其片段的至少第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该多肽不包含任何肽接头。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人gitrl的胞外结构域或其片段的第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该多肽在该胞外结构域或其片段的任何拷贝之间不包含外源肽接头。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人gitrl的胞外结构域或其片段的第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该多肽在人gitrl的胞外结构域或其片段的第一拷贝和第二拷贝之间不包含外源肽接头。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人gitrl的胞外结构域或其片段的第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该多肽在人gitrl的胞外结构域或其片段的第二拷贝和第三拷贝之间不包含外源肽接头。
于一些实施方式中，该药剂(例如多肽)大致包含人gitrl的氨基酸71至199。于一些实施方式中，该多肽或药剂大致包含人gitrl的氨基酸71至199，其中该人gitrl的序列为uniprot第q9ung2号。于一些实施方式中，该药剂(例如多肽)包含至少一个seqidno：3或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该药剂(例如多肽)包含至少二个seqidno：3或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该药剂(例如多肽)包含三个seqidno：3的拷贝。于一些实施方式中，该药剂(例如多肽)包含至少一个seqidno：64的拷贝。于一些实施方式中，该药剂(例如多肽)包含至少二个seqidno：64的拷贝。于一些实施方式中，该药剂(例如多肽)包含三个seqidno：64的拷贝。于一些实施方式中，该药剂(例如多肽)包含seqidno：5。于一些实施方式中，该药剂(例如多肽)包含seqidno：66。于一些实施方式中，该药剂为融合多肽或融合蛋白。于一些实施方式中，该融合蛋白包含非gitrl多肽(即，异源蛋白质)。于一些实施方式中，该融合蛋白包含fc区。于一些实施方式中，该非gitrl多肽包含fc区。于一些实施方式中，该fc区来自igg1、igg2、igg3或igg4免疫球蛋白。于一些实施方式中，该fc区系选自由下列所组成的群组：seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13及seqidno：14。于一些实施方式中，该非gitrl多肽包含免疫球蛋白重链。于一些实施方式中，该免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链相联结。于一些实施方式中，该免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链形成抗原结合位点。于一些实施方式中，该非gitrl多肽包含单链抗体或fab。
于一些实施方式中，该药剂或多肽包含seqidno：6或seqidno：7。于一些实施方式中，该药剂包含由atcc保藏且指定编号为pta-122112的hgitrl-hlggl质粒编码的多肽。于一些实施方式中，该药剂或多肽包含seqidno：8或seqidno：9。
于另一方面中，本发明提供与seqidno：5或seqidno：66具有至少约90％的序列同一性的多肽以及包含该等多肽的多肽或药剂。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含由seqidno：5或seqidno：66所组成的多肽。
于进一步的方面中，本发明提供结合ox40(tnfrsf4)的多肽和药剂。于一些实施方式中，该多肽或药剂结合人ox40。于一些实施方式中，该多肽或药剂结合小鼠ox40。于一些实施方式中，该药剂为多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂为可溶性蛋白。于一些实施方式中，该多肽或药剂为结合人ox40的可溶性蛋白。于一些实施方式中，该多肽或药剂为融合多肽。于一些实施方式中，该药剂为(例如多肽)包含至少一个ox40l(tnfsf4)的胞外结构域或其ox40结合片段的拷贝。于一些实施方式中，该药剂为(例如多肽)包含至少一个人ox40l的胞外结构域或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个小鼠ox40l的胞外结构域或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人ox40l胞外结构域的至少第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人ox40l胞外结构域的至少第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该胞外结构域中至少一者包含ox40l的“茎区”。于一些实施方式中，该ox40l的茎区为qvshryp(seqidno：55)。于一些实施方式中，该ox40l的茎区为变体，包括，但不限于alqvshryp(seqidno：74)、shryp(seqidno：75)或hryp(seqidno：76)。如本文所使用者，该变体茎区由ox40l的氨基酸序列所组成，即，这些变体茎区不包含任何外源氨基酸，诸如外源接头。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人ox40l的胞外结构域的第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中每一胞外结构域各自包含ox40l的“茎区”或变体茎区。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人ox40l的胞外结构域的第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该第二和第三胞外结构域包括ox40l的“茎区”或变体茎区。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人ox40l的胞外结构域或其ox40结合片段的至少第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该多肽不包含任何肽接头。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人ox40l的胞外结构域或其ox40结合片段的第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该多肽在人ox40l的胞外结构域或其ox40结合片段的第一拷贝和第二拷贝之间不包含外源肽接头。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人ox40l的胞外结构域或其ox40结合片段的第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该多肽在人ox40l的胞外结构域或其ox40结合片段的第二拷贝和第三拷贝之间不包含外源肽接头。
于一些实施方式中，该药剂(例如多肽)约包含人ox40l的氨基酸50至183。于一些实施方式中，该药剂(例如多肽)约包含人ox40l的氨基酸51至183。于一些实施方式中，该药剂(例如多肽)约包含人ox40l的氨基酸53至183。于一些实施方式中，该多肽或药剂约包含人ox40l的氨基酸50至183、51至183或53至183，其中该人ox40l的序列为uniprot第p23510号。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：42或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：42或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：42的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：67或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：67或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：67的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：78或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：78或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：78的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：77或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：77或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：77的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：79或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：79或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：79的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：44。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：69。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：70。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：71。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：72。于一些实施方式中，该多肽或药剂为融合多肽或融合蛋白。于一些实施方式中，该融合蛋白包含非ox40l多肽(即，异源蛋白)。于一些实施方式中，该融合多肽包含fc区。于一些实施方式中，该非ox40l多肽包含fc区。于一些实施方式中，该fc区系来自igg1、igg2、igg3或igg4免疫球蛋白。于一些实施方式中，该fc区系选自由下列所组成的群组：seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13和seqidno：14。于一些实施方式中，该非ox40l多肽包含免疫球蛋白重链。于一些实施方式中，该免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链相联结。于一些实施方式中，该免疫球蛋白重链和轻链形成抗原结合位点。于一些实施方式中，该非ox40l多肽包含单链抗体或fab。
于一些实施方式中，该药剂或多肽包含seqidno：45或seqidno：46。于一些实施方式中，该药剂或多肽包含seqidno：47或seqidno：48。于一些实施方式中，该药剂或多肽包含seqidno：80或seqidno：81。
于一另外的方面中，本发明提供与seqidno：44、seqidno：69、seqidno：70、seqidno：71或seqidno：72具有至少约90％的序列同一性的多肽以及包含该等多肽的多肽或药剂。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含由seqidno：44、seqidno：69、seqidno：70、seqidno：71或seqidno：72所组成的多肽。
于进一步的方面中，本发明提供结合cd40(tnfrsf5)的多肽和药剂。于一些实施方式中，该多肽或药剂结合人cd40。于一些实施方式中，该多肽或药剂结合小鼠cd40。于一些实施方式中，该药剂为多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂为可溶性蛋白。于一些实施方式中，该多肽或药剂为结合人cd40的可溶性蛋白。于一些实施方式中，该多肽或药剂为融合多肽。于一些实施方式中，该药剂(例如多肽)包含至少一个cd40l(tnfsf5)的胞外结构域或其cd40结合片段的拷贝。于一些实施方式中，该药剂(例如多肽)包含至少一个人cd40l的胞外结构域或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个小鼠cd40l的胞外结构域或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人cd40l的胞外结构域的第一、第二和第三拷贝中至少一者的单链融合多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人cd40l的胞外结构域的至少第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该胞外结构域中至少一者包含cd40l的“茎区”。与某些其他tnfsf成员(即，gitrl和ox40l)相比较，该cd40l的茎区非常长，因此于一些实施方式中，人cd40l的胞外结构域仅包含该茎区的短片段。于一些实施方式中，该茎区包含约4至20个氨基酸。于一些实施方式中，该茎区包含约4至10个氨基酸。于一些实施方式中，该茎区包含tnf同源结构域上游的氨基酸(例如4至10个氨基酸)。于一些实施方式中，该茎区包含与tnf同源结构域相邻的氨基酸(例如4至10个氨基酸)。于一些实施方式中，该cd40l的茎区的片段为mqkgdq(seqidno：98)。于一些实施方式中，该cd40l的茎区的片段为femqkgdq(seqidno：99)、emqkgdq(seqidno：100)、qkgdq(seqidno：101)或kgdq(seqidno：102)。如本文所使用者，该茎区系由cd40l的氨基酸序列所组成，即，这些茎区不包含任何外源氨基酸，诸如外源接头。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人cd40l的胞外结构域的第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中每一胞外结构域各自包含该cd40l的茎区的片段。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人cd40l的胞外结构域的第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该第二和第三胞外结构域包括该cd40l的茎区的片段。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人cd40l的胞外结构域或其cd40结合片段的至少第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该多肽不包含任何肽接头。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人cd40l的胞外结构域或其cd40结合片段的第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该多肽在人cd40l的胞外结构域或其cd40结合片段的第一拷贝和第二拷贝之间不包含外源肽接头。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人cd40l的胞外结构域或其cd40结合片段的第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该多肽在人cd40l的胞外结构域或其cd40结合片段的第二拷贝和第三拷贝之间不包含外源肽接头。
于一些实施方式中，该药剂(例如多肽)约包含人cd40l的氨基酸113至261。于一些实施方式中，该药剂(例如多肽)约包含人cd40l的氨基酸111至261。于一些实施方式中，该药剂(例如多肽)约包含人cd40l的氨基酸112至261。于一些实施方式中，该药剂(例如多肽)约包含人cd40l的氨基酸114至261。于一些实施方式中，该药剂(例如多肽)约包含人cd40l的氨基酸115至261。于一些实施方式中，该多肽或药剂约包含人cd40l的氨基酸113至261、111至261、112至261、114至261或115至261，其中该人cd40l的序列为uniprot第p29965号。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：84或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：84或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：84的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：103或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：103或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：103的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：104或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：104或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：104的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：105或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：105或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：105的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：106或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：106或其片段的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：106的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：85。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：97。于一些实施方式中，该多肽或药剂为融合多肽或融合蛋白。于一些实施方式中，该融合蛋白包括非cd40l多肽(即，异源蛋白)。于一些实施方式中，该融合多肽包含fc区。于一些实施方式中，该非cd40l多肽包含fc区。于一些实施方式中，该fc区系来自igg1、igg2、igg3或igg4免疫球蛋白。于一些实施方式中，该fc区系选自由下列所组成的群组：seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13和seqidno：14。于一些实施方式中，该非cd40l多肽包含免疫球蛋白重链。于一些实施方式中，该免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链相联结。于一些实施方式中，该免疫球蛋白重链和轻链形成抗原结合位点。于一些实施方式中，该非cd40l多肽包含单链抗体或fab。
于一些实施方式中，该药剂或多肽包含seqidno：89或seqidno：90。于一些实施方式中，该药剂或多肽包含seqidno：91或seqidno：92。
于一另外的方面中，本发明提供与seqidno：85或seqidno：97具有至少约90％的序列同一性的多肽及包含该等多肽的多肽或药剂。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含由seqidno：85或seqidno：97所组成的多肽。
于各前述方面和实施方式及本文所描述的其他方面和实施方式中的一些实施方式中，该药剂或多肽为单价的。于一些实施方式中，该药剂为二价的。于一些实施方式中，该药剂或多肽为单特异性。于一些实施方式中，该药剂或多肽为双特异性。
于各前述方面和实施方式及本文所描述的其他方面和实施方式的一些实施方式中，该药剂或多肽为双特异性药剂。于一些实施方式中，该双特异性药剂为同型二聚体蛋白质。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂包含含有重链免疫球蛋白及tnfsf三聚体的多肽。于一些实施方式中，该重链免疫球蛋白与轻链相联结以形成抗原结合位点。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂包含含有抗体和单链tnfsf三聚体的多肽。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂包含含有抗体和单链gitrl三聚体的多肽。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂包含含有抗体和单链ox40l三聚体的多肽。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂包含含有抗体和单链cd40l三聚体的多肽。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂包含特异结合肿瘤抗原的抗体。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂包含特异结合pd-1、pd-l1、ctla-4、lag-3、tigit或tim3的抗体。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂结合gitr和pd-1。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂结合gitr和pd-l1。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂结合ox40和pd-1。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂结合ox40和pd-l1。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂结合cd40和pd-1。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂结合cd40和pd-l1。
于各前述方面和实施方式及本文所描述的其他方面和实施方式中的一些实施方式中，该药剂或多肽为异质二聚体双特异性药剂。于一些实施方式中，该双特异性药剂包含结合该tnfr超家族的一员的第一臂及结合第二标靶的第二臂。于一些实施方式中，该双特异性药剂包含结合gitr的第一臂及结合第二标靶的第二臂。于一些实施方式中，该双特异性药剂包含结合ox40的第一臂及结合第二标靶的第二臂。于一些实施方式中，该双特异性药剂包含结合cd40的第一臂及结合第二标靶的第二臂。于一些实施方式中，该双特异性药剂包含结合gitr的第一臂及包含来自抗体的抗原结合位点的第二臂。于一些实施方式中，该双特异性药剂包含结合ox40的第一臂及包含来自抗体的抗原结合位点的第二臂。于一些实施方式中，该双特异性药剂包含结合cd40的第一臂及包含来自抗体的抗原结合位点的第二臂。于一些实施方式中，该双特异性药剂包含第二臂，其中该抗原结合位点特异结合肿瘤抗原。于一些实施方式中，该双特异性药剂包含第二臂，其中该抗原结合位点特异结合pd-1、pd-l1、ctla-4、lag-3、tigit或tim3。于一些实施方式中，该双特异性药剂包含结合gitr的第一臂及包含免疫反应刺激剂的第二臂。于一些实施方式中，该双特异性药剂包含结合ox40的第一臂及包含免疫反应刺激剂的第二臂。于一些实施方式中，该双特异性药剂包含结合cd40的第一臂及包含免疫反应刺激剂的第二臂。于一些实施方式中，该免疫反应刺激剂可为标靶的激动剂。于一些实施方式中，该免疫反应刺激剂可为标靶的拮抗剂。于一些实施方式中，该免疫反应刺激剂系选自由下列所组成的群组：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、白介素3(il-3)、白介素12(il-12)、白介素1(il-1)、白介素2(il-2)、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、4-1bb配体、抗cd3抗体、抗ctla-4抗体、抗tigit抗体、抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗lag-3抗体及抗tim-3抗体。
于一些实施方式中，该双特异性药剂包含二个臂，其中每一个臂包含一个人ch3结构域，其中各ch3结构域系经修饰以促进异质二聚体的形成。于一些实施方式中，该第一和第二ch3结构域系使用旋钮入孔(knobs-into-holes)技术修饰。于一些实施方式中，该第一和第二ch3结构域系根据静电效果修饰。于一些实施方式中，该双特异性药剂包含二个臂，其中该第一臂包含第一人igg1恒定区，该第一人igg1恒定区在对应于seqidno：15的位置253和位置292处具有氨基酸取代，其中该氨基酸系被谷氨酸或天冬氨酸所取代，该第二臂包含第二人igg1恒定区，该第二人igg1恒定区在对应于seqidno：15的位置240和位置282处具有氨基酸取代，其中该氨基酸系被赖氨酸所取代。于一些实施方式中，该二个臂包含选自由下列所组成的群组的fc区：seqidno：58、seqidno：59、seqidno：60和seqidno：61。于一些实施方式中，该双特异性药剂包含二个臂，其中该第一臂包含第一人igg2恒定区，该第一人igg2恒定区在对应于seqidno：16的位置249和位置288处具有氨基酸取代，其中该氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸所取代，该第二臂包含第二人igg2恒定区，该第二人igg2恒定区在对应于seqidno：16的位置236和位置278处具有氨基酸取代，其中该氨基酸系被赖氨酸所取代。于一些实施方式中，该二个臂包含选自由下列所组成的群组的fc区：seqidno：26、seqidno：27、seqidno：28、seqidno：29、seqidno：30和seqidno：31。
于各前述方面和实施方式及本文所描述的其他方面和实施方式中的一些实施方式中，该药剂或多肽诱导、活化、促进、增加、增强及/或延长免疫反应。于一些实施方式中，该药剂增加th1-型免疫反应。于一些实施方式中，该药剂或多肽增加由细胞介导的免疫。于一些实施方式中，该药剂或多肽增加t细胞活性。于一些实施方式中，该药剂或多肽增加溶细胞性t细胞(ctl)活性。于一些实施方式中，该药剂或多肽增加天然杀手(nk)细胞活性。于一些实施方式中，该药剂或多肽降低调节性t细胞(treg)活性。于一些实施方式中，该药剂或多肽降低髓源抑制细胞(mdsc)活性。于一些实施方式中，该药剂或多肽增加记忆性t细胞的数量或百分比。于一些实施方式中，该药剂或多肽增加或增强有效的免疫反应而不会引起实质性副作用及/或基于免疫的毒性。于一些实施方式中，该药剂或多肽增加或增强有效的免疫反应而不会引起细胞因子释放综合征(crs)或细胞因子风暴(cytokinestorm)。于一些实施方式中，该药剂或多肽为由gitrl介导的信号传导的激动剂。于一些实施方式中，该药剂或多肽为gitr信号传导的激动剂。于一些实施方式中，该药剂或多肽为由ox40l介导的信号传导的激动剂。于一些实施方式中，该药剂或多肽为ox40信号传导的激动剂。于一些实施方式中，该药剂或多肽为由cd40l介导的信号传导的激动剂。于一些实施方式中，该药剂或多肽为cd40信号传导的激动剂。
于另一方面中，本发明提供包含本文所描述的多肽或药剂的组成物。本发明亦提供使用包含本文所描述的多肽或药剂的组成物的方法。
于另一方面中，本发明提供包含本文所描述的多肽或药剂及医药上可接受的载体的组成物。本发明亦提供治疗癌症及/或抑制个体(例如人)中的肿瘤生长的方法，其包含施用该个体有效量的包含本文所描述的多肽或药剂的组成物。本发明亦提供治疗个体(例如人)中的病毒感染的方法，其包含施用该个体有效量的包含本文所描述的多肽或药剂的组成物。
于各前述方面及本文所描述的其他方面和实施方式中的某些实施方式中，该药剂或多肽是经分离的。于某些实施方式中，该药剂或多肽为实质上纯质的。
于另一方面中，本发明提供包含编码本文所描述的多肽或药剂的多核苷酸的多核苷酸。于一些实施方式中，该多核苷酸是经分离的。于一些实施方式中，本发明提供包含该多核苷酸的载体及包含该载体及/或该多核苷酸的细胞。于一些实施方式中，本发明亦提供包含或生产如本文所描述的多肽或药剂的细胞。于一些实施方式中，该细胞为单株细胞系。
于另一方面中，本发明提供调节个体的免疫反应的方法。于一些实施方式中，本发明提供诱导个体的免疫反应的方法，其包含施用本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供活化个体的免疫反应的方法，其包含施用本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供促进个体的免疫反应的方法，其包含施用本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供增加个体的免疫反应的方法，其包含施用本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供增强个体的免疫反应的方法，其包含施用本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供延长个体的免疫反应的方法，其包含施用本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，该免疫反应系针对抗原刺激。于一些实施方式中，该抗原刺激为肿瘤或肿瘤细胞。于一些实施方式中，该抗原刺激为病原。于一些实施方式中，该抗原刺激为病毒。于一些实施方式中，该抗原刺激为经病毒感染的细胞。
于一些实施方式中，本发明提供增加免疫细胞活性的方法。于一些实施方式中，本发明提供增加免疫细胞活性的方法，其包含将细胞与有效量的本文所描述的多肽或药剂接触。于一些实施方式中，该免疫细胞为t细胞、nk细胞、单核细胞、巨噬细胞、抗原呈递细胞(apc)及/或b细胞。于一些实施方式中，本发明提供增加个体的nk细胞活性的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供增加个体的t细胞活性的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供增加个体的cd4+及/或cd8+t细胞活性的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供增加个体的ctl活性的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供增加个体的t细胞、ctl及/或nk细胞活化的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供增加个体的t细胞反应的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供抑制个体的treg活性的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供抑制个体的treg的抑制活性的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供抑制个体的mdsc活性的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供抑制个体的mdsc的抑制活性的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供诱导个体的免疫反应，但不引起实质性副作用及/或基于免疫的毒性的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供诱导个体的免疫反应，但不引起细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂。
于另一方面中，本发明提供诱导、活化、促进、增加、增强或延长个体的免疫反应的方法。于一些实施方式中，本发明提供诱导、活化、促进、增加、增强或延长个体的免疫反应的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供诱导、活化、促进、增加、增强或延长个体的免疫反应的方法，其包含施用该个体治疗有效量的能结合人gitr的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供诱导、活化、促进、增加、增强或延长个体的免疫反应的方法，其包含施用该个体治疗有效量的能活化或增强gitr信号传导的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供诱导、活化、促进、增加、增强或延长个体的免疫反应的方法，其包含施用该个体治疗有效量的能结合人ox40的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供诱导、活化、促进、增加、增强或延长个体的免疫反应的方法，其包含施用该个体治疗有效量的能活化或增强ox40信号传导的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供诱导、活化、促进、增加、增强或延长个体的免疫反应的方法，其包含施用该个体治疗有效量的能结合人cd40的多肽或药剂。于一些实施方式中，本发明提供诱导、活化、促进、增加、增强或延长个体的免疫反应的方法，其包含施用该个体治疗有效量的能活化或增强cd40信号传导的多肽或药剂。于一些实施方式中，该免疫反应系针对肿瘤细胞、肿瘤或癌症。于一些实施方式中，该免疫反应系针对病毒感染、病毒抗原或经病毒感染的细胞。
于一些实施方式中，本发明提供增加个体的t细胞活性的方法，其包含施用该个体治疗有效量的包含人肿瘤坏死因子受体配体超家族(tnfsf)蛋白的胞外结构域或其能够结合该tnfsf蛋白的受体的片段的第一、第二和第三拷贝的多肽。于一些实施方式中，本发明提供增加个体的ctl活性的方法，其包含施用该个体治疗有效量的包含人tnfsf蛋白的胞外结构域或其能够结合该tnfsf蛋白的受体的片段的第一、第二和第三拷贝的多肽。于一些实施方式中，本发明提供增加个体的nk活性的方法，其包含施用该个体治疗有效量的包含人tnfsf蛋白的胞外结构域或其能够结合该tnfsf蛋白的受体的片段的第一、第二和第三拷贝的多肽。于一些实施方式中，本发明提供降低或抑制个体的treg活性的方法，其包含施用该个体治疗有效量的包含人tnfsf蛋白的胞外结构域或其能够结合该tnfsf蛋白的受体的片段的第一、第二和第三拷贝的多肽。于一些实施方式中，本发明提供降低或抑制个体的mdsc活性的方法，其包含施用该个体治疗有效量的包含人tnfsf蛋白的胞外结构域或其能够结合该tnfsf蛋白的受体的片段的第一、第二和第三拷贝的多肽。于一些实施方式中，该tnfsf蛋白为gitrl。于一些实施方式中，该tnfsf蛋白为ox40l。于一些实施方式中，该tnfsf蛋白为cd40l。于本文所描述的方法的一些实施方式中，该个体患有癌症。
于一些实施方式中，本发明提供增加个体的t细胞活性的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的任何多肽、药剂及/或双特异性药剂。于一些实施方式中，本发明提供增加个体的ctl活性的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的任何多肽、药剂及/或双特异性药剂的多肽。于一些实施方式中，本发明提供增加个体的nk活性的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的任何多肽、药剂及/或双特异性药剂的多肽。于一些实施方式中，本发明提供降低或抑制个体的treg活性的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的任何多肽、药剂及/或双特异性药剂。于一些实施方式中，本发明提供降低或抑制个体的mdsc活性的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的任何多肽、药剂及/或双特异性药剂的多肽。于本文所描述的方法的一些实施方式中，该个体患有癌症。
于另一方面中，本发明提供增强对肿瘤的抗原特异性记忆反应的方法。于一些实施方式中，增强对肿瘤的抗原特异性记忆反应的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的任何多肽、药剂及/或双特异性药剂。于一些实施方式中，增强对肿瘤的抗原特异性记忆反应的方法包含施用个体治疗有效量的包含人tnfsf蛋白的胞外结构域或其能够结合该tnfsf蛋白的受体的片段的第一、第二和第三拷贝的多肽。于一些实施方式中，该tnfsf蛋白为gitrl。于一些实施方式中，该tnfsf蛋白为ox40l。于一些实施方式中，该tnfsf蛋白为cd40l。
于另一方面中，本发明提供活化或增强对肿瘤的持续性或长期免疫反应的方法。于一些实施方式中，活化或增强对肿瘤的持续性或长期免疫反应的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的任何多肽、药剂及/或双特异性药剂。于一些实施方式中，活化或增强对肿瘤的持续性或长期免疫反应的方法包含施用个体治疗有效量的包含人tnfsf蛋白的胞外结构域或其能够结合该tnfsf蛋白的受体的片段的第一、第二和第三拷贝的多肽。于一些实施方式中，该tnfsf蛋白为gitrl。于一些实施方式中，该tnfsf蛋白为ox40l。于一些实施方式中，该tnfsf蛋白为cd40l。
于另一方面中，本发明提供诱导能抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的持续性或长期免疫力的方法。于一些实施方式中，诱导能抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的持续性免疫力的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的任何多肽、药剂及/或双特异性药剂。于一些实施方式中，诱导能抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的持续性免疫力的方法包含施用个体治疗有效量的包含人tnfsf蛋白的胞外结构域或其能够结合该tnfsf蛋白的受体的片段的第一、第二和第三拷贝的多肽。于一些实施方式中，该tnfsf蛋白为gitrl。于一些实施方式中，该tnfsf蛋白为ox40l。于一些实施方式中，该tnfsf蛋白为cd40l。
于另一方面中，本发明提供抑制肿瘤生长的方法，其包含将肿瘤或肿瘤细胞与有效量的本文所描述的多肽或药剂接触。于一些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包含将肿瘤或肿瘤细胞与有效量的能结合人gitr的多肽或药剂接触。于一些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包含将肿瘤或肿瘤细胞与有效量的能结合人ox40的多肽或药剂接触。于一些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包含将肿瘤或肿瘤细胞与有效量的能结合人cd40的多肽或药剂接触。于一些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包含将肿瘤微环境与有效量的能结合人gitr的多肽或药剂接触。于一些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包含将肿瘤微环境与有效量的能结合人ox40的多肽或药剂接触。于一些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包含将肿瘤微环境与有效量的能结合人cd40的多肽或药剂接触。
于另一方面中，本发明提供抑制个体中肿瘤生长的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，抑制个体中肿瘤生长的方法包含施用该个体治疗有效量的能结合人gitr的多肽或药剂。于一些实施方式中，抑制个体中肿瘤生长的方法包含施用该个体治疗有效量的能结合人ox40的多肽或药剂。于一些实施方式中，抑制个体中肿瘤生长的方法包含施用该个体治疗有效量的能结合人cd40的多肽或药剂。
于另一方面中，本发明提供治疗个体的癌症的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，治疗个体的癌症的方法包含施用该个体治疗有效量的能结合gitr的多肽或药剂。于一些实施方式中，治疗个体的癌症的方法包含施用该个体治疗有效量的能结合ox40的多肽或药剂。于一些实施方式中，治疗个体的癌症的方法包含施用该个体治疗有效量的能结合cd40的多肽或药剂。
于另一方面中，本发明提供刺激个体的保护反应的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂与所研究的抗原的组合。于一些实施方式中，该所研究的抗原为肿瘤抗原或肿瘤相关抗原(taa)。于一些实施方式中，该所研究的抗原为癌细胞生物标记。于一些实施方式中，该所研究的抗原为癌干细胞标记。
于各前述方面和实施方式及本文所描述的其他方面和实施方式中的一些实施方式中，该方法进一步包含施用该个体至少一种另外的治疗剂。于一些实施方式中，该至少一种另外的治疗剂为化疗剂。于一些实施方式中，该至少一种另外的治疗剂为第二免疫反应刺激剂。于一些实施方式中，该至少一种另外的治疗剂为检查点抑制剂。于一些实施方式中，该免疫反应刺激剂系选自由下列所组成的群组：gm-csf、m-csf、g-csf、il-3、il-12、il-1、il-2、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、4-1bb配体、抗cd3抗体、抗ctla-4抗体、抗tigit抗体、抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗lag-3抗体和抗tim-3抗体。于一些实施方式中，该另外的治疗剂为抗pd-1抗体。于一些实施方式中，该另外的治疗剂为抗pd-l1抗体。
当本发明的方面和实施方式系就马库西(markush)群组或其他替代分组来描述时，本发明不仅包含整体列出的整个群组，亦包含个别群组的每一个成员和主要群组的所有可能子群，并包含该缺少一或多个群组成员的主要群组。本发明亦设想明确排除一或多个在申请专利的发明中的任一群组成员。
本发明提供以下实施方案：
实施方案1：一种多肽，其包含人肿瘤坏死因子受体配体超家族(tnfsf)蛋白的胞外结构域或其能够结合该tnfsf蛋白的受体的片段的第一、第二和第三拷贝，其中该胞外结构域或其片段的所述第一、第二或第三拷贝中至少一者包含该tnfsf蛋白的茎区，以及其中所述多肽在所述胞外结构域或其片段的第一拷贝和第二拷贝之间或者第二拷贝和第三拷贝之间不包含接头。
实施方案2：根据实施方案1所述的多肽，其中该tnfsf蛋白是gitrl。
实施方案3：根据实施方案1所述的多肽，其中所述tnfsf蛋白是gitrl，并且所述多肽包含seqidno：5或seqidno：66。
实施方案4：根据实施方案1所述的多肽，其中所述tnfsf蛋白是gitrl，并且所述茎区包含lqletak(seqidno:32)。
实施方案5：根据实施方案1所述的多肽，其还包含非tnfsf多肽。
实施方案6：根据实施方案5所述的多肽，其中所述非tnfsf多肽是：
(a)人fc区；
(b)免疫球蛋白重链；
(c)单链抗体；或者
(d)fab。
实施方案7：根据实施方案6所述的多肽，其中所述免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链相联结以形成抗原结合位点。
实施方案8：根据实施方案7所述的多肽，其中所述人fc区选自：seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13和seqidno:14。
实施方案9：根据实施方案1所述的多肽，其特异性结合糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(gitr)。
实施方案10：根据实施方案8所述的多肽，其包含seqidno：7或seqidno：9。
实施方案11：根据实施方案1所述的多肽，其激活gitr和/或诱导gitr活性。
实施方案12：根据实施方案2所述的多肽，其中所述胞外结构域或其片段的所述第一、第二或第三拷贝中至少一者包含seqidno：3。
实施方案13：根据实施方案3所述的多肽，其中所述多肽包含seqidno：66。
实施方案14：能结合人gitr的多肽，其包含seqidno：5。
实施方案15：根据实施方案14所述的多肽，其还包含人fc区或免疫球蛋白重链。
实施方案16：一种多肽，其是由经atcc保藏且被指定编号为pta-122112的质粒编码的。
实施方案17：一种同型二聚体药剂，其包含根据实施方案1所述的多肽。
实施方案18：一种异质二聚体药剂，其包含根据实施方案1所述的多肽。
实施方案19：一种双特异性药剂，其包含：
a)根据实施方案1所述的多肽，及
b)来自抗体的抗原结合位点。
实施方案20：根据实施方案19所述的双特异性药剂，其中该药剂为同型二聚体或异质二聚体。
实施方案21：根据实施方案19所述的双特异性药剂，其中该抗原结合位点特异结合肿瘤抗原。
实施方案22：根据实施方案1至16中的任一项所述的多肽或根据实施方案17-21中的任一项所述的药剂，其：
(a)增加由细胞介导的免疫力；
(b)增加t细胞活性；
(c)增加溶胞性t细胞(ctl)活性；
(d)增加天然杀手细胞(nk)活性；
(e)降低或抑制调节性t细胞(treg)活性；
(f)降低或抑制髓源抑制细胞(mdsc)活性；
(g)增加有效的免疫反应而不会引起实质性副作用及/或基于免疫的毒性；及/或
(h)增加有效的免疫反应而不会引起细胞因子释放综合征(crs)或细胞因子风暴。
实施方案23：一种细胞，其生产根据实施方案1至16中的任一项所述的多肽或根据实施方案17-21中的任一项所述的药剂。
实施方案24：一种医药组合物，其包含根据实施方案1至16中的任一项所述的多肽或根据实施方案17-21中的任一项所述的药剂和医药上可接受的载体。
实施方案25：一种多核苷酸，其包含编码根据实施方案1至16中的任一项所述的多肽或根据实施方案17-21中的任一项所述的药剂的核苷酸序列。
实施方案26：一种多核苷酸，其包含选自由下列所组成的群组的核苷酸序列：seqidno：22，seqidno：23，seqidno：24，和seqidno：25。
实施方案27：一种载体，其包含根据实施方案26所述的多核苷酸。
实施方案28：一种经分离的细胞，其包含根据实施方案26所述的多核苷酸。
实施方案29：一种经分离的细胞，其包含根据实施方案27所述的载体。
实施方案30：根据实施方案1-16中的任一项所述的多肽或根据实施方案17-21中的任一项所述的药剂在制备用于诱导、活化、促进、增加、增强或延长个体的免疫反应的药物中的用途。
实施方案31：根据实施方案1-16中的任一项所述的多肽或根据实施方案17-21中的任一项所述的药剂在制备用于增加个体的t细胞活性的药物中的用途。
实施方案32：根据实施方案1至16中的任一项所述的多肽或根据实施方案17-21中的任一项所述的药剂在制备用于增加个体的溶胞性t细胞(ctl)活性的药物中的用途。
实施方案33：根据实施方案1至16中的任一项所述的多肽或根据实施方案17-21中的任一项所述的药剂在制备用于增加个体的天然杀手细胞(nk)活性的药物中的用途。
实施方案34：根据实施方案1至16中的任一项所述的多肽或根据实施方案17-21中的任一项所述的药剂在制备用于降低或抑制个体的调节性t细胞(treg)活性的药物中的用途。
实施方案35：根据实施方案1至16中的任一项所述的多肽或根据实施方案17-21中的任一项所述的药剂在制备用于降低或抑制个体的髓源抑制细胞(mdsc)活性的药物中的用途。
实施方案36：根据实施方案1至16中的任一项所述的多肽或根据实施方案17-21中的任一项所述的药剂在制备用于抑制个体中肿瘤生长的药物中的用途。
实施方案37：根据实施方案1至16中的任一项所述的多肽或根据实施方案17-21中的任一项所述的药剂在制备用于治疗个体中的癌症的药物中的用途。
实施方案38：根据实施方案37所述的用途，其中该癌症是选自由下列所组成的群组：结肠直肠癌、结肠癌、卵巢癌、胰脏癌、肺癌、肝癌、乳癌、肾脏癌、前列腺癌、胃肠癌、黑色素瘤、子宫颈癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、淋巴瘤及白血病。
实施方案39：根据实施方案37所述的用途，其还包括至少一种另外的治疗剂。
实施方案40：根据实施方案39所述的用途，其中所述另外的治疗剂是化疗剂或免疫反应刺激剂。
实施方案41：根据实施方案39所述的用途，其中所述另外的治疗剂是抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla-4抗体或抗tigit抗体。
实施方案42：一种质粒，其被寄存在atcc并指定编号为pta-122112。
附图说明
第1a-1f图.(第1a图)显示描绘人gitrl的膜锚定的三聚体拓扑结构的代表性绘图。(第1b图)显示人gitrl的氨基酸序列(seqidno：1)。该胞质区、信号锚区及胞外结构域经标记出。该胞外结构域内的“茎区”下方划线。(第1c图)天然gitrl的示意图。(第1d图)膜结合的单链gitrl三聚体的示意图，该单链gitrl三聚体包含gitrl的信号锚区及gitrl的胞外结构域的三个拷贝。(第1e图)可溶性单链gitrl三聚体的示意图，该可溶性单链gitrl三聚体包含gitrl的胞外结构域的三个拷贝。(第1f图)可溶性单链gitrl三聚体-fc融合多肽的示意图，该可溶性单链gitrl三聚体-fc融合多肽包含连接fc区的gitrl胞外结构域的三个拷贝。
第2图.facs分析膜结合单链gitrl三聚体和可溶性gitr。以编码膜结合的单链人gitrl三聚体的表现载体及编码绿荧光蛋白(gfp)的第二表现载体瞬时转染hek293细胞。将经转染的细胞与可溶性人gitr-fc融合蛋白一起培育并藉由流式细胞仪分析。经由观察在facs图的嵌入框内的细胞来确定阳性结合。
第3图.被提出含有一或多个单链gitrl三聚体的某些分子的示意图。这些绘图为被提出含有一或多个单链tnfsf配体三聚体的另外分子的代表图。
第4图.facs分析膜结合的gitr及可溶性单链gitrl三聚体-fc融合肽。以编码全长小鼠gitr和gfp的表现载体瞬时转染hek293细胞。将经转染的细胞与小鼠gitrl融合多肽336b1、336b2、336b3、336b4、336b6、336b10、非gitrl融合多肽336b5及抗gitr抗体dta-1一起培育并藉由流式细胞仪分析。经由观察在facs图的嵌入框内的细胞来确定阳性结合。
第5图.鼠gitrl三聚体和人gitrl三聚体融合多肽结合gitr的剂量反应。图形显示具鼠igg2afc结构域的单链鼠gitrl三聚体和具人igg1fc结构域的单链人gitrl三聚体的流式细胞术结合分析。以编码人或鼠gitr和gfp的表现载体瞬时转染hek293细胞。将经转染的细胞与指定的融合蛋白一起培育并藉由流式细胞术分析。经由观察在facs图的嵌入框内的细胞来确定阳性结合。
第6图.gitr信号传导的活化。图形显示单链mgitrl三聚体-fc融合蛋白活化mgitr信号传导的能力的分析。将以nf-κb荧光素酶报告子基因和mgitrcdna稳定转染的hek293细胞平皿接种在96孔盘中并与单链小鼠gitrl三聚体-fc融合336b3、单链小鼠gitrl三聚体-fc融合336b6、抗mgitr抗体dta-1或对照抗体一起培育。24小时后测定荧光素酶活性。dta-1为激动剂抗体且被包含作为阳性对照组。
第7图.gitr信号传导的活化。图形显示单链hgitrl三聚体-fc融合蛋白活化hgitr信号传导的能力的分析。将以nf-κb荧光素酶报告子基因和gitrcdna稳定转染的hek293细胞平皿接种在96孔盘中并与单链人gitrl三聚体-fc融合336b11一起培育。24小时后测定荧光素酶活性。
第8a和8b图.藉由单链gitrl三聚体-fc融合多肽抑制肿瘤生长。将鼠结肠肿瘤细胞系ct26.wt经由皮下植入balb/c小鼠(n＝10只小鼠/组)中。在第7、10、14和17天为小鼠注射0.25mg/小鼠的单链mgitrl三聚体-fc融合蛋白336b3、抗mgitr抗体dta-1或对照抗体。监测肿瘤生长并在指定的时间点以电子测径器测量肿瘤体积。数据系以注射后的天数的肿瘤体积(mm3)显示。(第8a图)每一组的平均值±sem。(第8b图)来自以336b3治疗的组别及以dta-1治疗的组别的每一个别小鼠的肿瘤体积。
第9a和9b图.ifn-γ和il-10的elispot分析。从以抗mgitr抗体dta-1、mgitrl三聚体fc336b3或对照组治疗的ct26.wt荷瘤小鼠的脾脏收获细胞。(第9a图)显示生产ifn-γ的细胞的数目。(第9b图)显示生产il-10的细胞的数目。
第10图.nk细胞的细胞毒性分析。从以抗mgitr抗体dta-1、mgitrl三聚体fc336b3或对照组治疗的ct26.wt荷瘤小鼠的脾脏收获细胞。以10μm钙黄绿素(calcein)am标记ct26.wt靶细胞并与脾细胞混合(e：t比为25：1)。收获上清液并在荧光计上，在485nm的激发波和535nm的发射波处定量钙黄绿素释放。
第11图.调节性t细胞(treg)分析。从未经治疗的小鼠的脾脏纯化初始t细胞。以5μm的紫色追踪染料标记这些纯化的t细胞。将经2×105vtd标记的t细胞与经抗cd3和抗cd28抗体涂覆的小珠一起培育，以刺激细胞增殖。使用小鼠treg分离试剂盒，从以mgitrl三聚体-fc336b3、抗mgitr抗体dta-1或对照组治疗的ct26.wt荷瘤小鼠的脾脏分离出treg细胞。为测定treg对t细胞增殖的影响，将受刺激的经vtd标记的t细胞(效应子)与该分离出的脾脏treg一起培养(效应子：treg比为1：0.5)。在第4天，清洗细胞并将其与抗小鼠cd4或抗小鼠cd8抗体一起培育。使用bdfacscantoⅱ仪器及bdfacsdiva软件v6.1.3，藉由facs分析评估细胞。
第12图.髓源抑制细胞(mdsc)分析。从未经治疗的小鼠的脾脏纯化初始t细胞。以5μm的紫色追踪染料标记这些纯化的t细胞。将经2×105vtd标记的t细胞与经抗cd3和抗cd28抗体涂覆的小珠一起培育，以刺激细胞增殖。使用小鼠mdsc分离试剂盒，从以mgitrl三聚体-fc336b3、抗mgitr抗体dta-1或对照组治疗的ct26.wt荷瘤小鼠的脾脏分离出mdsc。将经刺激的经vtd标记的t细胞(效应子)与经分离的脾脏mdsc一起培养(效应子：mdsc比为1：1)。在第4天，清洗细胞并将其与抗小鼠cd4或抗小鼠cd8抗体一起培育。使用bdfacscantoⅱ仪器及bdfacsdiva软件v6.1.3，藉由facs分析评估细胞。
第13图.藉由单链gitrl三聚体-fc融合多肽抑制肿瘤生长。将renca细胞经由皮下植入balb/c小鼠(n＝10只小鼠/组)中。在第7、11和14天为小鼠注射0.25mg/小鼠的单链mgitrl三聚体-fc融合蛋白336b3、抗mgitr抗体dta-1或对照抗体。监测肿瘤生长并在指定的时间点以电子测径器测量肿瘤体积。数据系以注射后的天数的肿瘤体积(mm3)显示。
第14a和14b图.细胞的细胞毒性分析。(第14a图)天然杀手细胞活性。从以抗mgitr抗体dta-1、mgitrl三聚体-fc336b3或对照组治疗的带有renca肿瘤的小鼠脾脏收获细胞。以10μm的钙黄绿素am标记yac-1靶细胞并与脾脏细胞混合(e：t为25：1和50：1)。收获上清液并在荧光计上，在485nm的激发波和535nm的发射波处定量钙黄绿素释放。(第14b图)t细胞的细胞毒性分析。从以抗mgitr抗体dta-1、mgitrl三聚体-fc336b3或对照组治疗的带有renca肿瘤的小鼠脾脏收获细胞。以10μm的钙黄绿素am标记renca靶细胞并与脾脏细胞混合(e：t为25：1)。收获上清液并在荧光计上，在485nm的激发波和535nm的发射波处定量钙黄绿素释放。
第15a-15g图.藉由单链gitrl三聚体-fc融合多肽抑制肿瘤生长-剂量研究。将鼠结肠肿瘤细胞系ct26.wt经由皮下植入balb/c小鼠(n＝10只小鼠/组)中。以30、12.5、6.25、3或0.5mg/kg的mgitrl三聚体-fc336b3治疗小鼠或未经治疗的。藉由腹膜内注射每周给予小鼠二次剂量，共6个剂量。监测肿瘤生长并在指定的时间点以电子卡尺测量肿瘤体积。(第15a-15f图)各治疗组中的个别小鼠的肿瘤体积。(第15g图)每一治疗组的平均肿瘤体积。
第16a-16g图.藉由单链gitrl三聚体-fc融合多肽抑制肿瘤生长-剂量研究。将鼠结肠肿瘤细胞系ct26.wt经由皮下植入balb/c小鼠中(n＝10只小鼠/组)。以2.5mg/kg的mgitrl三聚体-fc336b3、12.5mg/kg的mgitrl三聚体-fc治疗小鼠或不治疗(n＝10/组)。以2.5mg/kg的单一剂量治疗小鼠、以2.5mg/kg的剂量每二周治疗小鼠一次、以2.5mg/kg的剂量每周治疗小鼠一次、以2.5mg/kg的剂量每周治疗小鼠二次或以12.5mg/kg的剂量每周治疗小鼠二次，仅3个剂量。(第16a-16f图)各治疗组中的个别小鼠的肿瘤体积。(第16g图)每一治疗组的平均肿瘤体积。
第17a-17f图.藉由单链gitrl三聚体-fc蛋白抑制免疫细胞耗尽的小鼠体内的肿瘤生长。为了耗尽活体内的特定细胞群，在肿瘤细胞植入之前2天和1天，经由腹膜内注射给予balb/c小鼠抗cd4抗体(500ug/剂量)、抗cd8抗体(500ug/剂量)、抗cd4和抗cd8抗体(各500ug/剂量)的组合、抗脱唾液酸基gm-1抗体(25μl)或对照igg2抗体(lft-2；500ug/剂量)，然后在移植后1天及实验期间每周二次给予额外注射。将鼠结肠肿瘤细胞系ct26.wt经由皮下植入耗尽细胞的小鼠(30,000个细胞/小鼠)中。以2.5mg/小鼠的mgitrl三聚体-fc336b3或对照抗体治疗小鼠(每组n＝10)。每周藉由腹膜内注射治疗小鼠二次。监测肿瘤生长并在指定的时间点以电子卡尺测量肿瘤体积。(第17a-17e图)各治疗组中的个别小鼠的肿瘤体积。(第17f图)各治疗组的平均肿瘤体积。
第18a-18d图.藉由单链gitrl三聚体-fc蛋白和抗pd-1抗体抑制体内肿瘤生长。将鼠腺癌细胞系renca经由皮下植入(5×105细胞/小鼠)balb/c小鼠中。以12.5mg/kg的单链mgitrl三聚体-fc336b3、抗pd-1抗体、336b3和抗pd-1抗体的组合或对照抗体治疗小鼠(每组n＝20)。藉由腹膜内注射每周施用小鼠336b3二次，仅共3个剂量，每周施用抗pd-1抗体二次共3周。监测肿瘤生长并在指定的时间点以电子卡尺测量肿瘤体积。(第18a-18d图)各治疗组中的个别小鼠的肿瘤体积。
第19a-19e图.藉由单链gitrl三聚体-fc蛋白和抗pd-l1抗体抑制体内肿瘤生长。将鼠结肠肿瘤细胞系ct26.wt经由皮下植入(30,000个细胞/小鼠)balb/c小鼠中。以0.25mg/小鼠的单链mgitrl三聚体-fc336b3、抗pd-l1抗体、336b3和抗pd-l1抗体的组合或对照抗体治疗小鼠(每组n＝10至20)。藉由腹膜内注射每周施用小鼠336b3二次，仅共3个剂量，每周施用抗pd-l1抗体二次，共3周。监测肿瘤生长并在指定的时间点以电子卡尺测量肿瘤体积。第19a-19d图.各治疗组中的个别小鼠的肿瘤体积。第19e图.以ct26.wt细胞重新挑战后的肿瘤生长。
第20a-20e图.藉由单链gitrl三聚体-fc蛋白和抗pd-1抗体抑制体内肿瘤生长。将鼠黑色素瘤细胞系b16-f10细胞经由皮下植入(5000个细胞/小鼠)c57bl/6小鼠中。以5mg/kg的单链mgitrl三聚体-fc336b3、10mg/kg的抗mpd-1抗体、336b3和抗mpd-1抗体的组合或对照抗体治疗小鼠(每组n＝10)。每周经由腹膜内注射施用小鼠336b3、抗mpd-1抗体或对照抗体二次。监测肿瘤生长并在指定的时间点以电子卡尺测量肿瘤体积。(第20a-20d图)各治疗组中的个别小鼠的肿瘤体积。(第20e图)各治疗组的平均肿瘤体积。
第21a-21e图.藉由单链gitrl三聚体-fc和ox40l三聚体-fc融合多肽抑制肿瘤生长。将鼠结肠肿瘤细胞系ct26.wt经由皮下植入balb/c小鼠中(n＝10小鼠/每组)。每周为小鼠注射二次0.25mg/小鼠的单链mox40l三聚体-fc融合蛋白、抗mox40抗体、mgitrl三聚体-fc、抗mgitr抗体dta-1或对照抗体，共3个剂量。监测肿瘤生长并在指定的时间点以电子卡尺测量肿瘤体积。第21a图.来自以对照抗体治疗的组别的各个别小鼠的肿瘤体积。第21b图.来自以mox40l-fc治疗的组别的个别小鼠的肿瘤体积。第21c图.来自以激动剂抗ox40抗体治疗的组别的各个别小鼠的肿瘤体积。第21d图.三组小鼠的平均肿瘤体积。第21e图.五组小鼠的平均肿瘤体积。数据是以注射后的天数的肿瘤体积(mm3)显示。
第22图.藉由单链gitrl三聚体-fc融合多肽抑制肿瘤生长-在b16-b10小鼠模型中的剂量研究。将b16-f10细胞经由皮下注射入c57bl/6小鼠中并允许其生长至约84mm3的平均大小。以0.5mg/kg的抗mgitr抗体dta-1、30、10、2.5、0.5及0.05mg/kg的单链mgitrl三聚体-fc336b3、两种不同的对照抗体或盐水治疗小鼠(每组n＝10)。经由腹膜内注射每周施用小鼠336b3、抗体或盐水一次。监测肿瘤生长并以电子卡尺测量肿瘤体积。结果是以各治疗组中肿瘤小于300mm3的百分比表示。
第23a-23l图.细胞因子的制造。将鼠结肠肿瘤细胞系ct26.wt经由皮下植入balb/c小鼠中(n＝10小鼠/每组)。每周为小鼠注射二次0.25mg/小鼠的单链mox40l三聚体-fc融合蛋白、抗mox40抗体、mgitrl三聚体-fc、抗mgitr抗体dta-1或对照抗体，共3个剂量。监测肿瘤生长并在指定的时间点以电子卡尺测量肿瘤体积。在第26天，从每一治疗组的小鼠脾脏收获细胞。在有或无肿瘤特异性cd8+t细胞肽ah-1的存在下培养细胞。48小时后，按照制造商的说明，使用用于
第24a-24d图.藉由单链gitrl三聚体-fc蛋白抑制肿瘤生长。将ct26.wt细胞经由皮下植入(30,000个细胞/小鼠)balb/c小鼠中，并使其生长至肿瘤平均大小为约300mm3。以0.25mg/小鼠的单链mgitrl三聚体-fc336b3、激动剂抗gitr抗体dta-1或对照抗体治疗小鼠(每组n＝17)。藉由腹膜内注射每周施用小鼠二次剂量，共3个剂量。监测肿瘤生长并以电子卡尺测量肿瘤体积。如可能的话，追踪小鼠超过80天以评估长期存活。第24a图.来自以对照抗体治疗的组别的个别小鼠的肿瘤体积。第24b图.来自以mgitrl-fc治疗的组别的个别小鼠的肿瘤体积。第24c图.来自以激动剂抗gitr抗体dta-1治疗的组别中的个别小鼠的肿瘤体积。第24d图.所有治疗组的生存曲线。
第25图.在人化小鼠模型中藉由单链gitrl三聚体-fc蛋白抑制肿瘤生长。经由皮下途径为人化小鼠注射源自患者的黑色素瘤肿瘤细胞(omp-m9，75,000细胞/小鼠)。令肿瘤生长16天，直到其肿瘤平均大小达到约60mm3。将荷瘤小鼠随机分成2组(每组n＝3只小鼠)。以对照蛋白或hgitrl三聚体-fcomp-336b11治疗荷瘤小鼠。每周给予小鼠10mg/kg的剂量二次。监测肿瘤生长并在指定的时间点以电子卡尺测量肿瘤体积。
实施方式
发明的详细描述
本发明提供新颖药剂，包括，但不限于调节免疫反应的多肽、可溶性蛋白质、融合蛋白、同型二聚体双特异性分子及异质二聚体双特异性分子。该药剂包括为参与细胞交互作用和免疫反应信号传导的tnf超家族成员的受体和配体的激动剂及拮抗剂。本发明亦提供相关的多肽和多核苷酸、包含该药剂的组成物及生产该药剂的方法。本发明提供筛选可调节免疫反应的药剂的方法。本发明提供使用该新颖药剂的方法，诸如活化免疫反应的方法、刺激免疫反应的方法、促进免疫反应的方法、增加免疫反应的方法、活化nk细胞的方法、活化t细胞(包括ctl)的方法、增加nk细胞的活性的方法、增加t细胞(包括ctl)的活性的方法、促进nk细胞的活性的方法、促进t细胞(包括ctl)的活性的方法、抑制treg的活性的方法、抑制mdsc的活性的方法、抑制肿瘤生长的方法、治疗癌症的方法及/或治疗病毒疾病的方法。本发明进一步提供抑制免疫反应的方法、遏制免疫反应的方法、降低t细胞的活性的方法及/或治疗自体免疫疾病的方法。
i.定义
为了协助理解本发明，下文中定义一些术语和短语。
如本文所使用的术语“激动剂”和“激动性”系指或描述能够直接或间接地实质上诱导、活化、促进、增加或增强靶的及/或途径的生物活性的多肽或药剂。本文所使用的术语“激动剂”系包括任何部分或完全诱导、活化、促进、增加或增强所研究的蛋白质或其他靶的的活性的药剂。
如本文所使用的术语“拮抗剂”和“拮抗性”系指或描述能够直接或间接地部分或完全阻断、抑制、减少或中和靶的及/或途径的生物活性的多肽或药剂。本文所使用的术语“拮抗剂”系包括任何部分或完全阻断、抑制、减少或中和所研究的蛋白质或其他靶的的活性的药剂。
如本文所使用的术语“调节(modulation)”和“调节(modulate)”系指生物活性中的变化或改变。调节包括，但不限于刺激活性或抑制活性。调节可能为活性增加或活性降低、结合特性中的变化或与所研究的蛋白质、途径、系统或其他生物靶的的活性相关的生物、功能或免疫性质中的任何其他变化。
如本文所使用的术语“可溶性蛋白”系指可以可溶形式从细胞中分泌出的蛋白质或其片段。
如本文所使用的术语“融合蛋白”或“融合多肽”系指由包含具有至少二个基因的核苷酸序列的核酸分子表现的杂合蛋白。
如本文所使用的术语“接头”或“接头区”系指插入第一多肽(例如gitrl胞外结构域或其片段的拷贝)和第二多肽(例如fc区)之间的接头。于一些实施方式中，该接头为肽接头。接头不应不利地影响该多肽的表现、分泌或生物活性。较佳地，接头并非抗原性且不会引起免疫反应。
如本文所使用的术语“抗体”系指能识别且透过至少一个抗原结合位点特异结合靶(诸如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的任何组合)的免疫球蛋白分子，其中该抗原结合位点通常系在该免疫球蛋白分子的可变区内。如本文所使用者，该术语包含完整的多株抗体、完整的单株抗体、抗体片段(诸如fab、fab'、f(ab')2和fv片段)、单链fv(scfv)抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、嵌合型抗体、人化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白及任何其他经修饰的包含抗原结合位点的免疫球蛋白分子，只要该抗体表现出所需的生物活性。根据其分别被称为α，δ，ε，γ和μ的重链恒定结构域的特性，抗体可为五大类免疫球蛋白中的任一类：iga、igd、ige、igg和igm，或其子类别(同种型)(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)。不同类别的免疫球蛋白具有不同且为人熟知的次单位结构和三维构型。抗体可为裸露或与其他分子(包括，但不限于毒素和放射性同位素)共轭结合。
术语“抗体片段”系指完整抗体的一部分且系指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括，但不限于fab、fab'、f(ab')2及fv片段、直线型抗体、单链抗体及从抗体片段形成的多特异性抗体。如本文所使用的“抗体片段”包含抗原结合位点或抗原决定部位结合位点。
术语抗体的“可变区”系指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区(单独或组合)。一般而言，重链和轻链的可变区各由4个框构区(fr)和三个互补决定区(cdr)(亦称为“高度可变区”)所组成。每条链中的cdr保持与框构区极为接近，并与来自另一链的cdr促成形成抗体的抗原结合位点。决定cdr的技术至少有两种：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即，kabatetal.,1991,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thedition,nationalinstitutesofhealth,bethesdamd.)和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(a1lazikanietal.,1997,j.mol.biol.,273:927-948)。此外，本技术中有时使用这二两种方法的组合来决定cdr。
如本文所使用的术语“单株抗体”系指参与高度特异性识别及结合单一抗原决定簇或抗原决定部位的同种抗体群。此与通常包括针对不同抗原决定簇的不同抗体混合物的多株抗体相反。术语“单株抗体”同时包含完整和全长的单株抗体及抗体片段(例如fab、fab'、f(ab')2、fv)、单链(scfv)抗体、包含抗体片段的融合蛋白及任何其他经修饰的包含抗原结合位点的免疫球蛋白分子。此外，“单株抗体”系指藉由任何数目的技术(包括，但不限于生产杂交瘤、噬菌体选择、重组表现及转基因动物)生产该等抗体。
如本文所使用的术语“人化抗体”系指含有最小非人序列的特异性免疫球蛋白链、嵌合型免疫球蛋白或其片段的非人(例如鼠)形式的抗体。通常，人化抗体为其中该cdr的残基被具有所研究的特异性、亲和力及/或结合能力的来自非人物种(例如小鼠、大鼠、兔或仓鼠)的cdr残基取代的人免疫球蛋白。于一些情况中，该人免疫球蛋白的fv框构区残基被来自非人物种的抗体中的对应残基替换。该人化抗体可藉由取代在fv框构区中及/或在该经置换的非人残基内的额外残基来进一步修饰以精制和优化抗体特异性、亲和力及/或结合能力。该人化抗体可包含含有全部或基本上全部的对应于非人免疫球蛋白的cdr的可变结构域，尽管全部或基本上全部的框构区为人免疫球蛋白序列的框构区。于一些实施方式中，该可变结构域包含人免疫球蛋白序列的框构区。于一些实施方式中，该可变结构域包含人免疫球蛋白共有序列的框构区。该人化抗体亦可包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区或结构域(fc)，通常为人免疫球蛋白所具有的。人化抗体通常被认为与嵌合抗体不同。
如本文所使用的术语“人抗体”系指由人产生的抗体或使用本技术中已知的任何技术生产的具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体。
如本文所用的术语“嵌合型抗体”系指其中该免疫球蛋白分子的氨基酸序列系源自二或多种物种的抗体。通常，该轻链和重链二者的可变区系对应于具有所需特异性、亲和力及/或结合能力的源自一种哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔，等)物种的抗体的可变区，而该恒定区，系与源自另一物种(通常为人类)的抗体中的序列同源，以避免在该物种中引发免疫反应。
术语“抗原决定部位”和“抗原决定簇”在本文中可互换使用且系指能被特定抗体识别及特异结合的抗原部分。当该抗原为多肽时，抗原决定部位可从连续氨基酸形成及藉由蛋白质的三级折叠从并列的非连续氨基酸形成。从连续氨基酸形成的抗原决定部位(亦称为线性抗原决定部位)在蛋白质变性时通常被保留，而藉由三级折叠形成的抗原决定部位(亦称为构象抗原决定部位)在蛋白质变性通常会丧失。抗原决定部位在独特的空间构象中通常包括至少3个，更常为至少5、6、7或8至10个氨基酸。
术语“选择性结合”或“特异结合”意指该多肽或药剂与抗原决定部位、蛋白质或靶的分子的交互作用较与其他物质(包括相关和不相关的蛋白质)的交互作用更频繁、更迅速、持续时间更长、亲和力更强或一些上述情况的组合。于某些实施方式中，“特异结合”系指，例如该多肽或药剂以约0.lmm或更小的kd结合蛋白质或靶，但更常为小于约1μm。于某些实施方式中，“特异结合”意指该多肽或药剂以至少约0.lμm或更小、至少约0.0lμm或更小或至少约lnm或更小的kd结合蛋白质或靶。由于不同物种中的同源蛋白之间的序列同一性，特异结合可包括能识别一种以上的物种中的蛋白质或靶的多肽或药剂。同样地，由于不同蛋白质的多肽序列的某些区内的同源性，特异结合可包括能识别一种以上的蛋白质或靶的多肽或药剂。可理解的是，于某些实施方式中，特异结合第一靶的多肽或药剂可能或可能不特异结合第二靶。因此，“特异结合”不一定需要(尽管其可包括)专一结合，即，结合单一靶。因此，于某些实施方式中，该多肽或药剂可特异结合一个以上的靶。于某些实施方式中，多个靶可结合至该多肽或药剂上的相同抗原结合位点。例如，在某些情况中，抗体可包含二个完全相同的抗原结合位点，其各自特异结合在二或更多个蛋白质上的相同的抗原决定部位。于某些替代的实施方式中，抗体可为双特异性且包含至少二个具有不同特异性的抗原结合位点。一般而言(但不一定)，“结合”的引用意指“特异结合”。
本文中，术语“多肽”和“肽”及“蛋白质”可互换使用且系指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可为直链型或支链型，其可包含经修饰的氨基酸且其可被非氨基酸中断。该术语亦包含已经天然修饰或藉由干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记组分共轭结合。该定义中亦包括，例如含有一或多个氨基酸类似物(包括，例如非天然氨基酸)及本技术中已知的其他修饰的多肽。可理解的是，由于本发明的多肽可以抗体或该免疫球蛋白超家族的其他成员为基础，因此于某些实施方式中，该多肽可以单链或经联结的链的形式存在。
本文中，术语“多核苷酸”和“核酸”及“核酸分子”可互换使用且系指任何长度的核苷酸聚合物，包括dna和rna。该核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基及/或其类似物，或为任何可藉由dna或rna聚合酶被并入聚合物的底物。
在二或多个核酸或多肽的背景下，术语“完全相同的”或“同一性”百分比系指当比较和比对(若需要时，引入间隙)最大相符时，不考虑任何保守型氨基酸取代作为序列同一性的一部分时，二或多个序列或子序列为相同序列或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基。同一性百分比可使用序列比较软件或算法或藉由目测检查来测量。本技术熟知可用于取得氨基酸或核苷酸序列的比对的各种算法及软件。这些包括，但不限于blast、align、megalign、bestfit、gcgwisconsinpackage及其变体。于一些实施方式中，本发明的二个核酸或多肽为实质上相同的，此意指当使用序列比较算法或藉由目测检查来测量以比较和比对最大相符时，该二个核酸或多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，且于一些实施方式中为至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸残基同一性。于一些实施方式中，同一性存在于其长度为至少约10个残基、至少约20个残基、至少约40至60个残基、至少约60至80个残基或残基长度为这些数目之间的任何整数值的整个氨基酸序列区。于一些实施方式中，同一性存在于长度超过60至80个残基，例如至少约80至100个残基的整个区中，且于一些实施方式中，在所比较的序列的全长中(诸如靶蛋白或抗体的编码区)，该序列基本上为完全相同。于一些实施方式中，同一性存在于其长度为至少约10个碱基、至少约20个碱基、至少约40至60个碱基、至少约60至80个碱基或碱基长度为介于这些数目之间的任何整数值的整个核苷酸序列区。于一些实施方式中，同一性存在于长度超过60至80个碱基(诸如至少约80至1000个碱基或更多)的整个区中，且于一些实施方式中，在所比较的序列(诸如编码所研究的蛋白的核苷酸序列)的全长中，该序列基本上为完全相同的。
“保守型氨基酸取代”为其中一个氨基酸残基被另一具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸取代。本技术中已大致定义具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、未带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、白氨酸、异白氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异白氨酸)及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸取代酪氨酸为保守型取代。一般而言，多肽、可溶性蛋白及/或本发明抗体的序列中的保守型取代不会废除含有该氨基酸序列的多肽、可溶性蛋白或抗体结合该靶结合位点。不会排除结合的氨基酸保守型取代的鉴定方法为本技术所周知。
如本文所使用的术语“载体”意指能够投递且通常能在宿主细胞中表现一或多个所研究的基因或序列的构建体。载体的实例包括，但不限于病毒载体、裸露的dna或rna表现载体、质粒、黏粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂联结的dna或rna表现载体及封装在脂质体中的dna或rna表现载体。
“经分离”的多肽、可溶性蛋白、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组成物为非自然界中存在的形式的多肽、可溶性蛋白、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组成物。经分离的多肽、可溶性蛋白、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组成物包括那些已被纯化至不再为其在自然界中存在的形式的程度者。于一些实施方式中，该经分离的多肽、可溶性蛋白、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组成物实质上为纯质的。
如本文所使用的术语“实质上纯质的”系指至少50％纯质(即，不含污染物)、至少90％纯质、至少95％纯质、至少98％纯质或至少99％纯质的物质。
如本文所使用的术语“免疫反应”包括来自先天免疫系统和后天免疫系统二者的反应。其包括由细胞介导及/或体液的免疫反应。其包括t细胞和b细胞反应以及来自免疫系统其他细胞(诸如天然杀手(nk)细胞、单核细胞巨噬细胞，等)的反应。
如本文所使用的术语“癌症”和“癌性”系指或描述哺乳动物的生理状态，该哺乳动物中有细胞群的特征为不受调节的细胞生长的。癌症的实例包括，但不限于癌、母细胞瘤、肉瘤及血液系统癌症，诸如淋巴瘤和白血病。
如本文所使用的术语“肿瘤”和“瘤”系指从过度的细胞生长或增殖，无论是良性(非癌性)或恶性(癌性)(包括癌前期病变)导致的任何组织团块。
如本文所使用的术语“转移”系指癌症从起源部位扩散或移转至身体的其他区域，并有类似的癌病变在新的位置发展的过程。“转移的”或“转移性”细胞为与邻近细胞失去黏着接触并经由血液或淋巴从疾病的原发部位迁移以侵袭相邻的身体结构的细胞。
术语“癌干细胞”和“csc”及“肿瘤干细胞”和“肿瘤起始细胞”在本文中可互换使用且系指来自癌症或肿瘤的细胞，该细胞：(1)具有广泛增殖能力；2)能够不对称地细胞分裂以产生一或多种类型的分化细胞后代，其中该分化的细胞具有降低的增殖或发育潜能；及(3)能够对称地细胞分裂以供自我更新或自我维护。与无法形成肿瘤的大多数肿瘤细胞相比较，这些性质赋予癌干细胞在连续移植入适当的宿主(例如小鼠)后形成或建立肿瘤或癌症的能力。癌干细胞经历自我更新和以混乱方式分化，以形成具有可在突变发生时随时间改变的异常细胞类型的肿瘤。
术语“癌细胞”和“肿瘤细胞”系指源自癌症或肿瘤或癌前期病变的全部细胞群，包括非致瘤性细胞(其包含主要的癌症细胞群)及致瘤性干细胞(癌干细胞)。当单指那些缺少更新和分化的能力的细胞时，本文所使用的术语“癌细胞”或“肿瘤细胞”将以术语“非致瘤性”修饰以区分那些来自癌干细胞的肿瘤细胞。
如本文所使用的术语“致瘤性”系指癌干细胞的功能特性，包括自我更新(产生额外的致瘤性癌干细胞)及增殖以产生所有其他肿瘤细胞(产生分化，因此为非致瘤性的肿瘤细胞)的性质。
如本文所使用的术语“致瘤性”系指来自肿瘤的随机细胞样本在连续移植入适当的宿主(例如小鼠)时形成可触知的肿瘤的能力。
术语“个体”系指任何动物(例如哺乳动物)，包括，但不限于将为特定治疗的接受者的人、非人灵长类动物、犬、猫、囓齿动物，等。通常，指称人个体的术语“个体”和“患者”在本文中可互换使用。
术语“医药上可接受的”系指由联邦政府或州政府的监管机构核准或可被核准的，或美国药典或其他被普遍承认的用于动物，包括人的药典中所列的物质。
术语“医药上可接受的赋形剂、载体或佐剂”或“可接受的医药载体”系指可与本发明的至少一种药剂一起施用个体且当以足够递送治疗效果的剂量施用时不会破坏本发明的药剂的药理活性且无毒性的赋形剂、载体或佐剂。一般而言，熟习本技术的人士和美国fda认为任何调制剂的医药上可接受的赋形剂、载体或佐剂为任何调配物的无活性成分。
术语“有效量”或“治疗有效量”或“治疗效果”系指能有效“治疗”个体(例如哺乳动物)的疾病或病症的本文所描述的多肽或药剂(例如融合蛋白、可溶性受体、抗体、多肽、多核苷酸、小有机分子或其他药物)的量。在癌症或肿瘤的情况中，治疗有效量的多肽或药剂(例如多肽、可溶性蛋白或抗体)具有治疗效果，因此可加强免疫反应、加强抗肿瘤反应、增加免疫细胞的溶细胞活性、增加免疫细胞杀死肿瘤细胞、减少肿瘤细胞的数量；降低致瘤性、致瘤频率或致瘤能力；减少癌干细胞的数目或频率；减少肿瘤尺寸；减少癌细胞群；抑制或阻止癌细胞浸润入周围器官中，包括，例如癌症扩散入软组织和骨骼中；抑制和阻止肿瘤或癌细胞转移；抑制和阻止肿瘤或癌细胞生长；将与癌症相关的一或多种症状减轻至某种程度；降低发病率和死亡率；提升生活质量；或此等效果的组合。
术语“治疗(treating或treatment或totreat)”或“缓解(alleviating或toalleviate)”系同时指(1)治愈、减缓、减轻诊断的病理状况或病症的症状及/或停止诊断的病理状况或病症进展的治疗措施，(2)防止或减缓靶病理状况或病症进展的预防性或防止措施。因此，那些需要治疗者包括那些已患有病症者；倾向患有病症者；及欲预防体内的病症者。在癌症或肿瘤的情况中，若患者显示出下列的一或多项，则该个体被成功地根据本发明的方法“治疗”：免疫反应增加、抗肿瘤反应增加、免疫细胞的溶细胞活性增加、免疫细胞杀死肿瘤细胞增加、癌细胞数目减少或完全不存在；肿瘤尺寸缩小；癌细胞浸润到周围器官中，包括癌细胞扩散入软组织和骨骼中受抑制或不存在；肿瘤或癌细胞转移受抑制或不存在；癌症生长受抑制或不存在；与特定癌症相关的一个多种症状缓解；发病率和死亡率降低；生活质量提升；致瘤性降低；癌干细胞的数目或频率减少；或某些效果的组合。
除非上下文另有明确说明，否则如本公开内容和申请专利范围中所使用的单数形式“一(a、an)”及“该”包括复数形式。
可理解的是，本文中凡是以语言“包含”描述的实施方式，亦提供以“由…组成”及/或“基本上由…组成”描述的其他类似的实施方式。亦可理解的是，本文中凡是以语言“基本上由…组成”描述的实施方式，亦提供以“由…组成”的其他类似的实施方式。
如本文所使用者，“约”或“近似”数值或参数的引用包括(且描述)针对该数值或参数的实施方式。例如，称为约“x”的描述包括“x”的描述。
本文中，在短语，诸如“a及/或b”中所使用的术语“及/或”意图同时包括a和b；a或b；a(单独)；和b(单独)。同样地，在短语，诸如“a、b及/或c”中所使用的术语“及/或”意图包含下列每一实施方式：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；和c(单独)。
ⅱ.tnf受体超家族结合剂
本发明提供结合肿瘤坏死因子受体超家族成员(tnfrsf)的药剂。tnfrsf成员包括，但可不限于4-1bb、baff、bcma、cd27、cd30、cd40、dcr3蛋白、dctrailrl、dctrailr2、dr3、dr6、eda2r、edar、fas(cd95)、gitr、hvem、淋巴毒素βr、ngfr、骨保护素、ox40、rank、relt、taci、tnfrh3、tnfr1、tnfr2、trailrl、trailr2、trailr3、trailr4、troy及tweakr。于一些实施方式中，该多肽或药剂结合由糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(gitr)。本文中，这些药剂可称为“gitr结合剂”。于某些实施方式中，该多肽或药剂为gitr激动剂。于某些实施方式中，该多肽或药剂诱导、活化、增强、增加及/或延长gitr信号传导。于一些实施方式中，该多肽或药剂结合ox40。本文中，这些多肽或药剂可称为“ox40结合剂”。于某些实施方式中，该多肽或药剂为ox40激动剂。于某些实施方式中，该多肽或药剂诱导、活化、增强、增加及/或延长ox40信号传导。于一些实施方式中，该多肽或药剂结合cd40。本文中，这些多肽或药剂可称为“cd40结合剂”。于某些实施方式中，多肽或药剂cd40激动剂。于某些实施方式中，该多肽或药剂诱导、活化、增强、增加及/或延长cd40信号传导。
于某些实施方式中，该药剂为多肽。于某些实施方式中，该药剂为可溶性蛋白。于一些实施方式中，该药剂为融合多肽。于一些实施方式中，该药剂为可溶性配体或可溶性“共同受体”。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含人gitrl的片段。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含人ox40l的片段。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含人cd40l的片段。于一些实施方式中，与该包含整个胞外结构域的可溶性药剂相比较，该人gitrl、ox40l或cd40l的胞外结构域的片段可显示出改变的生物学活性(例如蛋白质半衰期增加)。
于一些实施方式中，该多肽或药剂包含人肿瘤坏死因子受体配体超家族(tnfsf)蛋白或其能够结合该tnfsf蛋白的受体的片段的第一、第二和第三拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含人肿瘤坏死因子受体配体超家族(tnfsf)蛋白或其能够结合该tnfsf蛋白的受体的片段的第一、第二和第三拷贝，其中该胞外结构域或其片段的第一、第二或第三拷贝中至少一者包含该tnfsf蛋白的茎区。于一些实施方式中，该tnfsf蛋白是选自由下列所组成的群组：gitrl、ox40l、4-1bb配体、april、baff、cd27配体、cd30配体、cd40配体(cd40l)、eda、eda-a1、eda-a2、fas配体(cd95l)、light、淋巴毒素、淋巴毒素β、淋巴毒素α、tl1a、tnf-α、trail、trance及tweak。
本技术中已知人gitrl的全长氨基酸(aa)序列(uniprot第q9ung2号)且以seqidno：1提供于本文中。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个gitrl的胞外结构域或其gitr结合片段的拷贝。于某些实施方式中，该gitrl的“胞外结构域”为seqidno：1的约氨基酸71至199。本技术的技术人员所理解的对应于gitrl胞外结构域的确切氨基酸可能不同。因此，本文所描述的胞外结构域的n端及/或c端可延伸或缩短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸。如本文所使用的gitrl的胞外结构域通常包含“茎区”和“tnf族结构域”。因此，于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂的gitrl的胞外结构域的拷贝包含gitrl的“茎区”。gitrl的“茎区”为seqidno：1的约氨基酸71至77。该茎区约包含氨基酸lqletak(seqidno：32)。gitrl的“tnf同源结构域”或“tnf族结构域”为seqidno：1的约氨基酸89至192。gitrl的tnf同源结构域包含seqidno：33。于某些实施方式中，多肽或药剂包含gitrl的胞外结构域或其gitr结合片段的第一、第二和第三拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：3的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：3的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：3的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：64的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：64的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：64的拷贝。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含为单链多肽形式的gitrl的胞外结构域或其gitr结合片段的至少第一、第二和第三拷贝。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：5。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含与seqidno：5具有至少约90％的序列同一性的多肽。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含与seqidno：5具有至少约95％的序列同一性的多肽。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含与seqidno：5具有至少96％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含基本上由seqidno：5所组成的多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含由seqidno：5所组成的多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：66。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含与seqidno：66具有至少约90％的序列同一性的多肽。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含与seqidno：66具有至少约95％的序列同一性的多肽。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含与seqidno：66具有至少约96％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含基本上由seqidno：66所组成的多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含由seqidno：66所组成的多肽。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含gitrl的胞外结构域的片段的至少第一、第二和第三拷贝。于一些实施方式中，该gitrl的胞外结构域的拷贝系由相同氨基酸序列所组成。于一些实施方式中，该gitrl的胞外结构域的拷贝并非完全相同。于一些实施方式中，与野生型序列相比较，该gitrl的胞外结构域的拷贝包含在人gitrl的氨基酸序列中取代、删除及/或增加氨基酸。
于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人gitrl的胞外结构域或其片段的第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人gitrl的胞外结构域或其片段的第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该胞外结构域中至少一者包含gitrl的茎区。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人gitrl的胞外结构域或其片段的第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该胞外结构域中至少二者包含gitrl的茎区。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人gitrl的胞外结构域或其片段的第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中各胞外结构域均包含gitrl的茎区。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人gitrl的胞外结构域的第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该多肽不包含任何肽接头(即，外源肽接头)。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人gitrl的胞外结构域的第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该多肽在该胞外结构域或其片段的任何拷贝之间不包含外源肽接头。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人gitrl的胞外结构域的第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中各胞外结构域均茎区且该多肽不包含任何肽接头(即，外源肽接头)。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人gitrl的胞外结构域或其gitr结合片段的第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该胞外结构域的第二和第三拷贝包含茎区。于一些实施方式中，gitrl的多肽或胞外结构域包含seqidno：1的氨基酸71至199。于一些实施方式中，该gitrl的胞外结构域包含seqidno：3。于一些实施方式中，该gitrl的胞外结构域包含seqidno：64。于一些实施方式中，该单链融合多肽包含seqidno：5。于一些实施方式中，该单链融合多肽系由seqidno：5所组成。于一些实施方式中，该单链融合多肽包含seqidno：66。于一些实施方式中，该单链融合多肽系由seqidno：66所组成。
本技术中已知人ox40l的全长氨基酸(aa)序列(uniprot第p23510号)且以seqidno：40提供在本文中。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个该ox40l的胞外结构域或其片段的拷贝。于某些实施方式中，该ox40l的“胞外结构域”为seqidno：40的约氨基酸51至183。本技术的技术人员所理解的对应于ox40l胞外结构域的确切氨基酸可能不同。因此，本文所描述的胞外结构域的n端及/或c端可延伸或缩短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸。如本文所使用的ox40l的胞外结构域通常包含“茎区”和“tnf族结构域”。因此，于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂中的ox40l的胞外结构域的拷贝包含ox40l的“茎区”。ox40l的“茎区”为seqidno：40的约氨基酸51至57。该茎区约包含氨基酸qvshryp(seqidno：55)。于一些实施方式中，该茎区包含约4至20个氨基酸。于一些实施方式中，该茎区包含约4至10个氨基酸。于一些实施方式中，该茎区包含在tnf同源结构域上游的氨基酸(例如4至10个氨基酸)。于一些实施方式中，该茎区包含该茎区的片段。于一些实施方式中，该茎区包含额外的氨基酸。于一些实施方式中，该茎区包含氨基酸alqvshryp(变体1；seqidno：74)。于一些实施方式中，该茎区包含氨基酸shryp(变体2；seqidno：75)。于一些实施方式中，该茎区包含氨基酸hryp(变体3；seqidno：76)。该ox40l的“tnf同源结构域”或“tnf族结构域”为seqidno：40的约氨基酸84至178。该tnf同源结构域包含seqidno：56。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：42的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：42的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：42的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：67的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：67的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：67的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：77的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：77的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：77的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：78的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：78的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：78的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：79的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：79的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：79的拷贝。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含ox40l的胞外结构域或其ox40结合片段的第一、第二和第三拷贝。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含为单链多肽形式的ox40l的胞外结构域或其片段的第一、第二和第三拷贝。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：44。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含与seqidno：44具有至少约90％的序列同一性的多肽。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含与seqidno：44具有至少约95％的序列同一性的多肽。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含与seqidno：44具有至少约96％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含基本上由seqidno：44所组成的多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含由seqidno：44所组成的多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：69。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含与seqidno：69具有至少约90％的序列同一性的多肽。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含与seqidno：69具有至少约95％的序列同一性的多肽。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含与seqidno：69具有至少约96％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含基本上由seqidno：69所组成的多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含由seqidno：69所组成的多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：71。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含与seqidno：71具有至少约90％的序列同一性的多肽。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含与seqidno：71具有至少约95％的序列同一性的多肽。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含与seqidno：71具有至少约96％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含基本上由seqidno：71所组成的多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含由seqidno：71所组成的多肽。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含ox40l的胞外结构域的片段的至少第一、第二和第三拷贝。于一些实施方式中，该ox40l的胞外结构域的拷贝系由相同氨基酸序列所组成。于一些实施方式中，该ox40l的胞外结构域的拷贝并非完全相同。于一些实施方式中，与野生型序列相比较，该ox40l的胞外结构域的拷贝包含在人ox40l的氨基酸序列中取代、删除及/或增加氨基酸。
于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人ox40l的胞外结构域或其片段的第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人ox40l的胞外结构域或其片段的至少第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中至少一个该胞外结构域包含茎区。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人ox40l的胞外结构域或其片段的至少第一、第二和第三拷贝中的单链融合多肽，其中各胞外结构域均包含茎区。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人ox40l的胞外结构域的至少第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该多肽不包含任何肽接头(即，外源肽接头)。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人ox40l的胞外结构域的至少第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中各胞外结构域均包含茎区且该多肽不包含任何肽接头(即，外源肽接头)。于一些实施方式中，该ox40l的胞外结构域包含seqidno：40的氨基酸51至183。于一些实施方式中，该ox40l的胞外结构域包含seqidno：42。于一些实施方式中，该ox40l的胞外结构域系由seqidno：42所组成。于一些实施方式中，该单链融合多肽包含seqidno：44。于一些实施方式中，该单链融合多肽系由seqidno：44所组成。于一些实施方式中，该单链融合多肽包含seqidno：69。于一些实施方式中，该单链融合多肽系由seqidno：69所组成。
本技术中已知人cd40l的全长氨基酸(aa)序列(uniprot第p29965号)且以seqidno：82提供在本文中。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个该cd40l的胞外结构域或其片段的拷贝。于某些实施方式中，该cd40l的“胞外结构域”为seqidno：82的约氨基酸47至261。本技术的技术人员所理解的对应于cd40l胞外结构域的确切氨基酸可能不同。因此，本文所描述的胞外结构域的n端及/或c端可延伸或缩短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸。如本文所使用的cd40l的胞外结构域通常包含“茎区”或“茎区”的片段及“tnf族结构域”。该cd40l的茎区约72个氨基酸，较gitrl和cd40l的茎区长得多。于一些实施方式中，为了允许单链cd40l三聚体的正确折叠和构象，该茎区包含长度与gitrl或ox40l的茎区长度较为相等的cd40l茎区片段。因此，于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂中的cd40l的胞外结构域的拷贝包含cd40l的茎区的片段。于一些实施方式中，该茎区包含约4至20个氨基酸。于一些实施方式中，该茎区包含约4至10个氨基酸。于一些实施方式中，该茎区包含在tnf同源结构域上游的氨基酸(例如4至10个氨基酸)。该cd40l的茎区为seqidno：82的约氨基酸47至112。于一些实施方式中，该茎区包含cd40l茎区的片段。于一些实施方式中，该cd40l茎区的片段包含mqkgdq(seqidno：98；片段1)；femqkgdq(seqidno：99；片段2)；emqkgdq(seqidno：100；片段3)；qkgdq(seqidno：101；片段4)；或kgdq(seqidno：102；片段5)。该cd40l的“tnf同源结构域”或“tnf族结构域”为seqidno：82的约氨基酸122至261。该tnf同源结构域包含seqidno：94。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：84的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：84的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：84的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：95的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：95的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：95的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：103的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：103的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：103的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：104的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：104的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：104的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：105的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：105的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：105的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少一个seqidno：106的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含至少二个seqidno：106的拷贝。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含三个seqidno：106的拷贝。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含cd40l的胞外结构域或其cd40结合片段的第一、第二和第三拷贝。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含为单链多肽形式的cd40l的胞外结构域或其片段的第一、第二和第三拷贝。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：85。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含与seqidno：85具有至少约90％的序列同一性的多肽。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含与seqidno：85具有至少约95％的序列同一性的多肽。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含与seqidno：85具有至少约96％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含基本上由seqidno：85所组成的多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含由seqidno：85所组成的多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：97。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含与seqidno：97具有至少约90％的序列同一性的多肽。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含与seqidno：97具有至少约95％的序列同一性的多肽。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含与seqidno：97具有至少约96％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含基本上由seqidno：97所组成的多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含由seqidno：97所组成的多肽。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含cd40l的胞外结构域的片段的至少第一、第二和第三拷贝。于一些实施方式中，该cd40l的胞外结构域的拷贝系由相同氨基酸序列所组成。于一些实施方式中，该cd40l的胞外结构域的拷贝并非完全相同。于一些实施方式中，与野生型序列相比较，该cd40l的胞外结构域的拷贝包含在人cd40l的氨基酸序列中取代、删除及/或增加氨基酸。
于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人cd40l的胞外结构域或其片段的至少第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人cd40l的胞外结构域或其片段的至少第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中至少一个该胞外结构域包含茎区或茎区片段。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人cd40l的胞外结构域或其片段的至少第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中各胞外结构域均包含茎区或茎区片段。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人cd40l的胞外结构域的至少第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中该多肽不包含任何肽接头(即，外源肽接头)。于一些实施方式中，该多肽或药剂为包含人cd40l的胞外结构域的至少第一、第二和第三拷贝的单链融合多肽，其中各胞外结构域均包含茎区或茎区片段且该多肽不包含任何肽接头(即，外源肽接头)。于一些实施方式中，该cd40l的胞外结构域包含seqidno：82的氨基酸113至261。于一些实施方式中，该cd40l的胞外结构域包含seqidno：84。于一些实施方式中，该ox40l的胞外结构域系由seqidno：84所组成。于一些实施方式中，该cd40l的胞外结构域包含seqidno：103。于一些实施方式中，该ox40l的胞外结构域系由seqidno：103所组成。于一些实施方式中，该cd40l的胞外结构域包含seqidno：104。于一些实施方式中，该ox40l的胞外结构域系由seqidno：104所组成。于一些实施方式中，该cd40l的胞外结构域包含seqidno：105。于一些实施方式中，该ox40l的胞外结构域系由seqidno：105所组成。于一些实施方式中，该cd40l的胞外结构域包含seqidno：106。于一些实施方式中，该ox40l的胞外结构域系由seqidno：106所组成。于一些实施方式中，该单链融合多肽包含seqidno：85。于一些实施方式中，该单链融合多肽系由seqidno：85所组成。于一些实施方式中，该单链融合多肽包含seqidno：97。于一些实施方式中，该单链融合多肽系由seqidno：97所组成。
于某些实施方式中，该多肽或药剂包含含有一或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，等)保守性取代且能够结合gitr的胞外结构域gitrl氨基酸序列或其片段的变体。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含含有一或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，等)保守性取代且能够结合ox40的胞外结构域ox40l氨基酸序列或其片段的变体。于某些实施方式中，该多肽或药剂包含含有一或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，等)保守性取代且能够结合cd40的胞外结构域cd40l氨基酸序列或其片段的变体。
于一些实施方式中，该药剂为多肽。于一些实施方式中，该多肽为融合蛋白。于某些实施方式中，该融合蛋白包含至少一个人tnfsf的成员的胞外结构域或其片段的拷贝，且进一步包含非tnfsf多肽。于某些实施方式中，该融合蛋白包含至少一个人gitrl的胞外结构域或其片段的拷贝，且进一步包含非gitrl多肽。于某些实施方式中，该融合蛋白包含至少一个人ox40l的胞外结构域或其片段的拷贝，且进一步包含非ox40l多肽。于某些实施方式中，该融合蛋白包含至少一个人cd40l的胞外结构域或其片段的拷贝，且进一步包含非cd40l多肽。于一些实施方式中，该融合蛋白可包括连接异源功能性和结构性多肽的胞外结构域或其片段，该异源功能性和结构性多肽包括，但不限于人fc区、一或多个蛋白质标签(例如myc、flag、gst)、其他内源性蛋白质或蛋白质片段，或任何其他有用的蛋白质序列，包括介于该胞外结构域和非tnfsf多肽之间的任何肽序列(例如非gitrl多肽或非ox40l多肽)。于某些实施方式中，该非tnfsf多肽包含人fc区。于某些实施方式中，该非gitrl多肽包含人fc区。于某些实施方式中，该非ox40l多肽包含人fc区。于某些实施方式中，该非cd40l多肽包含人fc区。该fc区可从免疫球蛋白igg、iga、igm、igd和ige的任一类别取得。于一些实施方式中，该fc区为人igg1fc区。于一些实施方式中，该fc区为人igg2fc区。于一些实施方式中，该fc区为野生型fc区。于一些实施方式中，该fc区为野生型fc区的天然变体。于一些实施方式中，该fc区为突变的fc区。于一些实施方式中，该fc区在n端被截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸(例如在铰链结构域中)。于一些实施方式中，该fc区在c端被截短(例如赖氨酸不存在)。于一些实施方式中，该铰链结构域中的氨基酸被改变以阻碍形成不希望有的二硫键。于一些实施方式中，半胱氨酸被不同的氨基酸替换以阻碍形成不希望有的二硫键。于一些实施方式中，半胱氨酸被丝氨酸替换以阻碍形成不希望有的二硫键。于一些实施方式中，该fc区包含seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13或seqidno：14。于一些实施方式中，该fc区包含seqidno：10。于一些实施方式中，该fc区包含seqidno：14。
于一些实施方式中，该多肽或药剂为单链gitrl三聚体-fc蛋白。于一些实施方式中，该多肽或药剂为单链gitrl三聚体-igg1fc蛋白。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：6或seqidno：7。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：6。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：7。于一些实施方式中，该多肽或药剂基本上系由seqidno：6或seqidno：7所组成。于一些实施方式中，该多肽或药剂系由seqidno：6所组成。于一些实施方式中，该多肽或药剂系由seqidno：7所组成。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含由atcc保藏且指定编号为pta-122112的“hgitrl-higg1”质粒编码的多肽。于一些实施方式中，该多肽或药剂为单链gitrl三聚体-igg2fc蛋白。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：8或seqidno：9。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：8。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：9。于一些实施方式中，该多肽或药剂基本上系由seqidno：8或seqidno：9所组成。于一些实施方式中，该多肽或药剂系由seqidno：8所组成。于一些实施方式中，该多肽或药剂系由seqidno：9所组成。
于一些实施方式中，该多肽或药剂为单链ox40l三聚体-fc蛋白。于一些实施方式中，该多肽或药剂为单链ox40l三聚体-igg1fc蛋白。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：45或seqidno：46。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：45。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：46。于一些实施方式中，该多肽或药剂基本上系由seqidno：45或seqidno：46所组成。于一些实施方式中，该多肽或药剂系由seqidno：45所组成。于一些实施方式中，该多肽或药剂系由seqidno：46所组成。于一些实施方式中，该多肽或药剂为单链ox40l三聚体-igg2fc蛋白。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：47或seqidno：48。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：47。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：48。于一些实施方式中，该多肽或药剂基本上系由seqidno：47或seqidno：48所组成。于一些实施方式中，该多肽或药剂系由seqidno：47所组成。于一些实施方式中，该多肽或药剂系由seqidno：48所组成。
于一些替换的实施方式中，该多肽或药剂为单链ox40l三聚体-igg1fc蛋白。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：80或seqidno：81。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：80。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：81。于一些实施方式中，多肽或剂基本上是由seqidno：80或seqidno：81所组成。于一些实施方式中，该多肽或药剂是由seqidno：80所组成。于一些实施方式中，该多肽或药剂是由seqidno：81所组成。
于一些实施方式中，该多肽或药剂为单链cd40l三聚体-fc蛋白。于一些实施方式中，该多肽或药剂为单链cd40l三聚体-igg1fc蛋白。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：89或seqidno：90。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：89。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：90。于一些实施方式中，该多肽或药剂基本上是由seqidno：89或seqidno：90所组成。于一些实施方式中，该多肽或药剂是由seqidno：89所组成。于一些实施方式中，该多肽或药剂是由seqidno：90所组成。于一些实施方式中，该多肽或药剂为单链cd40l三聚体-igg2fc蛋白。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：91或seqidno：92。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：91。于一些实施方式中，该多肽或药剂包含seqidno：92。于一些实施方式中，该多肽或药剂基本上是由seqidno：91或seqidno：92所组成。于一些实施方式中，该多肽或药剂是由seqidno：91所组成。于一些实施方式中，该多肽或药剂是由seqidno：92所组成。
于某些实施方式中，该非tnfsf多肽(例如非gitrl多肽、非ox40l多肽或非cd40l多肽)包含seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13或seqidno：14。于某些实施方式中，该非tnfsf多肽(例如非gitrl多肽、非ox40l多肽或非cd40l多肽)基本上是由seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13或seqidno：14所组成。于某些实施方式中，该非tnfsf多肽(例如非gitrl多肽、非ox40l多肽或非cd40l多肽)是由seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13或seqidno：14所组成。
于某些实施方式中，该非gitrl多肽或非ox40l多肽包含免疫球蛋白重链。于某些实施方式中，该非cd40l多肽包含免疫球蛋白重链。于某些实施方式中，该免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链联结。于一些实施方式中，该免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链形成抗原结合位点。于某些实施方式中，该非gitrl多肽或非ox40l多肽包含抗体。于某些实施方式中，该非cd40l多肽包含抗体。于某些实施方式中，该非gitrl多肽或非ox40l多肽包含单链抗体或fab。于某些实施方式中，该非cd40l多肽包含单链抗体或fab。
于某些实施方式中，该融合蛋白包含人gitrl的胞外结构域或其片段的第一、第二和第三拷贝及非gitrl多肽，其中该非gitrl多肽的c端连接gitrl的胞外结构域。于某些实施方式中，该融合蛋白包含人gitrl的胞外结构域或其片段的第一、第二和第三拷贝及非gitrl多肽，其中该非gitrl多肽的n端连接gitrl的胞外结构域。于一些实施方式中，该gitrl的胞外结构域的第一拷贝连接该非gitrl多肽的c端。于一些实施方式中，该gitrl的胞外结构域的第三拷贝连接该非gitrl多肽的n端。于一些实施方式中，该gitrl的胞外结构域连接该fc区的c端。于一些实施方式中，该gitrl的胞外结构域连接该fc区的n端。于一些实施方式中，该gitrl的胞外结构域直接连接该fc区(即，无插入的肽接头)。于一些实施方式中，该gitrl的胞外结构域经由肽接头连接fc区。
于某些实施方式中，该融合蛋白包含人ox40l的胞外结构域或其片段的至少第一、第二和第三拷贝及非ox40l多肽，其中该非ox40l多肽的c端连接ox40l的胞外结构域。于某些实施方式中，该融合蛋白包含人ox40l的胞外结构域或其片段的至少第一、第二和第三拷贝及非ox40l多肽，其中该非ox40l多肽的n端连接ox40l的胞外结构域。于一些实施方式中，该ox40l胞外结构域的第一拷贝连接该非ox40l多肽的c端。于一些实施方式中，该ox40l的胞外结构域的第三拷贝连接该非ox40l多肽的n端。于一些实施方式中，该ox40l的胞外结构域连接该fc区的c端。于一些实施方式中，该ox40l的胞外结构域连接该fc区的n端。于一些实施方式中，该ox40l的胞外结构域直接连接该fc区(即，无插入的肽接头)。于一些实施方式中，该ox40l的胞外结构域经由肽接头连接fc区。
于某些实施方式中，该融合蛋白包含人cd40l的胞外结构域或其片段的至少第一、第二和第三拷贝及非cd40l多肽，其中该非cd40l多肽的c端连接cd40l的胞外结构域。于某些实施方式中，该融合蛋白包含人cd40l的胞外结构域或其片段的至少第一、第二和第三拷贝及非cd40l多肽，其中该非cd40l多肽的n端连接cd40l的胞外结构域。于一些实施方式中，该cd40l的胞外结构域的第一拷贝连接该非cd40l多肽的c端。于一些实施方式中，该cd40l的胞外结构域的第三拷贝连接该非cd40l多肽的n端。于一些实施方式中，该cd40l的胞外结构域连接该fc区的c端。于一些实施方式中，该cd40l的胞外结构域连接该fc区的n端。于一些实施方式中，该cd40l的胞外结构域直接连接该fc区(即，无插入的肽接头)。于一些实施方式中，该cd40l的胞外结构域经由肽接头连接fc区。
如本文中所使用的术语“接头”系指插在第一多肽(例如tnfsf(例如gitrl、ox40l或cd40l或其片段)的胞外结构域)和第二多肽(例如fc区)之间的接头。于一些实施方式中，该接头为肽接头。接头不应不利地影响该融合蛋白的表现、分泌或生物活性。接头不应为抗原性且不应引起免疫反应。合适的接头为熟习本技术的人士所已知且常包括甘氨酸和丝氨酸残基的混合物，常包括立体上无遮蔽的氨基酸。可并入有用的接头的其他氨基酸包括苏氨酸和丙氨酸残基。接头的长度范围可为，例如长度为1至50个氨基酸、长度为1至22个氨基酸、长度为1至10个氨基酸、长度为1至5个氨基酸或长度为1至3个氨基酸。接头可包括，但不限于sergly、ggsg、gsgs、gggs、s(ggs)n(其中n为1至7)、gra、聚(gly)、聚(ala)、gggsggg(seqidno：57)、esggggvt(seqidno：34)、lesggggvt(seqidno：35)、graqvt(seqidno：36)、wraqvt(seqidno：37)和argraqvt(seqidno：38)。于一些实施方式中，该接头可包含裂解位点。于一些实施方式中，该接头可包含酶裂解位点，从而使该第二多肽可从第一多肽分开。如本文所使用者，接头为不包括来自第一多肽的c端(例如gitrl、ox40l或cd40l的胞外结构域)或第二多肽的n端(例如fc区)的氨基酸残基的插入肽序列。
于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂特异结合gitr并作为gitr激动剂。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂特异结合gitr并活化gitr信号传导。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂特异结合gitr并诱导、活化、促进、增加、增强或延长gitr活性。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂特异结合ox40并作为ox40激动剂。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂特异结合ox40并活化ox40信号传导。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂特异结合ox40并诱导、活化、促进、增加、增强或延长ox40活性。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂特异结合cd40并作为cd40激动剂。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂特异结合cd40并活化cd40信号传导。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂特异结合cd40并诱导、活化、促进、增加、增强或延长cd40活性。
于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂特异结合gitr并调节免疫反应。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂特异结合gitr并诱导、放大、增加及/或延长免疫反应。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂特异结合ox40并调节免疫反应。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂特异结合ox40并诱导、放大、增加及/或延长免疫反应。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂特异结合cd40并调节免疫反应。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂特异结合cd40并诱导、放大、增加及/或延长免疫反应。
于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂以约1μm或更小、约100nm或更小、约40nm或更小、约20nm或更小、约10nm或更小、约1nm或更小或约0.1nm或更小的解离常数(kd)特异结合tnfrsf的成员(例如gitr、ox40或cd40)。于一些实施方式中，该多肽或药剂以约1nm或更小的kd结合tnfrsf的成员(例如gitr、ox40或cd40)。于一些实施方式中，该多肽或药剂以约0.1nm或更小的kd结合tnfrsf的成员(例如gitr、ox40或cd40)。于一些实施方式中，该多肽或药剂以约10nm或更小的kd结合人tnfrsf及/或小鼠tnfrsf。于一些实施方式中，该多肽或药剂以约10nm或更小的kd结合人tnfrsf。
于一些实施方式中，该多肽或药剂以约10nm或更小的kd结合人gitr及/或小鼠gitr。于一些实施方式中，该多肽或药剂以约1nm或更小的kd结合人gitr及/或小鼠gitr。于一些实施方式中，该多肽或药剂以约0.1nm或更小的kd结合人gitr及/或小鼠gitr。于一些实施方式中，该多肽或药剂结合人gitr，但不结合小鼠gitr。于一些实施方式中，该多肽或药剂以约10nm或更小的kd结合人gitr。于一些实施方式中，该多肽或药剂以约1nm或更小的kd结合人gitr。于一些实施方式中，该多肽或药剂以约0.1nm或更小的kd结合人gitr。
于一些实施方式中，该多肽或药剂以约10nm或更小的kd结合人ox40及/或小鼠ox40。于一些实施方式中，该多肽或药剂以约1nm或更小的kd结合人ox40及/或小鼠ox40。于一些实施方式中，该多肽或药剂以约0.1nm或更小的kd结合人ox40及/或小鼠ox40。于一些实施方式中，该多肽或药剂以约10nm或更小的kd结合人ox40。于一些实施方式中，该多肽或药剂以约1nm或更小的kd结合人ox40。于一些实施方式中，该多肽或药剂以约0.1nm或更小的kd结合人ox40。
于一些实施方式中，该多肽或药剂以约10nm或更小的kd结合人cd40及/或小鼠cd40。于一些实施方式中，该多肽或药剂以约1nm或更小的kd结合人cd40及/或小鼠cd40。于一些实施方式中，该多肽或药剂以约0.1nm或更小的kd结合人cd40及/或小鼠cd40。于一些实施方式中，该多肽或药剂结合人cd40，但不结合小鼠cd40。于一些实施方式中，该多肽或药剂以约10nm或更小的kd结合人cd40。于一些实施方式中，该多肽或药剂以约1nm或更小的kd结合人cd40。于一些实施方式中，该多肽或药剂以约0.1nm或更小的kd结合人cd40。
于一些实施方式中，该多肽或药剂对tnfrsf成员(例如gitr、ox40或cd40)的离解常数为使用固定在biacore芯片上的包含至少一部分tnfrsf胞外结构域的tnfrsf融合蛋白测定的解离常数。
于一些实施方式中，该多肽或药剂以约lμm或更小、约100nm或更小、约40nm或更小、约20nm或更小、约10nm或更小、约1nm或更小或约0.1nm或更小的半最大有效浓度(ec50)结合tnfrsf的成员(例如人gitr、ox40或cd40)。
于某些实施方式中，融合多肽系使用如本技术的技术人员已知的重组dna技术生产。于一些实施方式中，从哺乳动物细胞分离出编码特定蛋白质的多核苷酸或其片段(诸如使用特异扩增编码该蛋白质的基因的寡核苷酸引物，藉由rt-pcr进行)，并使用习知技术测定该核苷酸序列。该经分离出的编码该蛋白质的多核苷酸可经克隆入合适的表现载体中，当该表现载体被转染入宿主细胞(诸如大肠杆菌、猿猴cos细胞或中国仓鼠卵巢(cho)细胞)时，该多核苷酸可生产多肽。于其他实施方式中，重组蛋白或其片段可从噬菌体展示库中分离出或使用其他细胞表面展示技术分离出。
该编码蛋白质的多核苷酸可使用重组dna技术以多种不同的方式修饰，以产生替代或变体蛋白。蛋白质的定点或高密度诱变可用来优化重组蛋白的特异性、亲和力、稳定性，等。
蛋白质通常含有指导蛋白质转运的信号序列。信号序列(亦称为信号肽或领导序列)定位在新生多肽的n端。它们将多肽靶向内质网，而该蛋白质被分选至其目的地，例如胞器的内部空间、内膜、细胞外膜或经由分泌到达细胞外部。当蛋白质被转运到内质网后，大部分信号序列被信号肽酶从蛋白质裂解。该信号序列从多肽裂解通常系发生在氨基酸序列中的特定位点且取决于该信号序列内的氨基酸残基。虽然通常具有一个特定裂解位点，信号肽酶可识别及/或使用一个以上的裂解位点，导致该多肽的非均匀n端。例如，使用信号序列内的不同的裂解位点可导致表现的多肽具有不同的n-端氨基酸。因此，于一些实施方式中，如本文所描述的多肽可包含具有不同n端的多肽混合物。于一些实施方式中，n端的长度相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸。于一些实施方式中，该n端的长度相差1、2、3、4或5个氨基酸。于一些实施方式中，该多肽基本上为均匀的，即，该多肽具有相同n端。于一些实施方式中，与该蛋白质的天然序列相比较，该多肽的信号序列包含一或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，等)氨基酸取代及/或缺失。于一些实施方式中，该多肽的信号序列包含允许一个裂解位点成为主导的氨基酸取代及/或缺失，从而产生具有一个n端的基本上均匀的多肽。于一些实施方式中，该融合多肽的信号序列并非包含在该融合多肽内的蛋白质的天然信号序列。
于某些实施方式中，本文所描述的多肽、药剂或融合多肽包含免疫球蛋白的fc区。本技术的技术人员将理解本发明的一些多肽或药剂将包含融合蛋白，当与具有约相同免疫原性的包含天然或未经改变的fc区的融合蛋白相比较时，其中至少一部分的fc区具有缺失或经改变，从而提供所需的生化特性，诸如当与含有天然或未经改变的fc区相比较，癌症细胞局限化增加、肿瘤渗透增加、血清半衰期降低或血清半衰期增加。修饰该fc区可包括在一或多个结构域中添加、删除或取代一或多个氨基酸。本文所公开的经修饰的融合蛋白可包含在该二个重链恒定结构域(ch2或ch3)或铰链区中的一或多个修改或修饰。于其他实施例中，可移除整个ch2结构域(δch2构建体)。于一些实施方式中，该经省略的恒定区结构域系由可提供该分子一些弹性(通常系由该不存在的恒定区结构域赋予)的短氨基酸间隔子(例如10个氨基酸残基)替代。
于一些实施方式中，该经修饰的融合蛋白系经遗传工程处理以将ch3结构域直接连接该铰链区或第一多肽。于其他实施方式中，系将肽间隔子或接头插入铰链区或第一多肽与该经修饰的ch2及/或ch3结构域之间。例如，构建体可经表现出，其中该ch2结构域已被删除，而其余的ch3结构域(经修饰或未经修饰)系具有长5至20个氨基酸之间隔子来连接铰链区或第一多肽。该等间隔子可经添加以确保该恒定结构域的调节组件保持游离并易于接近，或使该铰链区保持弹性。然而，应注意的是，于某些情况中，氨基酸间隔子可能证明为免疫原性且引起不希望有的针对该构建体的免疫反应。因此，于某些实施方式中，任何加入该构建体的间隔子将为相对非免疫原性的，从而保持该融合蛋白的所研究的生物质量。
于一些实施方式中，该经修饰的融合蛋白可具有仅部分缺失的恒定结构域或取代几个，甚至是单一氨基酸。例如，在ch2结构域的选定区域中的单一氨基酸突变可能足以实质上减少fc结合，从而增加癌症细胞局限化及/或肿瘤渗透。类似地，单纯地删除一或多个控制特定效应子功能(例如补体clq结合)的恒定区结构域的一部分可能是有利的。该等部分删除恒定区可改善该多肽或药剂的选定的特征(例如血清半衰期)，同时留下其他与个体恒定区结构域完整相关的所研究的功能。再者，如上文中所提及者，所公开的融合蛋白的恒定区可透过将能够增强所产生的构建体的变化构型的一或多个氨基酸进行突变或取代来修饰。在这方面，破坏由保留的结合位点(例如，fc结合)所提供的活性，同时实质上保持该经修饰的融合蛋白的构形和免疫原性变化构型是可能的。于某些实施方式中，该经修饰的融合蛋白包含在该恒定区中加入一或多个氨基酸，以增强所研究的的特征，诸如降低或增加效应子功能，或提供更多的细胞毒素或碳水化合物附着位点。
本技术领域中已知该恒定区介导数种效应子功能。例如，补体的c1组分与igg或igm抗体的fc区结合(结合抗原)来活化补体系统。补体的活化在细胞病原体的调理素作用和溶解作用中很重要。补体活化亦刺激发炎反应且亦可能涉及自体免疫过敏反应。此外，该fc区可结合表现fc受体(fcr)的细胞。特异于不同类别的抗体，包括igg(γ受体)、ige(ε受体)、iga(α受体)和igm(μ受体)的fc受体有许多。
于一些实施方式中，经修饰的融合蛋白提供改变的效应子功能，其反过来影响该多肽或药剂的生物变化构型。例如，于一些实施方式中，将恒定区结构域删除或去活化(透过点突变或其他方式)可能减少该循环的改性药剂与fc受体结合，从而增加癌细胞局限化及/或肿瘤渗透。于其他实施方式中，恒定区修饰可增加或减少该多肽或药剂的血清半衰期。于一些实施方式中，该恒定区系经修饰以排除二硫键联或寡糖部分附着位点。
于某些实施方式中，经修饰的融合蛋白不具有一或多种通常与fc区相关联的效应子功能。于一些实施方式中，该多肽或药剂不具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)活性及/或无补体依赖性细胞毒性(cdc)活性。于某些实施方式中，该多肽或药剂不结合fc受体及/或补体因子。于某些实施方式中，该多肽或药剂不具有通常与fc区相关联的效应子功能。
本发明的多肽和药剂可藉由技术中已知的任何方法分析其与靶的特异结合。可使用的免疫分析包括，但不限于竞争性和非竞争性分析系统，这些分析系统使用诸如下列的技术：biacore分析、facs分析、免疫荧光、免疫细胞化学、蛋白质印迹分析、放射免疫分析、elisa、“三明治”免疫分析、免疫沉淀分析、沉淀反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散分析、凝集分析、补体固定分析、免疫放射测量分析、荧光免疫分析及蛋白a免疫分析。这些分析为本技术中的常规且为人熟知的分析。
例如，测试药剂(例如多肽)与人gitr的特异结合可使用elisa法测定。elisa分析包含制备gitr蛋白，以gitr将96孔微量滴定盘的孔涂层，在孔中加入与可检测的化合物(诸如酶底物，例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)共轭结合的测试药剂，培育一段时间并检测是否存有与gitr结合的药剂。于一些实施方式中，该测试药剂未与可检测的化合物共轭结合，而是与可识别该加入孔中的药剂的经标记的二级抗体共轭结合。于一些实施方式中，并非以gitr将该孔涂层，而是以测试药剂将该孔涂层，加入gitr并可使用能识别gitr的与可检测的化合物共轭结合的经标记的二级抗体来检测结合。熟习本技术的人士将了解可修改以增加该检测的信号的参数及其他本技术已知的elisa的变化。
于另一实例中，测试药剂(例如多肽)与人gitr的特异结合可使用facs测定。facs筛选分析可包含产生表现gitr的cdna构建体，将该构建体转染入细胞，将gitr表现在该细胞的表面上，将测试药剂与经转染的细胞混合并培育一段时间。与该测试药剂结合的细胞可使用与可检测的化合物(例如与pe共轭结合的抗fc抗体)共轭结合的二级抗体及流式细胞仪识别。本技术的技术人员将了解可修改以优化该检测的信号的参数及其他可增进筛选(例如筛选阻断抗体)的facs的变化。
测试药剂与靶(例如人gitr)的结合亲和力及药剂-靶交互作用的解离速率可藉由竞争性结合分析来测定。竞争性结合分析的一种实例为放射免疫分析，其包含将经标记的靶(例如经3h或125i标记的gitr)或其片段或变体与所研究的药剂在增加量的未经标记的靶的存在下一起培育，再检测与经标记的靶结合的药剂。该药剂对靶(例如人gitr)的亲和力及结合解离速率可从scatchard绘图分析的数据测定。于一些实施方式中，使用biacore动力学分析来测定药剂与靶(例如人gitr)结合的结合速率和解离速率。biacore动力学分析包含分析药剂与该表面具有固定靶的芯片相结合及解离的分析。
本发明亦包含同型二聚体药剂和异质二聚体药剂/分子。于一些实施方式中，该同型二聚体药剂为多肽。于一些实施方式中，该异质二聚体分子为多肽。一般而言，该同型二聚体分子包含二个完全相同的多肽。一般而言，该异质二聚体分子包含二个并非完全相同的多肽。于一些实施方式中，异质二聚体分子能够结合至少二个靶，例如双特异性药剂。这些靶可为，例如在单一细胞上的两种不同蛋白质或在二个分开的细胞上的两种不同蛋白质。于一些实施方式中，该双特异性药剂为多肽。因此，于一些实施方式中，该异质二聚体分子的一个多肽包含本文描述的多肽(例如结合gitr、ox40或cd40的单链三聚体-fc蛋白)，而该异质二聚体分子的一个多肽为抗体。本文中的术语“臂”可用来描述同型二聚体药剂、异质二聚体药剂及/或双特异性药剂的结构。如本文中所使用者，每个“臂”系各自针对一个靶。于一些实施方式中，一个“臂”可包含来自抗体的抗原结合位点。于一些实施方式中，一个“臂”可包含受体的结合部分。于一些实施方式中，同型二聚体型药剂包含二个完全相同的臂。于一些实施方式中，异质二聚体型药剂包含二个不同的臂。于一些实施方式中，双特异性药剂包含二个不同的臂。
于一些实施方式中，双特异性药剂包含本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，该双特异性药剂为同型二聚体蛋白质(第3图(ii)显示代表性绘图)。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂包含含有重链免疫球蛋白及tnfsf三聚体的多肽。于一些实施方式中，该重链免疫球蛋白与轻链相联结以形成抗原结合位点。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂包含含有抗体和单链tnfsf三聚体的多肽。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂包含含有单链抗体和单链tnfsf三聚体的多肽。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂包含含有抗体和单链gitrl三聚体的多肽。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂包含含有抗体和单链ox40l三聚体的多肽。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂包含含有抗体和单链cd40l三聚体的多肽。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂包含特异结合肿瘤抗原的抗体。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂包含特异结合免疫细胞上的抗原的抗体。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂包含特异结合pd-1、pd-l1、ctla-4、lag-3、tigit或tim3的抗体。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂结合gitr和pd-1。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂结合gitr和pd-l1中。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂结合ox-40和pd-1。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂结合ox-40和pd-l1。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂结合cd40和pd-1。于一些实施方式中，该同型二聚体双特异性药剂结合cd40和pd-l1。
于一些实施方式中，该双特异性药剂为异质二聚体蛋白质(第3图(iii)显示代表性绘图)。于一些实施方式中，该异质二聚体双特异性药剂包含来自抗体的抗原结合位点(例如由免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链形成的抗原结合位点)及tnfsf三聚体。于某些实施方式中，双特异性药剂包含免疫反应刺激剂或其功能片段及tnfsf三聚体。
于一些实施方式中，异质二聚体双特异性药剂能够结合一个靶，且亦包含“非结合”功能。因此，于一些实施方式中，该异质二聚体双特异性药剂的一个多肽包含本文所描述的多肽(例如结合tnfrsf，诸如gitr、ox40或cd40)，而该异质二聚体药剂的一个多肽为另一免疫反应刺激剂。如本文中所使用的短语“免疫反应刺激剂”系以最广泛的意义使用且系指藉由诱导免疫系统的任何组分的活性活化或增加活性来直接或间接刺激该免疫系统的物质。例如，免疫反应刺激剂可包括细胞因子及各种抗原，包括肿瘤抗原和源自病原体的抗原。于一些实施方式中，该免疫反应刺激剂包括，但不限于集落刺激因子(例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、干细胞因子(scf))、白介素(例如il-1、il-2、il-3、il-7、il-12、il-15、il-18)、阻断免疫抑制功能的抗体(例如抗ctla-4抗体、抗cd28抗体、抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体)、toll样受体(例如tlr4、tlr7、tlr9)或b7族的一员(例如cd80、cd86)。
于一些实施方式中，异质二聚体双特异性药剂包含含有gitrl三聚体的第一多肽和含有特异结合肿瘤抗原的抗体的第二多肽。于一些实施方式中，异质二聚体双特异性药剂包含含有ox40l三聚体的第一多肽和含有特异结合肿瘤抗原的抗体的第二多肽。异质二聚体双特异性药剂包含含有cd40l三聚体的第一多肽和含有特异结合肿瘤抗原的抗体的第二多肽。对肿瘤抗原具有结合特异性的双特异性药剂可用于指导gitrl、ox40l或cd40l三聚体多肽针对肿瘤。例如，该双特异性药剂可以用于指导gitrl、ox40l或cd40l三聚体多肽针对表现该肿瘤抗原或过致表现该肿瘤抗原的肿瘤。此可用于诱导及/或增强接近该肿瘤微环境或肿瘤微环境内的免疫反应。于一些实施方式中，双特异性药剂可用于诱导或增强肿瘤浸润免疫细胞的活性。
于一些实施方式中，异质二聚体双特异性药剂包含含有tnfsf三聚体的第一多肽和含有特异结合免疫反应分子的抗体的第二多肽。于一些实施方式中，异质二聚体双特异性药剂包含含有gitrl三聚体的第一多肽和含有特异结合免疫反应分子的抗体的第二多肽。于一些实施方式中，异质二聚体双特异性药剂包括包含含有ox40l三聚体的第一多肽和含有特异结合免疫反应分子的抗体的第二多肽。于一些实施方式中，异质二聚体双特异性药剂包含含有cd40l三聚体的第一多肽和含有特异结合免疫反应分子的抗体的第二多肽。于一些实施方式中，异质二聚体双特异性药剂包含含有gitrl三聚体的第一多肽和含有特异结合免疫检验点蛋白的抗体的第二多肽。于一些实施方式中，异质二聚体双特异性药剂包含含有ox40l三聚体的第一多肽和含有特异结合免疫检验点蛋白的抗体的第二多肽。于一些实施方式中，异质二聚体双特异性药剂包含含有cd40l三聚体的第一多肽和含有特异结合免疫检验点蛋白的抗体的第二多肽。于一些实施方式中，异质二聚体双特异性药剂包含含有gitrl三聚体的第一多肽和含有特异结合pd-1的抗体的第二多肽。于一些实施方式中，异质二聚体双特异性药剂包含含有gitrl三聚体的第一多肽和含有特异结合pd-l1的抗体的第二多肽。于一些实施方式中，异质二聚体双特异性药剂包含含有ox40l三聚体的第一多肽和含有特异结合pd-1的抗体的第二多肽。于一些实施方式中，异质二聚体双特异性药剂包含含有ox40l三聚体的第一多肽和含有特异结合pd-l1的抗体的第二多肽。于一些实施方式中，异质二聚体双特异性药剂包含含有cd40l三聚体的第一多肽和含有特异结合pd-1的抗体的第二多肽。于一些实施方式中，异质二聚体双特异性药剂包含含有cd40l三聚体的第一多肽和含有特异结合pd-l1的抗体的第二多肽。
于一些实施方式中，该异质二聚体分子(例如双特异性药剂)可结合第一靶(例如gitr、ox40或cd40)及第二靶，例如在白血球上的效应子分子(例如cd2、cd3、cd28或cd80)或fc受体(例如cd64、cd32或cd16)，从而引发较强的细胞免疫反应。
于一些实施方式中，双特异性药剂(无论是异质二聚体或同型二聚体)具有较个别药剂增强的效力。本技术的技术人员已知任何药剂(例如可溶性蛋白或细胞因子)可具有独特的药代动力学(pk)(例如循环半衰期)。于一些实施方式中，双特异性药剂具有使两种活性剂及/或多肽的pk同步的能力，其中该两种个别活性剂及/或多肽具有不同的pk变化构型。于一些实施方式中，双特异性分子具有集中二个药剂及/或多肽的作用在共同区域(例如肿瘤及/或肿瘤微环境)的能力。于一些实施方式中，双特异性分子具有集中二个药剂及/或多肽的作用在共同靶(例如肿瘤及/或肿瘤细胞)的能力。于一些实施方式中，双特异性药剂具有将二个药剂及/或多肽的作用靶向一种以上的生物途径或超过一种方面的免疫反应的能力。于一些实施方式中，该双特异性药剂较具有任一单独的多肽及/或药剂减低的毒性及/或副作用。于一些实施方式中，该双特异性药剂具有较该两种个别多肽及/或药剂的混合物减低的毒性及/或副作用。于一些实施例方面中，该双特异性药剂具有增加的治疗指数。于一些实施方式中，该双特异性药剂具有较该两种个别多肽及/或药剂的混合物及/或单一药剂形式的多肽及/或药剂增加的治疗指数。
相信，单链tnfsf分子可能较抗tnfsf激动剂抗体更活跃，因为单链tnfsf三聚体将以非常类似三个天然tnfsf分子的方式作用，即，结合三个tnfrsf分子。相反地，抗tnfrsf抗体仅能够接合二个tnfrsf分子，从而减低任何可能的影响。为了生产包含抗体的双特异性分子，其通常涉及单价抗体(即，单臂抗体)。这会降低(若无法完全排除)激动剂抗体的效果，尤其是若活化系取决于该靶分子的群集。单链tnfsf(例如gitrl三聚体、ox40l三聚体或cd40l三聚体)能够结合三个tnfrsf分子，从而为异质二聚体或同型二聚体双特异性分子的一部分，其不会丧失任何功能或效力。
于一些实施方式中，异质二聚体双特异性分子包含含有单链tnfsf三聚体的第一多肽及含有抗体的第二多肽。于一些实施方式中，异质二聚体双特异性分子包含含有单链tnfsf三聚体的第一多肽及含有拮抗剂抗体的第二多肽。于一些实施方式中，异质二聚体双特异性分子包含含有单链gitrl三聚体的第一多肽及含有拮抗剂抗体的第二多肽。于一些实施方式中，异质二聚体双特异性分子包含含有单链ox40l三聚体的第一多肽及含有拮抗剂抗体的第二多肽。于一些实施方式中，异质二聚体双特异性分子包含含有单链cd40l三聚体的第一多肽及含有拮抗剂抗体的第二多肽。
于一些实施方式中，该异质二聚体双特异性药剂包含：(a)含有单链融合多肽的第一臂，该单链融合多肽包含gitrl的胞外结构域或其gitr结合片段的第一、第二和第三拷贝，及(b)含有来自抗体的抗原结合位点的第二臂。于一些实施方式中，该异质二聚体双特异性药剂包含：(a)含有单链融合多肽的第一臂，该单链融合多肽包含gitrl的胞外结构域或其gitr结合片段的第一、第二和第三拷贝，及(b)含有免疫反应刺激剂的第二臂。于一些实施方式中，该第一臂的gitrl的胞外结构域的拷贝中至少一者包含seqidno：3或seqidno：64。于一些实施方式中，该异质二聚体双特异性药剂包含含有seqidno：5或seqidno：66的第一臂。于一些实施方式中，该异质二聚体双特异性药剂包含第一臂，该第一臂进一步包含非gitrl多肽。于一些实施方式中，该异质二聚体双特异性药剂包含本文所描述的直接连接非gitrl多肽的单链融合gitrl多肽。于一些实施方式中，该单链融合多肽系藉由接头连接该非gitrl多肽。于一些实施方式中，该非gitrl多肽包含人fc区。于一些实施方式中，该非gitrl多肽包含seqidno：26、seqidno：27、seqidno：28、seqidno：29、seqidno：30、seqidno：31、seqidno：58、seqidno：59、seqidno：60或seqidno：61。
于一些实施方式中，该异质二聚体双特异性药剂包含：(a)含有单链融合多肽的第一臂，该单链融合多肽包含ox40l的胞外结构域或其ox40结合片段的第一、第二和第三拷贝，及(b)含有来自抗体的抗原结合位点的第二臂。于一些实施方式中，该异质二聚体双特异性药剂包含：(a)含有单链融合多肽的第一臂，该单链融合多肽包含ox40l的胞外结构域或其ox40结合片段的第一、第二和第三拷贝，及(b)含有免疫反应刺激剂的第二臂。于一些实施方式中，第一臂的ox40l的胞外结构域的拷贝中至少一者包含seqidno：42、seqidno：67、seqidno：78或seqidno：79。于一些实施方式中，该双特异性药剂包含含有seqidno：44、seqidno：69、seqidno：71或seqidno：72的第一臂。于一些实施方式中，该异质二聚体双特异性药剂包含第一臂，该第一臂进一步包含非ox40l多肽。于一些实施方式中，该异质二聚体双特异性药剂包含本文所描述的直接连接非ox40l多肽的单链融合ox40l多肽。于一些实施方式中，该单链融合多肽系藉由接头连接该非ox40l多肽。于一些实施方式中，该非ox40l多肽包含人fc区。于一些实施方式中，该非ox40l多肽包含seqidno：26、seqidno：27、seqidno：28、seqidno：29、seqidno：30、seqidno：31、seqidno：58、seqidno：59、seqidno：60或seqidno：61。
于一些实施方式中，该异质二聚体双特异性药剂包含：(a)含有单链融合多肽的第一臂，该单链融合多肽包含cd40l的胞外结构域或其cd40结合片段的第一、第二和第三拷贝，及(b)含有来自抗体的抗原结合位点的第二臂。于一些实施方式中，异质二聚体双特异性药剂包含：(a)含有单链融合多肽的第一臂，该单链融合多肽包含cd40l的胞外结构域或其cd40结合片段的第一、第二和第三拷贝，及(b)含有免疫反应刺激剂的第二臂。于一些实施方式中，第一臂的cd40l的胞外结构域的拷贝中至少一者包含seqidno：84、seqidno：103、seqidno：104、seqidno：105或seqidno：106。于一些实施方式中，该双特异性药剂包含含有seqidno：85或seqidno：97的第一臂。于一些实施方式中，该异质二聚体双特异性药剂包含第一臂，该第一臂进一步包含非cd40l多肽。于一些实施方式中，该异质二聚体双特异性药剂包含本文所描述的直接连接非cd40l多肽的单链融合cd40l多肽。于一些实施方式中，该单链融合多肽系藉由接头连接该非cd40l多肽。于一些实施方式中，该非cd40l多肽包含人fc区。于一些实施方式中，该非cd40l多肽包含seqidno：26、seqidno：27、seqidno：28、seqidno：29、seqidno：30、seqidno：31、seqidno：58、seqidno：59、seqidno：60或seqidno：61。
于一些实施方式中，该异质二聚体双特异性药剂包含含有tnfsf三聚体的第一多肽及含有免疫反应刺激剂的第二多肽。于一些实施方式中，该异质二聚体双特异性药剂包含含有单链gitrl三聚体的第一多肽和含有免疫反应刺激剂的第二多肽。于一些实施方式中，该异质二聚体双特异性药剂包含含有单链ox40l三聚体的第一多肽和含有免疫反应刺激剂的第二多肽。于一些实施方式中，该异质二聚体双特异性药剂包含含有单链cd40l三聚体的第一多肽及含有免疫反应刺激剂的第二多肽。
于一些实施方式中，该多聚体分子(例如双特异性药剂)包含第一ch3结构域和第二ch3结构域，这些ch3结构域各自经修饰以促进异质多聚体或异质二聚体形成。于一些实施方式中，第一和第二ch3结构域系使用旋钮-入-孔技术修饰。于一些实施方式中，第一和第二ch3结构域包含导致改变的静电交互作用的氨基酸变化。于一些实施方式中，第一和第二ch3结构域包含导致改变的疏水/亲水交互作用的氨基酸变化(参见，例如美国专利申请案刊物第2011/0123532号)。
于一些实施方式中，该异质二聚体分子(例如双特异性药剂)包含选自由下列所组成的群组的重链恒定区：(a)第一人igg1恒定区(其中该在对应于seqidno：15的位置253和292的位置处的氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸替换)及第二人igg1恒定区(其中该在对应于seqidno：15的位置240和282的位置处的氨基酸被赖氨酸替换)；(b)第一人igg2恒定区(其中该在对应于seqidno：16的位置249和288的位置处的氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸替换)及第二人igg2恒定区(其中该在对应于seqidno：16的位置236和278的位置处的氨基酸被赖氨酸替换)；(c)第一人igg3恒定区(其中该在对应于seqidno：17的位置300和339的位置处的氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸替换)及第二人igg3恒定区(其中该在对应于seqidno：17的位置287和329的位置处的氨基酸被赖氨酸替换)；和(d)第一人igg4恒定区(其中该在对应于seqidno：18的位置250和289的位置处的氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸替换)及第二人igg4恒定区(其中该在对应于seqidno：18的位置237和279的位置处的氨基酸被赖氨酸替换)。
于一些实施方式中，该异质二聚体分子(例如双特异性药剂)包含选自由下列所组成的群组的重链ch2和ch3结构域：(a)第一人igg1ch2和ch3结构域(其中该在对应于seqidno：15的位置253和292的位置处的氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸替换)及第二人igg1ch2和ch3结构域(其中该在对应于seqidno：15的位置240和282的位置处的氨基酸被赖氨酸替换)；(b)第一人igg2ch2和ch3结构域(其中该在对应于seqidno：16的位置249和288的位置处的氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸替换)及第二人igg2ch2和ch3结构域(其中该在对应于seqidno：16的位置236和278的位置处的氨基酸被赖氨酸替换)；(c)第一人igg3ch2和ch3结构域(其中该在对应于seqidno：17的位置300和339的位置处的氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸替换)及第二人igg3ch2和ch3结构域(其中该在对应于seqidno：17的位置287和329的位置处的氨基酸被赖氨酸替换)；和(d)第一人igg4ch2和ch3结构域(其中该在对应于seqidno：18的位置250和289的位置处的氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸替换)及第二人igg4ch2和ch3结构域(其中该在对应于seqidno：18的位置237和279的位置处的氨基酸被赖氨酸替换)。
于一些实施方式中，该异质二聚体分子包含二个臂，其中第一臂包含第一人igg1恒定区，该第一人igg1恒定区在对应于seqidno：15的位置253和292的位置处具有氨基酸替换，其中该氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸替换，且第二臂包含第二人igg1恒定区，该第二人igg1恒定区在对应于seqidno：15的位置240和282的位置处具有氨基酸替换，其中该氨基酸被赖氨酸替换。于一些实施方式中，该二个臂包含选自由下列所组成的群组的fc区：seqidno：58、seqidno：59、seqidno：60和seqidno：61。于一些实施方式中，该第一臂包含seqidno：58且第二臂包含seqidno：59。于一些实施方式中，该第一臂包含seqidno：60且第二臂包含seqidno：61。
于一些实施方式中，该异质二聚体分子包含二个臂，其中第一臂包含第一人igg2恒定区，该第一人igg2恒定区在对应于seqidno：16的位置249和288的位置处具有氨基酸替换，其中该氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸替换，且第二臂包含第二人igg2恒定区，该第二人igg2恒定区在对应于seqidno：16的位置236和278的位置处具有氨基酸替换，其中该氨基酸被赖氨酸替换。于一些实施方式中，该二个臂包含选自由下列所组成的群组的fc区：seqidno：26、seqidno：27、seqidno：28、seqidno：29、seqidno：30和seqidno：31。于一些实施方式中，该第一臂包含seqidno：26且第二臂包含seqidno：30。于一些实施方式中，该第一臂包含seqidno：29且第二臂包含seqidno：31。
于一些实施方式中，该多肽或药剂为单价。于一些实施方式中，该多肽或药剂为单价的可溶性蛋白。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂为二价。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂为三价。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂为单特异性。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂为双特异性。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂为多特异性。于一些实施方式中，该药剂为包含二个臂的异质二聚体蛋白，其中至少一个臂为单价。于一些实施方式中，该药剂为包含二个臂的异质二聚体蛋白，其中至少一个臂为二价。于一些实施方式中，该药剂为包含二个臂的异质二聚体蛋白，其中至少一个臂为三价(即，结合三个靶分子)。
于一些实施方式中，该多肽或药剂包含那些基本上与本文所描述的融合蛋白及/或多肽同源的多肽。这些药剂可含有，例如保守性取代突变，即，以类似的氨基酸取代一或多个氨基酸。例如，保守性取代系指以另一在同一总体类别内的氨基酸取代一个氨基酸，诸如，例如以另一酸性氨基酸取代一个酸性氨基酸，以另一碱性氨基酸取代一个碱性氨基酸，或以另一中性氨基酸取代一个中性氨基酸。本技术中熟知意图为保守性氨基酸取代者并描述于本文中。
于某些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂结合gitr并调节免疫反应。于某些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂结合ox40并调节免疫反应。于某些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂结合cd40并调节免疫反应。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂活化及/或增加免疫反应。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂增加、促进或增强由细胞介导的免疫。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂增加、促进或增强由先天细胞介导的免疫。本文所描述的多肽或药剂增加、促进或增强由适应性细胞介导的免疫。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂增加、促进或增强t细胞活性。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂增加、促进或增强cd4+t细胞活性。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂增加、促进或增强cd8+t细胞活性。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂增加、促进或增强ctl活性。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂增加、促进或增强nk细胞活性。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂增加、促进或增强由淋巴因子活化的杀手细胞(lak)活性。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂增加、促进或增强肿瘤浸润淋巴细胞(til)活性。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂抑制或降低treg细胞活性。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂抑制或降低mdsc细胞活性。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂增加、促进或增强肿瘤细胞灭杀。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂增加、促进或增强抑制肿瘤生长。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂增加或增强有效的免疫反应，而不引起实质性副作用及/或基于免疫的毒性。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂增加或增强有效的免疫反应，而不引起细胞因子释放综合征(crs)或细胞因子风暴。
于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂结合gitr并诱导、增强、增加及/或延长gitr信号传导。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂结合ox40并诱导、增强、增加及/或延长ox40信号传导。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂结合cd40并诱导、增强、增加及/或延长cd40信号传导。
于某些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂为人gitr的(直接或间接的)激动剂。于一些实施方式中，该多肽或药剂为gitr激动剂且活化及/或增加免疫反应。于一些实施方式中，该多肽或药剂为gitr激动剂且活化及/或增加nk细胞及/或t细胞的活性(例如细胞溶解活性或产生细胞因子)。于某些实施方式中，该多肽或药剂使该活性增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或约100％。
于某些实施方式中本文所描述的多肽或药剂为人ox40的(直接或间接的)激动剂。于一些实施方式中，该多肽或药剂为ox40激动剂且活化及/或增加免疫反应。于一些实施方式中，该多肽或药剂为ox40激动剂且活化及/或增加nk细胞及/或t细胞的活性(例如细胞溶解活性或产生细胞因子)。于某些实施方式中，该多肽或药剂使该活性增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或约100％。
于某些实施方式中本文所描述的多肽或药剂为人cd40的(直接或间接的)激动剂。于一些实施方式中，该多肽或药剂为cd40激动剂且活化及/或增加免疫反应。于一些实施方式中，该多肽或药剂为cd40激动剂且活化及/或增加nk细胞及/或t细胞的活性(例如细胞溶解活性或产生细胞因子)。于某些实施方式中，该多肽或药剂使该活性增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或约100％。
于某些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂增加nk细胞的活化。于某些实施方式中，该多肽或药剂增加t细胞的活化。于某些实施方式中，藉由该多肽或药剂活化nk细胞及/或t细胞导致nk细胞及/或t细胞的活化水平增加至少约10％、至少约25％、至少约50％至少约75％、至少约90％或至少约95％。
于某些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂抑制或降低treg细胞的遏制活性。于某些实施方式中，该多肽或药剂抑制treg细胞的活性。于某些实施方式中，藉由该多肽或药剂抑制treg细胞的遏制活性导致treg细胞的遏制活性被抑制至少约10％、至少约25％、至少约50％至少约75％、至少约90％或至少约95％。
于某些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂抑制或降低mdsc的抑制活性。于某些实施方式中，该多肽或药剂抑制mdsc的活性。于某些实施方式中，藉由该多肽或药剂抑制mdsc的遏制活性导致mdsc的遏制活性被抑制至少约10％、至少约25％、至少约50％至少约75％、至少约90％或至少约95％。
用于测定多肽或药剂(或候选结合剂)是否调节免疫反应的体内和玻管内分析为本技术所已知或正在研发中。于一些实施方式中，可使用检测t细胞活化的功能分析。于一些实施方式中，可使用检测treg活性的功能分析。于一些实施方式中，可使用检测mdsc活性的功能分析。于一些实施方式中，可使用检测nk细胞活性的功能分析。于一些实施方式中，可使用检测溶细胞性t细胞活性的功能分析。于一些实施方式中，可使用检测细胞因子生产的分析。于一些实施方式中，可使用检测细胞因子生产细胞的分析。
于某些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂能够抑制肿瘤生长。于某些实施方式中，该多肽或药剂能够抑制肿瘤在体内生长(例如，在小鼠模型中及/或患有癌症的人体内)。
于某些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂能够降低肿瘤的致瘤性。于某些实施方式中，该多肽或药剂能够降低在动物模型(诸如小鼠模型)中的肿瘤的致瘤性。于某些实施方式中，该多肽或药剂能够降低在动物模型(诸如小鼠模型)中的包含癌干细胞的肿瘤的致瘤性。于某些实施方式中，肿瘤中的癌干细胞的数量或频率减少至少约2倍、约3倍、约5倍、约10倍、约50倍、约100倍或约1000倍。于某些实施方式中，该癌干细胞的数量或频率的减少系使用动物模型，藉由有限稀释分析法测定。关于使用有限稀释分析法来测定肿瘤中的癌干细胞的数量或频率减少的其他实施例和指导可在，例如国际刊物第wo2008/042236号；美国专利刊物第2008/0064049号；和美国专利刊物第2008/0178305号中找到。
于某些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂具有一或多种下列效果：抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤生长、降低肿瘤的致瘤性、藉由减低肿瘤中的癌干细胞的频率来降低肿瘤的致瘤性、触发肿瘤细胞的细胞死亡、增加细胞接触依赖性生长抑制、增加肿瘤细胞的细胞凋亡、减少上皮间质细胞转换(epithelialmesenchymaltransition)(emt)或减少肿瘤细胞的存活。于一些实施方式中，该多肽或药剂具有一或多种下列效果：抑制病毒感染、抑制慢性病毒感染、减少病毒荷载、触发经病毒感染的细胞的细胞死亡或减少经病毒感染的细胞的数量或百分比。
于某些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂在小鼠、大鼠、食蟹猴或人体内具有至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约2天、至少约3天、至少约1周、至少约2周或至少3周的循环半衰期。于某些实施方式中，该多肽或药剂为igg(例如igg1或igg2)融合蛋白，其在小鼠、大鼠、食蟹猴或人体内具有至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约3天、至少约1周、至少约2周或至少3周的循环半衰期。增加(或减少)药剂(诸如多肽和可溶性受体)的半衰期的方法为本技术所已知。例如，已知的增加igg融合蛋白的循环半衰期的方法包括在fc区中引入可增加抗体在ph6.0下与新生儿fc受体(fcrn)的ph依赖性结合的突变。已知的增加缺乏fc区的可溶性受体的循环半衰期的方法包括诸如聚乙二醇化之类的这些技术。
于本发明的一些实施方式中，该药剂为多肽。该多肽可为结合gitr的重组多肽、天然多肽或合成多肽。该多肽可为结合ox40的重组多肽、天然多肽或合成多肽。该多肽可为结合cd40的重组多肽、天然多肽或合成多肽。多肽结合。本领域技术人员将理解本发明的某些氨基酸序列可在没有显著影响蛋白质的结构或功能下变化。因此，本发明进一步包括显示出对gitr的显著结合活性的多肽的变化。本发明亦包括显示出对ox40的显著结合活性的多肽的变化。本发明亦包括显示出对cd40的显著结合活性的多肽的变化。于一些实施方式中，该多肽的氨基酸序列变化包括缺失、插入、反向、重复子及/或其他类型的取代。
该多肽、其类似物及变体可进一步经修饰以含有通常并非该多肽的部分的额外化学部分。该衍生的部分可改善该多肽的溶解性、生物半衰期及/或吸收。该部分亦可减少或排除该多肽和变体的不利的副作用。化学部分的概述可在remington：thescienceandpracticeofpharmacy,22ndedition,2012,pharmaceuticalpress,london中找到。
本文所描述的多肽可藉由本技术中已知的任何合适的方法生产。该等方法包括直接蛋白质合成法以构建编码多肽序列的dna序列及将那些序列表现在合适的宿主中。于一些实施方式中，dna序列系使用重组技术，藉由分离或合成编码所研究的的野生型蛋白的dna序列来构建。可选择地，该序列可藉由位点特异性诱变法来诱变，以提供其功能类似物。
于一些实施方式中，编码所研究的多肽的dna序列可使用寡核苷酸合成仪，藉由化学合成法构建。寡核苷酸可基于所需多肽的氨基酸序列设计，且选择那些在用于生产所研究的的重组多肽的宿主细胞中较受偏好的密码子。可应用标准方法来合成该编码经分离的所研究的多肽的多核苷酸序列。例如，可使用完整氨基酸序列来构建反译基因。此外，可以合成含有编码特定的经分离的多肽的核苷酸序列的dna寡聚体。例如，可以合成数个编码所研究的多肽的部分的小寡核苷酸，再将它们连接。个别寡聚核苷酸通常含有用于互补组装的5'或3'突出端。
一旦组装(藉由合成、定点诱变或其他方法)后，可将该编码所研究的的特定多肽的多核苷酸序列插入表现载体中，并以可操作的方式连接适合在所需宿主中表现该蛋白质的表现控制序列。适当的组装可藉由核苷酸测序、限制酶定位及/或在合适的宿主中表现生物活性的多肽来确认。如本技术中所熟知的，为了在宿主中取得转染基因的高表现水平，该基因必须以可操作的方式连接可在所选择的表现宿主中运作的转录和翻译表现控制序列。
于某些实施方式中，使用重组表现载体来扩增和表现编码本文所描述的多肽或药剂的dna。例如，重组表现载体可为具有编码该药剂的多肽链的合成或cdna衍生的dna片段的可复制的dna构建体，该合成或cdna衍生的dna片段系可操作地连接源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的合适的转录及/或转译调控组件。转录单位通常包含下列群组的组合：(1)在基因表现中具有调节作用的遗传组件，例如转录启动子或增强子，(2)被转录成mrna及转译成蛋白质的结构性或编码序列，及(3)适当的转录和转译起始及终止序列。调控组件可包括操纵子序列以控制转录。可另外纳入在宿主中复制的能力(通常由复制起点赋予)及选择基因以促进识别转化体。当dna区在功能上彼此相关时，其为“以可操作的方式连接”。例如，若信号肽(分泌前导序列)系以参与多肽的分泌之前体表现时，该信号肽的dna系以可操作的方式连接该多肽的dna；若启动子控制序列的转录时，该启动子系以可操作的方式连接该编码序列；或者若核糖体结合位点定位在可允许转译的位置，该核糖体结合位点系以可操作的方式连接该编码序列。于一些实施方式中，意图用于酵母表现系统的结构组件包括使宿主细胞转译的蛋白分泌到细胞外的前导序列。于其他实施方式中，当重组蛋白质被表现出，而无领导序列或转运序列时，其可包括一个n端甲硫氨酸残基。此残基可选择性地随后从表现的重组蛋白裂解以提供最终产物。
表现控制序列和表现载体的选择系取决于宿主的选择。可使用的表现宿主/载体组合有很多种。用于真核宿主的有用的表现载体包括，例如包含来自sv40、牛乳头状瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表现控制序列的载体。用于细菌宿主的有用的表现载体包括已知的细菌质粒，诸如来自大肠杆菌的质粒(包括pcr1、pbr322、pmb9和其衍生物)及较广宿主范围的质粒，诸如m13及其他丝状单链dna噬菌体。
用于表现多肽(或作为靶的蛋白质)的合适宿主细胞包括在适当的启动子控制下的原核生物、酵母细胞、昆虫细胞或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或芽孢杆菌。高等真核细胞包括如下述的己建立的哺乳动物来源细胞系。亦可采用无细胞的转译系统。与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的适当的克隆和表现载体为本技术领域的技术人员所周知。
用于表现重组多肽的哺乳动物细胞培养系统有各式各样。在哺乳动物细胞中表现重组蛋白可能较佳，因为该等蛋白质通常被正确折叠、经适当修饰且为生物学上有功能的。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括cos-7(源自猴肾)、l-929(源自鼠母纤维细胞)、c127(源自鼠乳腺肿瘤)、3t3(源自鼠纤维母细胞)、cho(源自中国仓鼠卵巢)、hela细胞(源自人子宫颈癌)、bhk(源自仓鼠肾成纤维细胞来源)和hek-293(源自人胚肾)细胞系及其变体。哺乳动物表现载体可包含非转录组件，诸如复制起点、合适的启动子和连接欲表现的基因的增强子及其他5'或3'侧翼非转录序列，和5'或3'非转译序列，诸如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点及转录终止序列。
在昆虫细胞培养系统(例如杆状病毒)中表现重组蛋白亦提供用于生产正确折叠及生物学上有功能的蛋白质的可靠方法。用于在昆虫细胞中生产异源蛋白的杆状病毒系统为本技术领域的技术人员所周知。
因此，本发明提供包含本文所描述的多肽和药剂的细胞。于一些实施方式中，该细胞生产本文所描述的多肽和药剂。于某些实施方式中，该细胞生产融合蛋白。于一些实施方式中，该细胞生产可溶性受体/配体。于一些实施方式中，该细胞生产抗体。于一些实施方式中，该细胞生产双特异性药剂。于一些实施方式中，该细胞生产双特异性抗体。于一些实施方式中，该细胞生产同型二聚体双特异性药剂。于一些实施方式中，该细胞生产异质二聚体双特异性药剂。
由经转化的宿主生产的蛋白质可根据任何合适的方法纯化。标准方法包括色层分析法(例如离子交换、亲和力和尺寸分级柱色层分析法)、离心、差异溶解度或任何其他用于纯化蛋白质的标准技术。可将亲和标签(诸如六组氨酸)、麦芽糖结合结构域、流感涂层序列及麸胱甘肽-s-转移酶连接该蛋白质，以允许藉由通过适当的亲和柱简单纯化。经分离的蛋白质亦可使用诸如蛋白质水解、质谱(ms)、核磁共振(nmr)、高效液相色层分析法(hplc)和x射线晶体学等技术进行物理表征。
于一些实施方式中，首先使用市售的蛋白质浓缩过滤器(例如amicon或milliporepellicon超滤单位)将来自该将重组蛋白分泌入培养基的表现系统的上清液浓缩。浓缩步骤之后，将浓缩物施用在合适的纯化基质。于一些实施方式中，可采用阴离子交换树脂，例如具有二乙胺基乙基(deae)团侧基的基质或底物。该基质可为丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚醣、纤维素或其他常被用来纯化蛋白质的类型。于一些实施方式中，可采用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换器包括含有磺丙基或羧甲基团的各种不溶性基质。于一些实施方式中，可采用羟基磷灰石介质，包括，但不限于陶瓷羟基磷灰石(cht)。于某些实施方式中，可使用一或多个采用疏水性rp-hplc介质(例如具有侧甲基或其他脂族基团的硅胶)的逆相hplc步骤来进一步纯化多肽或药剂。某些或全部的前述纯化步骤(以各种方式组合)亦可用来提供均匀的重组蛋白。
于一些实施方式中，细菌培养物中所生产的重组蛋白可，例如藉由初步萃取从细胞沉淀小丸分离出，再进行一或多个浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色层分析步骤。hplc可用于最终纯化步骤。在重组蛋白质表现中所采用的微生物细胞可藉由任何方便的方法破坏，包括冻融循环、超音波处理、机械破坏或使用细胞溶解剂。
于某些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂为不包含免疫球蛋白fc区的多肽。于某些实施方式中，该多肽包含选自下列群组的类型的蛋白支架：蛋白a、蛋白g、脂质运载蛋白(lipocalin)、纤连蛋白结构域、锚蛋白(ankyrin)共有重复结构域及硫氧还蛋白。本技术中已知各种用于鉴定及生产以高亲和力结合蛋白质靶的非抗体多肽的方法。于某些实施方式中，噬菌体展示技术可用于生产及/或鉴定结合多肽。于某些实施方式中，哺乳动物细胞展示技术可用于生产及/或鉴定结合多肽。
修改多肽以增加(或减少)其血清半衰期可能更为理想。此可，例如藉由诱导多肽中的适当区域突变，将救援性受体结合抗原决定部位纳入该多肽中或藉由将该抗原决定部位纳入肽标签中，再将该肽标签融合至该多肽的任一端或中间(例如藉由dna或多肽合成)来达成。
异源共轭结合分子亦在本发明的范围内。异源共轭结合分子系由二个共价连接的多肽组成。这些分子，例如已被提出将免疫细胞靶向不希望有的细胞，例如肿瘤细胞。亦可预想的是，该异源共轭结合分子可使用合成蛋白化学中已知的方法(包括涉及交联剂者)在玻管内制备。例如，免疫毒素可使用二硫化物交换反应或藉由形成硫醚键来构建。用于此目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇化物和4-巯基丁酰亚氨酸甲酯。
于某些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂可以多种共轭结合(即，免疫共轭结合物或放射共轭结合物)或非共轭结合的形式中的任一种使用。于某些实施方式中，该多肽或药剂可以非共轭结合形式使用以控制该个体的天然防御机制，包括cdc和adcc以排除恶性或癌细胞。
于某些实施方式中，本文所描述的药剂为小分子。术语“小分子”通常系指在定义上并非肽/蛋白质的低分子量有机化合物。
于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂系与细胞毒性剂共轭结合。于一些实施方式中，该细胞毒性剂为化疗剂，包括，但不限于甲胺蝶呤、阿霉素(adriamicin)、阿霉素(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素c、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂。于一些实施方式中，该细胞毒性剂为细菌、真菌、植物或动物来源的酶催化性活性毒素或其片段，包括，但不限于白喉毒素a链(diphtheriaachain)、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素a链、蓖麻毒素a链、相思豆毒蛋白a链(abrinachain)、蒴莲根毒素a链(modeccinachain)、α-帚曲霉素(alpha-sarcin)、油桐蛋白(aleuritesfordiiprotein)、石竹素蛋白(dianthinprotein)、美洲商陆蛋白(phytolacaamericanaprotein)(papi、papⅱ和pap-s)、苦瓜抑制剂(momordicacharantiainhibitor)、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和新月毒素(tricothecenes)。于一些实施方式中，该细胞毒性剂为放射性同位素以制造放射性共轭结合物或放射性共轭结合剂。多种放射性核素可用于制造放射性共轭结合剂，包括，但不限于90y、125i、131i、123i、111in、131in、105rh、153sm、67cu、67ga、166ho、177lu、186re、188re和212bi。亦可以使用多肽或药剂和一或多种小分子毒素的共轭结合物，该小分子毒素有，诸如加利车霉素(calicheamicin)、类美登素(maytansinoid)、单端孢霉毒素(trichothene)和cc1065，及这些毒素的具有毒素活性的衍生物。多肽或药剂和细胞毒性剂的共轭结合物系使用各种双功能蛋白质偶联剂制造，诸如使用n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(spdp)、亚氨基硫烷(it)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如己二亚氨酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如二琥珀酰亚氨辛二酸酯)、醛类(诸如戊二醛)、双迭氮基化合物(诸如双(对-迭氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)及双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
ⅲ.多核苷酸
于某些实施方式中，本发明包含含有编码本文所描述的多肽或药剂的多核苷酸的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”包含仅包括多肽的编码序列的多核苷酸及包括另一编码及/或非编码序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸可为rna的形式或dna的形式。dna包括cdna、基因组dna及合成dna；并可为双链或单链的，且若为单链时，可为编码链或非编码(反义)链。
于某些实施方式中，该多核苷酸包含编码含有选自下列群组的氨基酸序列的多肽的多核苷酸：seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8和seqidno：9。于某些实施方式中，该多核苷酸包含编码含有选自下列群组的氨基酸序列的多肽的多核苷酸：seqidno：42、seqidno：43、seqidno：44、seqidno：45、seqidno：46、seqidno：47、seqidno：48、seqidno：70、seqidno：71、seqidno：72、seqidno：77、seqidno：78、seqidno：79、seqidno：80、和seqidno：81。于某些实施方式中，该多核苷酸包含编码含有选自下列群组的氨基酸序列的多肽的多核苷酸：seqidno：83、seqidno：84、seqidno：85、seqidno：89、seqidno：90、seqidno：91、seqidno：92、seqidno：103、seqidno：104、seqidno：105和seqidno：106。于一些实施方式中，该多核苷酸包含含有选自下列群组的核苷酸序列的多核苷酸：seqidno：22、seqidno：23、seqidno：24、seqidno：25、seqidno：51、seqidno：52、seqidno：53、seqidno：73和seqidno：86。于一些实施方式中，该多核苷酸包含编码本文所描述的任一gitr结合剂的多肽的多核苷酸。于一些实施方式中，该多核苷酸为质粒“hgitrl-higg1”，该质粒在2015年4月21日在布达佩斯条约的条件下保藏在美国维吉尼亚州马纳萨斯市大学大道10801号的atcc，指定编号为pta-122112(其中保藏人参考号(depositorreference)：含合成hucdna的质粒，株系(strain)：h-gitrl-higg1)。于一些实施方式中，该多核苷酸包含编码本文所描述的任一ox40结合剂的多肽的多核苷酸。于一些实施方式中，该多核苷酸包含编码本文所描述的任一cd40结合剂的多肽的多核苷酸。于一些实施方式中，该多核苷酸包含编码本文所描述的任一gitr结合剂的多肽的多核苷酸和信号序列。于一些实施方式中，该多核苷酸包含编码本文所描述的任一ox40结合剂的多肽的多核苷酸和信号序列。于一些实施方式中，该多核苷酸包含编码本文所描述的任一cd40结合剂的多肽的多核苷酸和信号序列。于一些实施方式中，载体包含该多核苷酸。于一些实施方式中，细胞包含该多核苷酸。于一些实施方式中，细胞包含该载体。于一些实施方式中，该细胞为经分离的。
于某些实施方式中，该多核苷酸包含具有核苷酸序列的多核苷酸，该核苷酸序列与编码选自下列群组的氨基酸序列的多核苷酸具有至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少95％的同一性，且于一些实施方式中，具有至少96％、97％、98％或99％的同一性：seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8和seqidno：9。于某些实施方式中，该多核苷酸包含具有核苷酸序列的多核苷酸，该核苷酸序列与编码选自下列群组的氨基酸序列的多核苷酸具有至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少95％的同一性，且于一些实施方式中，具有至少96％、97％、98％或99％的同一性：seqidno：42、seqidno：43、seqidno：44、seqidno：45、seqidno：46、seqidno：47、seqidno：48、seqidno：70、seqidno：71、seqidno：72、seqidno：77、seqidno：78、seqidno：79、seqidno：80和seqidno：81。于某些实施方式中，该多核苷酸包含具有核苷酸序列的多核苷酸，该核苷酸序列与编码选自下列群组的氨基酸序列的多核苷酸具有至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少95％的同一性，且于一些实施方式中，具有至少96％、97％、98％或99％的同一性：seqidno：83、seqidno：84、seqidno：85、seqidno：89、seqidno：90、seqidno：91、seqidno：92、seqidno：103、seqidno：104、seqidno：105和seqidno：106。
亦提供包含与编码选自下列群组的氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸的多核苷酸：seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8和seqidno：9。亦提供包含与编码选自下列群组的氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸的多核苷酸：seqidno：42、seqidno：43、seqidno：44、seqidno：45、seqidno：46、seqidno：47、seqidno：48、seqidno：70、seqidno：71、seqidno：72、seqidno：77、seqidno：78、seqidno：79、seqidno：80和seqidno：81。亦提供包含与编码选自下列群组的氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸的多核苷酸：seqidno：83、seqidno：84、seqidno：85、seqidno：89、seqidno：90、seqidno：91、seqidno：92、seqidno：103、seqidno：104、seqidno：105和seqidno：106。于某些实施方式中，该杂交是在高度严格的条件下进行。高度严格的条件为本技术的技术人员已知且可包括，但不限于(1)采用低离子强度和高温来清洗，例如50℃的具有0.1％十二烷基硫酸钠的15mm氯化钠/1.5mm柠檬酸钠(1×ssc)；(2)在杂交期间采用变性剂，诸如甲酰胺，例如42℃的50％(v/v)甲酰胺加上0.1％牛血清白蛋白/0.1％ficoll/0.1％聚乙烯吡咯啶酮/50mm磷酸钠缓冲液，ph6.5，在5×ssc(0.75mnacl、75mm柠檬酸钠)中；或(3)采用42℃的50％甲酰胺、5×ssc、50mm磷酸钠(ph6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×denhardt氏溶液、经超音波处理的鲑鱼精子dna(50μg/ml)、0.1％sds和10％硫酸葡聚醣，以55℃的含有50％甲酰胺的0.2×ssc清洗液清洗，随后以55℃的含有edta的0.1×ssc高度严格清洗液清洗。
于某些实施方式中，该多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，该成熟多肽融合至同一阅读框架中可协助，例如从宿主细胞表现和分泌多肽的多核苷酸(例如作为控制多肽从细胞转运的分泌序列的前导序列)。具有前导序列的多肽为前蛋白且可具有由宿主细胞裂解的前导序列，以形成成熟型多肽。该多核苷酸亦可编码为成熟蛋白加另一5'氨基酸残基的前蛋白。具有原序列(pro-sequence)的成熟蛋白为原蛋白(pro-protein)且为蛋白质的非活性形式。一旦原序列被裂解，活性成熟蛋白仍然保留。
于某些实施方式中，该多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，该成熟多肽融合至同一阅读框架中可允许，例如纯化所编码的多肽的标记序列。例如，该标记序列可为由pqe-9载体提供的六-组氨酸标签，以用于纯化与该标记融合的成熟多肽(在细菌宿主的情况中)，或者当使用哺乳动物宿主(例如cos-7细胞)时，该标记序列可为源自流感血凝素蛋白的血凝素(ha)标签。于一些实施方式中，该标记序列为flag标签(序列dykddddk(seqidno：39)的肽)，其可与其他亲和标签结合使用。
本发明进一步关于上述的编码，例如片段、类似物及/或衍生物的多核苷酸的变体。
于某些实施方式中，本发明提供多核苷酸，该多核苷酸包含具有如下述的核苷酸序列的多核苷酸：该核苷酸序列与编码包含本文所描述的多肽或药剂的多肽的多核苷酸具有至少约80％的同一性、至少约85％的同一性、至少约90％的同一性、至少约95％的同一性，且于一些实施方式中，具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。
如本文所使用的短语该多核苷酸具有与参考核苷酸序列具有至少95％“同一性”的核苷酸序列意指该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相一致，除了该多核苷酸序列在每100个该参考核苷酸序列的核苷酸中可包括高达五个点突变外。换言之，为了取得具有与参考核苷酸序列具有至少95％的同一性的核苷酸序列的多核苷酸，可将该参考序列中至多5％的核苷酸删除或以另一核苷酸取代，或可将至多为参考序列的总核苷酸数的5％的核苷酸数插入该参考序列中。这些参考序列的突变可发生在该参考核苷酸序列的5'或3'端位置或介于那些终端位置之间的任何位置处(个别穿插在该参考序列的核苷酸之间或在该参考序列内的一或多个连续群组中)。
该多核苷酸变体可在编码区、非编码区或此二者中含有改变。于一些实施方式中，该多核苷酸变体含有的改变会产生沉默取代、添加或缺失，但不会改变所编码的多肽的性质或活性。于一些实施方式中，该多核苷酸变体包含沉默取代，其导致该多肽的氨基酸序列没有改变(由于遗传密码的简并性)。多核苷酸变体的产生可有多种原因，例如为了优化特定宿主的密码子表现(即，将人mrna中的密码子改变成细菌宿主(诸如大肠杆菌)所偏好者)。于一些实施方式中，多核苷酸变体在序列的非编码或编码区中包含至少一个沉默突变。
于一些实施方式中，产生多核苷酸变体以调节或改变所编码的多肽的表现(或表现水平)。于一些实施方式中，产生多核苷酸变体以增加所编码的多肽的表现。于一些实施方式中，产生多核苷酸变体以减少所编码的多肽的表现。于一些实施方式中，与亲代多核苷酸序列相比较，多核苷酸变体已增加所编码的多肽的表现。于一些实施方式中，与亲代多核苷酸序列相比较，多核苷酸变体已减少所编码的多肽的表现。
于一些实施方式中，产生至少一个多核苷酸变体(不改变所编码的多肽的氨基酸序列)以增加异质二聚体分子的生产。于一些实施方式中，产生至少一个多核苷酸变体(不改变所编码的多肽的氨基酸序列)以增加双特异性药剂、双特异性抗体或异质二聚体药剂的生产。
于某些实施方式中，该多核苷酸为经分离的。于某些实施方式中，该多核苷酸基本上为纯的。
亦提供包含本文所描述的多核苷酸的载体和细胞。于一些实施方式中，该表现载体包含多核苷酸分子。于一些实施方式中，该宿主细胞包含含有该多核苷酸分子的表现载体。于一些实施方式中，该宿主细胞包含多核苷酸分子。
iv.使用方法及药物组成物
本发明的多肽或药剂可用于各种应用中，包括，但不限于治疗性治疗方法，诸如用于癌症的免疫疗法。于某些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂可用于活化、促进、增加及/或增强免疫反应、抑制肿瘤生长、减少肿瘤体积、诱导肿瘤消退、增加肿瘤细胞凋亡及/或减少肿瘤的致瘤性。于某些实施方式中，本发明的多肽或药剂亦可用于针对病原体(诸如病毒)的免疫治疗。于某些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂可用于抑制病毒感染、减少病毒感染、增加经病毒感染的细胞凋亡及/或增加灭杀经病毒感染的细胞。使用方法可为玻管内、活体外或体内方法。
本发明提供使用本文所描述的多肽或药剂活化个体的免疫反应的方法。于一些实施方式中，本发明提供使用本文所描述的多肽或药剂促进个体的免疫反应的方法。于一些实施方式中，本发明提供使用本文所描述的多肽或药剂增加个体的免疫反应的方法。于一些实施方式中，本发明提供使用本文所描述的多肽或药剂增强个体的免疫反应的方法。于一些实施方式中，免疫反应的活化、促进、增加及/或增强包含增加由细胞介导的免疫力。于一些实施方式中，免疫反应的活化、促进、增加及/或增强包含增加th1-型反应。于一些实施方式中，免疫反应的活化、促进、增加及/或增强包含增加t细胞活性。于一些实施方式中，免疫反应的活化、促进、增加及/或增强包含增加cd4+t细胞活性。于一些实施方式中，免疫反应的活化、促进、增加及/或增强包含增加cd8+t细胞活性。于一些实施方式中，免疫反应的活化、促进、增加及/或增强包含增加ctl活性。于一些实施方式中，免疫反应的活化、促进、增加及/或增强包含增加nk细胞活性。于一些实施方式中，免疫反应的活化、促进、增加及/或增强包含增加t细胞活性及增加nk细胞活性。于一些实施方式中，免疫反应的活化、促进、增加及/或增强包含增加ctl活性及增加nk细胞活性。于一些实施方式中，免疫反应的活化、促进、增加及/或增强包含抑制或降低treg细胞的抑制活性。于一些实施方式中，免疫反应的活化、促进、增加及/或增强包含抑制或降低mdsc的抑制活性。于一些实施方式中，免疫反应的活化、促进、增加及/或增强包含增加记忆t细胞百分比的数目。于一些实施方式中，免疫反应的活化、促进、增加及/或增强包含增加长期免疫记忆功能。于一些实施方式中，免疫反应的活化、促进、增加及/或增强包含增加长期记忆。于一些实施方式中，免疫反应的活化、促进、增加及/或增强包含无实质性副作用及/或基于免疫的毒性的证据。于一些实施方式中，免疫反应的活化、促进、增加及/或增强包含无细胞因子释放综合征(crs)或细胞因子风暴的证据。于一些实施方式中，该免疫反应为抗原刺激的结果。于一些实施方式中，该抗原刺激为肿瘤细胞。于一些实施方式中，该抗原刺激为癌症。于一些实施方式中，该抗原刺激为病原体。于一些实施方式中，该抗原刺激为经病毒感染的细胞。
用于测定药剂或多肽是否调节、活化或抑制免疫反应的体内和玻管内分析为本技术中所已知或正在研发中。
于一些实施方式中，增加个体的免疫反应的方法包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂结合人gitr。于一些实施方式中，增加个体的免疫反应的方法包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂为特异结合gitr的单链融合。于一些实施方式中，增加个体的免疫反应的方法包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂包含单链gitrl三聚体。
于一些实施方式中，增加个体的免疫反应的方法包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂结合人ox40。于一些实施方式中，增加个体的免疫反应的方法包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂为特异结合ox40的单链融合多肽。于一些实施方式中，增加个体的免疫反应的方法包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂包含单链ox40l三聚体。
于一些实施方式中，增加个体的免疫反应的方法包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂结合人cd40。于一些实施方式中，增加个体的免疫反应的方法包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂为特异结合cd40的单链融合多肽。于一些实施方式中，增加个体的免疫反应的方法包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂包含单链cd40l三聚体。
于本文所描述的方法的某些实施方式中，活化或增强对肿瘤的持续性或长期免疫反应的方法包含施用个体治疗有效量的结合人gitr的多肽或药剂。于一些实施方式中，活化或增强对肿瘤的持续性免疫反应的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂为特异结合gitr的单链融合多肽。于一些实施方式中，活化或增强对肿瘤的持续性免疫反应的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂包含单链gitrl三聚体。于一些实施方式中，该多肽包含单链gitrl三聚体和fc区。于一些实施方式中，该多肽为336b3。于一些实施方式中，该多肽为336b11。
于本文所描述的方法的某些实施方式中，活化或增强对肿瘤的持续性或长期免疫反应的方法包含施用个体治疗有效量的结合人ox40的多肽或药剂。于一些实施方式中，活化或增强对肿瘤的持续性免疫反应的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂为特异结合ox40的单链融合多肽。于一些实施方式中，活化或增强对肿瘤的持续性免疫反应的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂包含单链ox40l三聚体。于一些实施方式中，该多肽包含单链ox40l三聚体和fc区。
于本文所描述的方法的某些实施方式中，活化或增强对肿瘤的持续性或长期免疫反应的方法包含施用个体治疗有效量的结合人cd40的多肽或药剂。于一些实施方式中，活化或增强对肿瘤的持续性免疫反应的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂为特异结合cd40的单链融合多肽。于一些实施方式中，活化或增强对肿瘤的持续性免疫反应的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂包含单链cd40l三聚体。于一些实施方式中，该多肽包含单链cd40l三聚体和fc区。
于本文所描述的方法的某些实施方式中，诱导抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的持久或长期免疫力的方法包含施用个体治疗有效量的结合人gitr的多肽或药剂。于一些实施方式中，诱导抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的持久免疫力的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂为特异结合gitr的单链融合多肽。于一些实施方式中，诱导抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的持久免疫力的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂包含单链gitrl三聚体。于一些实施方式中，该多肽包含单链gitrl三聚体和fc区。于一些实施方式中，该多肽为336b3。于一些实施方式中，该多肽为336b11。
于本文所描述的方法的某些实施方式中，诱导抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的持久或长期免疫力的方法包含施用个体治疗有效量的结合人ox40的多肽或药剂。于一些实施方式中，诱导抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的持久免疫力的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂为特异结合ox40的单链融合多肽。于一些实施方式中，诱导抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的持久免疫力的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂包含单链ox40l三聚体。于一些实施方式中，该多肽包含单链ox40l三聚体和fc区。
于本文所描述的方法的某些实施方式中，诱导抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的持久或长期免疫力的方法包含施用个体治疗有效量的结合人cd40的多肽或药剂。于一些实施方式中，诱导抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的持久免疫力的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂为特异结合cd40的单链融合多肽。于一些实施方式中，诱导抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的持久免疫力的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂包含单链cd40l三聚体。于一些实施方式中，该多肽包含单链cd40l三聚体和fc区。
于本文所描述的方法的某些实施方式中，抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的方法包含施用个体治疗有效量的结合人gitr的多肽或药剂。于一些实施方式中，抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂为特异结合gitr的单链融合多肽。于一些实施方式中，抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂包含单链gitrl三聚体。于一些实施方式中，该多肽包含单链gitrl三聚体和fc区。于一些实施方式中，该多肽为336b3。于一些实施方式中，该多肽为336b11。
于本文所描述的方法的某些实施方式中，抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的方法包含施用个体治疗有效量的结合人ox40的多肽或药剂。于一些实施方式中，抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂为特异结合ox40的单链融合多肽。于一些实施方式中，抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂包含单链ox40l三聚体。于一些实施方式中，该多肽包含单链ox40l三聚体和fc区。
于本文所描述的方法的某些实施方式中，抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的方法包含施用个体治疗有效量的结合人cd40的多肽或药剂。于一些实施方式中，抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂为特异结合cd40的单链融合多肽。于一些实施方式中，抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂，其中该多肽或药剂包含单链cd40l三聚体。于一些实施方式中，该多肽包含单链cd40l三聚体和fc区。
本发明亦提供使用本文所描述的多肽或药剂抑制肿瘤生长的方法。于某些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包含将细胞混合物与多肽或药剂在玻管内接触。例如，将与免疫细胞(例如t细胞、溶细胞性t细胞或nk细胞)混合的永生化细胞系或癌细胞系培养在添加测试药剂的培养基中。于一些实施方式中，将肿瘤细胞从患者样本(诸如，例如组织活体切片、胸腔积液或血液样本)中分离，与免疫细胞(例如t细胞、溶细胞性t细胞及/或nk细胞)混合，并在添加测试药剂的培养基中培养。于一些实施方式中，该多肽或药剂增加、促进及/或增强免疫细胞的活性。于一些实施方式中，该多肽或药剂抑制肿瘤细胞生长。
于一些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包含将肿瘤或肿瘤细胞与本文描述的多肽或药剂在体内接触。于某些实施方式中，将肿瘤或肿瘤细胞与多肽或药剂接触是在动物模型中进行。例如，可将测试药剂施用具有肿瘤的小鼠。于一些实施方式中，该多肽或药剂增加、促进及/或增强小鼠中的免疫细胞的活性。于一些实施方式中，该多肽或药剂抑制肿瘤生长。于一些实施方式中，该多肽或药剂是在肿瘤细胞被引入动物的同时或引入后不久施用，以防止肿瘤生长(“预防模式”)。于一些实施方式中，该多肽或药剂是在肿瘤已长至具体指明的尺寸后施用以作为治疗剂(“治疗模式”)。
于某些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包含施用个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂。于某些实施方式中，该个体是人。于某些实施方式中，该个体具有肿瘤或该个体具有已除去的肿瘤。
此外，本发明提供抑制个体中肿瘤生长的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂。于某些实施方式中，该肿瘤包含癌干细胞。于某些实施方式中，该肿瘤中的癌干细胞的频率系藉由施用该多肽或药剂来降低。于一些实施方式中，提供降低个体肿瘤中的癌干细胞的频率的方法，该方法包含施用该个体治疗有效量的多肽或药剂。于一些实施方式中，该多肽为336b3。于一些实施方式中，该多肽为336b11。
此外，本发明提供降低个体中的肿瘤的致瘤性的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂。于某些实施方式中，该肿瘤包含癌干细胞。于一些实施方式中，该肿瘤的致瘤性系藉由降低该肿瘤中的癌干细胞的频率来降低。于一些实施方式中，该方法包含使用本文所描述的多肽或药剂。于某些实施方式中，该肿瘤中的癌干细胞的频率是藉由施用多肽或药剂来降低。
于一些实施方式中，该肿瘤为实体瘤。于某些实施方式中，该肿瘤是选自由下列所组成的群组：结肠直肠瘤、胰脏瘤、肺肿瘤、卵巢瘤、肝肿瘤、乳房肿瘤、肾脏瘤、前列腺瘤、神经内分泌瘤、胃肠道瘤、黑色素瘤、子宫颈瘤、膀胱瘤、胶质母细胞瘤及头颈瘤。于某些实施方式中，该肿瘤为结肠直肠瘤。于某些实施方式中，该肿瘤为卵巢瘤。于一些实施方式中，该肿瘤为肺肿瘤。于某些实施方式中，该肿瘤为胰脏瘤。于某些实施方式中，该肿瘤为黑色素瘤。于一些实施方式中，该肿瘤为膀胱瘤。
于一些实施方式中，该肿瘤表现或过表现被该多肽或药剂(诸如包含特异结合该肿瘤抗原的抗原结合位点的双特异性药剂)靶向的肿瘤抗原。
本发明进一步提供用于治疗个体的癌症的方法，其包含施用该个体治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂。于一些实施方式中，该多肽或药剂结合gitr并抑制或减少癌症生长。于一些实施方式中，该多肽或药剂结合ox40并抑制或减少癌症生长。于一些实施方式中，该多肽或药剂结合cd40并抑制或减少癌症生长。于一些实施方式中，该多肽为336b3。于一些实施方式中，该多肽为336b11。
本发明提供治疗癌症的方法，其包含施用个体(例如需要治疗的个体)治疗有效量的本文所描述的多肽或药剂。于某些实施方式中，该个体为人。于某些实施方式中，该个体具有癌性肿瘤。于某些实施方式中，该个体已去除肿瘤。
于某些实施方式中，该癌症为选自由下列所组成的群组的癌症：结肠直肠癌、胰脏癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、肾脏癌、前列腺癌、胃肠癌、黑色素瘤、子宫颈癌、神经内分泌癌、膀胱癌、脑癌、胶质母细胞瘤及头颈癌。于某些实施方式中，该癌症为胰脏癌。于某些实施方式中，该癌症为卵巢癌。于某些实施方式中，该癌症为结肠直肠癌。于某些实施方式中，该癌症为乳癌。于某些实施方式中，该癌症为前列腺癌。于某些实施方式中，该癌症是肺癌。于某些实施方式中，该癌症为黑色素瘤。于一些实施方式中，该癌症为膀胱癌。
于一些实施方式中，该癌症为血液癌症。于一些实施方式中，该癌症是选自由下列所组成的群组：急性骨髓性白血病(aml)、何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、t细胞急性淋巴母细胞性白血病(t-all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、发细胞白血病、慢性骨髓性白血病(cml)、非何杰金氏淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、套细胞淋巴瘤(mcl)及皮肤t细胞淋巴瘤(ctcl)。
本发明亦提供活化或增强细胞中的tnfrsf(例如gitr、ox40或cd40)信号传导的方法，其包含将细胞与有效量的本文所描述的多肽或药剂接触。于一些实施方式中，活化或增强细胞中的gitr信号传导的方法包含将细胞与有效量的本文所描述的gitr结合多肽或药剂接触。于一些实施方式中，活化或增强细胞中的ox40信号传导的方法包含将细胞与有效量的本文所描述的ox40结合多肽或药剂接触。于一些实施方式中，活化或增强细胞中的cd40信号传导的方法包含将细胞与有效量的本文所描述的cd40结合多肽或药剂接触。于一些实施方式中，该多肽为336b3。于一些实施方式中，该多肽为336b11。于某些实施方式中，该细胞为t细胞。于一些实施方式中，该细胞为溶细胞性细胞。于一些实施方式中，该细胞为ctl。于一些实施方式中，该细胞为nk细胞。于某些实施方式中，该方法为一种体内方法，其中将细胞与多肽或药剂接触的步骤包含施用个体治疗有效量的多肽或药剂。于一些实施方式中，该方法为玻管内或活体外方法。
本发明提供测定tnfrsf及/或tnfsf的表现水平的方法。于一些实施方式中，测定gitr的表现水平。于一些实施方式中，测定gitrl的表现水平。于一些实施方式中，测定ox40的表现水平。于一些实施方式中，测定ox40l的表现水平。于一些实施方式中，测定cd40的表现水平。于一些实施方式中，测定cd40l的表现水平。用于测定细胞、肿瘤或癌症中的核酸表现水平的方法为本技术领域的技术人员所已知。这些方法包括，但不限于基于pcr的分析、微阵列分析及核苷酸测序(例如nextgen测序)。用于测定细胞、肿瘤或癌症中的蛋白质表现水平的方法包括，但不限于蛋白质印迹分析、蛋白质阵列、elisa、免疫组织化学(ihc)及facs。
用于测定肿瘤或癌症的核酸或蛋白质表现水平是否升高的方法可以使用各种样本。于一些实施方式中，该样本是从具有肿瘤或癌症的个体取得。于一些实施方式中，该样本为新鲜肿瘤/癌症样本。于一些实施方式中，该样本为冷冻的肿瘤/癌症样本。于一些实施方式中，该样本为经福尔马林固定的经石蜡包埋的样本。于一些实施方式中，该样本为血液样本。于一些实施方式中，该样本为血浆样本。于一些实施方式中，该样本系经处理成细胞裂解液。于一些实施方式中，该样本系经处理成dna或rna。
本发明提供包含本文所描述的多肽或药剂的组成物。本发明亦提供包含本文所描述的多肽或药剂及医药上可接受的载体的医药组成物。于一些实施方式中，该医药组成物可用于免疫疗法中。于一些实施方式中，该医药组成物可用于免疫肿瘤学中。于一些实施方式中，该医药组成物可用于抑制肿瘤生长。于一些实施方式中，该医药组成物可用于抑制个体(例如人患者)中的肿瘤生长。于一些实施方式中，该组成物可用于治疗癌症。于一些实施方式中，该医药组成物可用于治疗个体(例如人患者)中的癌症。
藉由组合本发明的纯化药剂与医药上可接受的载体(例如载体或赋形剂)来制备用于储存及使用的调合物。本技术领域的技术人员通常将医药上可接受的载体、赋形剂及/或稳定剂视为调合物或医药组成物的无活性的成分。
于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂系在包含20mm组氨酸、40mmnacl、5％蔗糖及0.01％聚山梨醇酯20的缓冲液中配制。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂系在包含20mm组氨酸、40mmnacl、5％蔗糖及0.01％聚山梨醇酯20，ph5.5的缓冲液中配制。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂系在包含20mm组氨酸、40mmnacl、5％蔗糖及0.01％聚山梨醇酯20，ph6.0的缓冲液中配制。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂系在包含20mm组氨酸、40mmnacl、5％蔗糖及0.01％聚山梨醇酯20，ph6.5的缓冲液中配制。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂系在包含20mm组氨酸、100mmnacl、150mm蔗糖及0.01％聚山梨醇酯20，ph6.0的缓冲液中配制。于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂系在包含10mm磷酸钾及0.04％聚山梨醇酯20，ph7.5的缓冲液中配制。
因此，于一些实施方式中，本发明提供包含本文所描述的多肽或药剂和进一步包含约20mm组氨酸、约40mmnacl、约5％蔗糖及约0.01％聚山梨醇酯20的组成物或医药组成物。于一些实施方式中，该组成物的ph值为约ph5.5、约ph6.0或约ph6.5。
于一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂系经冻干及/或以冻干形式储存。于一些实施方式中，包含本文所描述的多肽或药剂的调合物是经冻干。
合适的医药上可接受的载剂包括，但不限于非毒性缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；盐类，诸如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，诸如十八烷基二甲苄基氯化铵、氯化六烃季铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁基或苄基醇、烷基对羟基苯甲酸酯，诸如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇及间-甲酚；低分子量多肽(例如少于约10个氨基酸残基)；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，诸如单糖、双糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖分，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡离子，诸如钠；金属复合物，诸如锌-蛋白质复合物；及非离子性表面活性剂，诸如tween或聚乙二醇(peg)。(remington:thescienceandpracticeofpharmacy,22ndedition,2012,pharmaceuticalpress,london.)。
本发明的医药组成物可以任何数目的方式施用以用于局部或全身治疗。施用可藉由表皮或透皮贴剂、软膏、涂剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末局部施用；藉由吸入或吹入粉末或气雾剂经由肺部施用，包括藉由喷雾器(气管内和鼻内)；口服；或肠胃道外施用，包括静脉内、动脉内、肿瘤内、皮下、腹膜内、肌肉内(例如注射或输注)或颅内(例如鞘内或心室内)。
该治疗调合物可为单位剂型。该等调合物包括片剂、丸剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、溶液、或在水中或非水性介质中的悬浮液、或栓剂。于固体组成物(诸如片剂)中，该主要活性成分系与制药载体混合。公知的制锭成分包括玉米粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶及稀释剂(例如水)。这些可用于形成含有本发明化合物或其非毒性的医药上可接受的盐的均匀混合物的固体预调配组成物。然后，将该固体预调配组成物再分成上述类型的单位剂型。该调合物或组成物的片剂、丸剂，等可经涂层或以其他方式化合，以提供能提供延长作用的优点的剂型。例如，该片剂或丸剂可包含被外组分覆盖的内部组成物。此外，该两种组分可藉由用于抵抗崩解及允许内部组分完整通过胃或延迟释放的肠溶层分开。该等肠溶层或包衣可使用各种材料，该等材料包括许多聚合酸及聚合酸与诸如虫胶、鲸蜡醇及醋酸纤维素之类的材料的混合物。
本文所描述的多肽或药剂亦可被包在微胶囊中。该等微胶囊是，例如在胶状药物投递系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或微乳剂中藉由凝聚技术或藉由界面聚合化制备，例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，如remington:thescienceandpracticeofpharmacy,22ndedition,2012,pharmaceuticalpress,london中的描述。
于某些实施方式中，医药调合物包括与脂质体复合的本发明的多肽或药剂。生产脂质体的方法为本技术领域的技术人员所周知。例如，某些脂质体可藉由与包含磷脂酰胆碱、胆固醇和peg衍生的磷脂酰乙醇胺(peg-pe)的脂质组成物逆相蒸发来生成。脂质体可通过具限定孔径的过滤器挤出以产生具有所需直径的脂质体。
于某些实施方式中，可制造包含本文所描述的多肽或药剂的持续释放制剂。持续释放的制剂的合适实例包括含有多肽或药剂的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，其中该基质为成形物品形式(例如薄膜或微胶囊)。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(诸如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯、l-谷氨酸7乙基-l-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，诸如luprondepottm(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林所组成的注射微球)、醋酸异丁酸蔗糖酯及聚-d-(-)-3-羟基丁酸。
于某些实施方式中，除了施用本文所描述的多肽或药剂外，该方法或治疗进一步包含施用至少一种另外的免疫反应刺激剂。于一些实施方式中，该另外的免疫反应刺激剂包括，但不限于集落刺激因子(例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、干细胞因子(scf))、白介素(例如il-1、il-2、il-3、il-7、il-12、il-15、il-18)、检查点抑制剂、阻断免疫抑制功能的抗体(例如抗ctla-4抗体、抗cd28抗体、抗cd3抗体)、toll样受体(例如tlr4、tlr7、tlr9)或b7族的成员(例如cd80、cd86)。另外的免疫反应刺激剂可在施用该多肽或药剂之前、与其同时及/或随后施用。亦提供包含多肽或药剂和免疫反应刺激剂的医药组成物。于一些实施方式中，该免疫反应刺激剂包含1、2、3或更多种免疫反应刺激剂。
于某些实施方式中，除了施用本文所描述的多肽或药剂外，该方法或治疗进一步包含施用至少一种另外的治疗剂。另外的治疗剂可在施用该多肽或药剂之前、与其同时及/或随后施用。亦提供包含多肽或药剂和另外的治疗剂的医药组成物。于一些实施方式中，该至少一种另外的治疗剂包含1、2、3或更多种另外的治疗剂。
具有二或多种治疗剂的合并治疗通常使用藉由不同作用机制运作的药剂，尽管这并非必需的。使用具有不同作用机制的药剂的合并治疗可导致加成或协同效果。合并治疗可允许各药剂使用较单一疗法中所使用的剂量更低的剂量，从而降低毒性副作用及/或增加该多肽或药剂的治疗指数。合并治疗可降低发展出耐药性癌细胞的可能性。于一些实施方式中，合并治疗包含影响免疫反应(例如增强或活化反应)的治疗剂及影响(例如抑制或杀死)肿瘤/癌细胞的治疗剂。
于本文所描述的方法的一些实施方式中，本文所描述的多肽或药剂和至少一种另外的治疗剂的组合导致加成或协同效果。于一些实施方式中，合并治疗导致该多肽或药剂的治疗指数增加。于一些实施方式中，合并治疗导致该另外的治疗剂的治疗指数增加。于一些实施方式中，合并治疗导致该多肽或药剂的毒性及/或副作用减少。于一些实施方式中，合并治疗导致该另外的治疗剂的毒性及/或副作用减少。
有用的治疗剂类型包括，例如抗微管蛋白剂、奥里斯他汀(auristatin)、dna小沟结合剂、dna复制抑制剂、烷基化剂(例如铂复合物，诸如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂复合物和卡铂)、蒽环类、抗生素、抗叶酸、抗代谢物、化疗增敏剂、多卡米星(duocarmycin)、依托泊苷(etoposides)、氟伧嘧啶、离子载体(ionophore)、lexitropsin、亚硝基脲、顺氯胺铂(platinol)、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素(puromycin)、辐射敏化剂、类固醇、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱，等。于某些实施方式中，第二治疗剂为烷化剂、抗代谢物、抗有丝分裂剂、拓扑异构酶抑制剂或血管生成抑制剂。
可与本文所描述的多肽或药剂组合施用的治疗剂包括化疗剂。因此，于一些实施方式中，该方法或治疗涉及组合施用本发明的多肽或药剂和化疗剂，或化疗剂的混合物。以多肽或药剂进行的治疗可在施用化疗之前、同时或随后发生。组合施用可包括共同施用(在单一医药调合物中或使用分开的调合物)，或连续施用(依序，或大致上在一段时间内，使得所有活性剂可同时发挥其生物学活性)。该等化疗剂的制备和给药方案可根据制造商的指示使用或由熟练的从业人员凭经验决定。该等化疗的制备和给药方案亦描述于thechemotherapysourcebook,4thedition,2008,m.c.perry,editor,lippincott,williams&wilkins,philadelphia,pa中。
用于本发明中的化疗剂包括，但不限于烷基化剂，诸如塞替派及环磷酰胺(cytoxan)；烷基磺酸酯，诸如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridine)，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredopa)；亚乙基亚胺类和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三轻甲蜜胺(trimemylolomelamine)；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧化氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆留醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard)；亚硝基脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、吡葡亚硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，诸如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c(cactinomycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、卡拉比星、去甲柔红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、更生霉素、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-二氮基-5-合氧基-l-正白氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、霉酚酸、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、鸟苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲胺蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，诸如二甲素酸(denopterin)、甲胺蝶呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytosinearabinoside)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-fu；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid)；安吖啶(amsacrine)；曲布赛(bestrabucil)；蒽双咪腙(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷胺(defosfamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋鞍(elliptiniumacetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多醣(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫呢达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；psk；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；螺环锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；氨基甲酸乙酯(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(ara-c)；类紫杉醇，例如太平洋紫杉醇(taxol)和多西紫杉醇(docetaxel)(taxotere)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素c；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；柔红霉素；氨基蝶呤(aminopterin)；伊班膦酸钠(ibandronate)；cpt11；拓扑异构酶抑制剂rfs2000；二氟甲基鸟氨酸(dfmo)；视黄酸(retinoicacid)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；卡培他滨(capecitabine)(xeloda)；及上述任一的医药上可接受的盐、酸或衍生物。化疗剂亦包括用来调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素，包括，例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制4(5)-咪唑该的芳香酶、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、奇沃昔芬(keoxifene)、ly117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)
于本文所描述的方法的某些实施方式中，该化疗剂为拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶抑制剂为干扰拓扑异构酶(例如拓扑异构酶i或ⅱ)的作用的化疗剂。拓扑异构酶抑制剂包括，但不限于阿霉素盐酸盐、柔红霉素柠檬酸盐、米托蒽醌盐酸盐、放线菌素d、依托泊苷、托泊替康盐酸盐、替尼泊苷(vm-26)和伊立替康，及任一这些物质的医药上可接受的盐、酸或衍生物。于一些实施方式中，该另外的治疗剂为伊立替康。
于某些实施方式中，该化疗剂为抗代谢物。抗代谢物为具有类似于正常生化反应所需的代谢物的结构，但其差异足以干扰一或多种细胞的正常功能(诸如细胞分裂)的化学物。抗代谢物包括，但不限于吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、胺甲蝶呤钠、雷利曲塞(ralitrexed)、培美曲塞、替加氟(tegafur)、阿糖胞苷、硫鸟嘌呤、5-氮杂胞苷、6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤(azathioprine)、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁、磷酸氟达拉滨和克拉屈滨，及任一这些物质的医药上可接受的盐、酸或衍生物。于一些实施方式中，该另外的治疗剂为吉西他滨。
于本文所描述的方法的某些实施方式中，该化疗剂为抗有丝分裂剂，包括，但不限于结合微管蛋白的药剂。于一些实施方式中，该药剂为紫杉烷。于某些实施方式中，该药剂为太平洋紫杉醇或多西紫杉醇，或太平洋紫杉醇或多西紫杉醇的医药上可接受的盐、酸或衍生物。于某些实施方式中，该药剂为太平洋紫杉醇(taxol)、多西紫杉醇(taxotere)、白蛋白结合型太平洋紫杉醇(nab-太平洋紫杉醇；abraxane)、dha-太平洋紫杉醇或pg-太平洋紫杉醇。于某些替换的实施方式中，该抗有丝分裂剂包含长春花生物碱，诸如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、或长春地辛、或其医药上可接受的盐、酸或衍生物。于一些实施方式中，该抗有丝分裂剂为驱动蛋白eg5(kinesineg5)的抑制剂或有丝分裂激酶(诸如auroraa或plk1)的抑制剂。于某些实施方式中，该另外的治疗剂为太平洋紫杉醇。于某些实施方式中，该另外的治疗剂为nab-太平洋紫杉醇。
于本文所描述的方法的一些实施方式中，该另外的治疗剂包含诸如小分子的药剂。例如，治疗可涉及组合施用本发明的多肽或药剂与作为对抗肿瘤相关抗原的抑制剂的小分子药剂，该小分子药剂包括，但不限于egfr、her2(erbb2)及/或vegf。于一些实施方式中，本发明的多肽或药剂是与选自下列群组中的蛋白激酶抑制剂组合施用：吉非替尼(gefitinib)(iressa)、厄洛替尼(erlotinib)(tarceva)、舒尼替尼(sunitinib)(sutent)、拉帕他尼(lapatanib)、凡德他尼(vandetani)(zactima)、aee788、ci-1033、西地尼布(cediranib)(recentin)、索拉非尼(sorafenib)(nexavar)及帕唑帕尼(pazopanib)(gw786034b)。于一些实施方式中，该另外的治疗剂包含mtor抑制剂。
于本文所描述的方法的某些实施方式中，该另外的治疗剂为抑制癌干细胞途径的小分子。于一些实施方式中，该另外的治疗剂为notch途径的抑制剂。于一些实施方式中，该另外的治疗剂为wnt途径的抑制剂。于一些实施方式中，该另外的治疗剂为bmp途径的抑制剂。于一些实施方式中，该另外的治疗剂为hippo途径的抑制剂。于一些实施方式中，该另外的治疗剂为mtor/akr途径的抑制剂。于一些实施方式中，该另外的治疗剂为rspo/lgr途径的抑制剂。
于本文所描述的方法的一些实施方式中，该另外的治疗剂包含生物分子，诸如抗体。例如，治疗可涉及组合施用本发明的多肽或药剂与对抗肿瘤相关抗原的抗体，包括，但不限于结合egfr、her2/erbb2及/或vegf的抗体。于某些实施方式中，该另外的治疗剂为特异于癌干细胞标记的抗体。于一些实施方式中，该另外的治疗剂为结合该notch途径的组分的抗体。于一些实施方式中，该另外的治疗剂为结合该wnt途径的组分的抗体。于某些实施方式中，该另外的治疗剂为抑制癌干细胞途径的抗体。于一些实施方式中，该另外的治疗剂为notch途径的抑制剂。于一些实施方式中，该另外的治疗剂为wnt途径的抑制剂。于一些实施方式中，该另外的治疗剂为bmp途径的抑制剂。于一些实施方式中，该另外的治疗剂为抑制β-链蛋白(β-catenin)信号传导的抗体。于某些实施方式中，该另外的治疗剂为作为血管生成抑制剂的抗体(例如抗vegf或vegf受体抗体)。于某些实施方式中，该另外的治疗剂为贝伐珠单抗(bevacizumab)(avastin)、雷莫司单抗(ramucirumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(hercepttn)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(omnitarg)、帕尼单抗(panitumumab)(vectibix)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎妥木单抗(zalutumumab)或西妥昔单抗(cetuximab)(erbitux)。
于本文所描述的方法的一些实施方式中，该另外的治疗剂为调节免疫反应的抗体。于一些实施方式中，该另外的治疗剂为抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla-4抗体或抗tigit抗体。
此外，以本文所描述的多肽或药剂进行的治疗可包括与其他生物分子组合治疗，该其他生物分子为(诸如一或多种细胞因子(例如淋巴因子，白介素，肿瘤坏死因子及/或生长因子))，或可伴随手术切除肿瘤、去除癌细胞或任何其他被治疗医师认为必要的疗法。于一些实施方式中，该另外的治疗剂为免疫反应刺激剂。
于本文所描述的方法的一些实施方式中，该多肽或药剂可与选自由下列所组成的群组的生长因子组合：肾上腺髓质素(adrenomedullin)(am)、血管生成素(ang)、bmp、bdnf、egf、红细胞生成素(epo)、fgf、gdnf、g-csf、gm-csf、gdf9、hgf、hdgf、igf、迁移刺激因子、肌肉生长抑制素(myostatin)(gdf-8)、神经生长因子(ngf)、神经营养因子(neurotrophin)、pdgf、促血小板生成素(thrombopoietin)、tgf-α、tgf-β、tnf-α、vegf、p1gf、il-1、il-2、il-3、el-4、il-5、il-6、il-7、il-12、il-15和il-18。
于本文所描述的方法的一些实施方式中，该另外的治疗剂为免疫反应刺激剂。于一些实施方式中，该免疫反应刺激剂系选自由下列所组成的群组：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、白介素-3(il-3)、白介素12(bl-12)、白介素-1(il-1)、白介素-2(il-2)、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、4-1bb配体、抗cd3抗体、抗ctla-4抗体、抗tigit抗体、抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗lag-3抗体和抗tim-3抗体。
于本文所描述的方法的一些实施方式中，该免疫反应刺激剂系选自由下列所组成的群组：pd-1活性调节剂、pd-l1活性调节剂、pd-l2活性调节剂、ctla-4活性调节剂、cd28活性调节剂、cd80活性调节剂、cd86活性调节剂、4-1bb活性调节剂、ox40活性调节剂、kir活性调节剂、tim-3活性调节剂、lag3活性调节剂、cd27活性调节剂、cd40活性调节剂、gitr活性调节剂、tigit活性调节剂、cd20活性调节剂、cd96活性调节剂、ido1活性调节剂、细胞因子、趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子(tnf)族的成员及免疫刺激性寡核苷酸。
于本文所描述的方法的一些实施方式中，该免疫反应刺激剂是选自由下列所组成的群组：pd-1拮抗剂、pd-l1拮抗剂、pd-l2拮抗剂、ctla-4拮抗剂、cd80拮抗剂、cd86拮抗剂、kir拮抗剂、tim-3拮抗剂、lag3拮抗剂、tigit拮抗剂、cd20拮抗剂、cd96拮抗剂及/或ido1拮抗剂。
于本文所描述的方法的一些实施方式中，该pd-1拮抗剂为特异结合pd-1的抗体。于一些实施方式中，结合pd-1的抗体为keytruda(mk-3475)、皮迪利单抗(pidilizumab)(ct-011)、尼渥鲁单抗(nivolumab)(opdivo、bms-936558、mdx-1106)、medi0680(amp-514)、regn2810、bgb-a317、pdr-001或sti-a1110。于一些实施方式中，该结合pd-1的抗体描述于pct刊物wo2014/179664中，例如被识别为ape2058、ape1922、ape1923、ape1924、ape1950或ape1963的抗体，或含有任一这些抗体的cdr区的抗体。于其他实施方式中，该pd-1拮抗剂为包含pd-l2的融合蛋白，例如amp-224。于其他实施方式中，该pd-1拮抗剂为肽抑制剂，例如aunp-12。
于一些实施方式中，该pd-l1拮抗剂为特异结合pd-l1的抗体。于一些实施方式中，该结合pd-l1的抗体为替利珠单抗(atezolizumab)(rg7446、mpdl3280a)、medi4736、bms-936559(mdx-1105)、艾维鲁单抗(avelumab)(msb0010718c)、kd033、kd033的抗体部分或sti-a1014。于一些实施方式中，结合pd-l1的抗体描述于pct刊物wo2014/055897中，例如ab-14、ab-16、ab-30、ab-31、ab-42、ab-50、ab-52或ab-55、或含有任一这些抗体的cdr区的抗体。
于一些实施方式中，该ctla-4拮抗剂为特异性结合ctla-4的抗体。于一些实施方式中，该结合ctla-4的抗体为易普利姆单抗(yervoy)或曲美利姆单抗(tremelimumab)(cp-675,206)。于一些实施方式中，该ctla-4拮抗剂为ctla-4融合蛋白，例如kahr-102。
于一些实施方式中，该lag3拮抗剂为特异结合lag3的抗体。于一些实施方式中，该结合lag3的抗体为imp701、imp731、bms-986016、lag525及gsk2831781。于一些实施方式中，该lag3拮抗剂包括可溶性lag3受体，例如imp321。
于一些实施方式中，该kir拮抗剂为特异结合kir的抗体。于一些实施方式中，该结合kir的抗体为利里路单抗(lirilumab)。
于一些实施方式中，该免疫反应刺激剂系选自由下列所组成的群组：cd28激动剂、4-1bb激动剂、ox40激动剂、cd27激动剂、cd80激动剂、cd86激动剂、cd40激动剂和gitr激动剂。
于一些实施方式中，ox40激动剂包括ox40配体或其ox40结合部分。例如，该ox40激动剂可为medi6383。于一些实施方式中，该ox40激动剂为特异结合ox40的抗体。于一些实施方式中，该结合ox40的抗体为medi6469、medi0562或moxr0916(rg7888)。于一些实施方式中，该ox40激动剂为能够表现ox40配体的载体(例如表现载体或病毒，诸如腺病毒)。于一些实施方式中，该ox40表现载体为δ-24-rgdox或dnx2401。
于一些实施方式中，该4-1bb(cd137)激动剂为结合分子，诸如anticalin。于一些实施方式中，该anticalin为prs-343。于一些实施方式中，该4-1bb激动剂为特异结合4-1bb的抗体。于一些实施方式中，该结合4-1bb的抗体为pf-2566(pf-05082566)或优瑞如单抗(urelumab)(bms-663513)。
于一些实施方式中，该cd27激动剂为特异结合cd27的抗体。于一些实施方式中，该结合cd27的抗体为维利如单抗(varlilumab)(cdx-1127)。
于一些实施方式中，该gitr激动剂包含gitr配体或其gitr结合部分。于一些实施方式中，该gitr激动剂为特异结合gitr的抗体。于一些实施方式中，该结合gitr的抗体为trx518、mk-4166或inbrx-110。
于一些实施方式中，免疫反应刺激剂包括，但不限于细胞因子，诸如趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子(tnf)族的成员。于一些实施方式中，免疫反应刺激剂包括免疫刺激性寡核苷酸，诸如cpg二核苷酸。
于一些实施方式中，免疫反应刺激剂包括，但不限于抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗pd-l2抗体、抗ctla-4抗体、抗cd28抗体、抗cd80抗体、抗cd86抗体、抗4-1bb抗体、抗ox40抗体、抗kir抗体、抗tim-3抗体、抗lag3抗体、抗cd27抗体、抗cd40抗体、抗gitr抗体、抗tigit抗体、抗cd20抗体、抗cd96抗体或抗ido1抗体。
于一些实施方式中，治疗个体的癌症的方法包含组合施用该个体治疗有效量的本文所描述的gitr结合多肽或药剂与检查点抑制剂。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-1抗体。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-1抗体且该癌症为黑色素瘤。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-1抗体且该癌症为肺癌。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-1抗体且该癌症为膀胱癌。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-1抗体且该癌症为血液系统癌症。
于一些实施方式中，治疗个体的癌症的方法包含组合施用该个体治疗有效量的本文所描述的gitr结合多肽或药剂与检查点抑制剂。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-l1抗体。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-l1抗体且该癌症为黑色素瘤。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-l1抗体且该癌症为肺癌。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-l1抗体且该癌症为膀胱癌。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-l1抗体且该癌症为乳癌。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-l1抗体且该癌症为血液系统癌症。
于一些实施方式中，治疗个体的癌症的方法包含组合施用该个体治疗有效量的本文所描述的ox40结合多肽或药剂与检查点抑制剂。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-1抗体。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-1抗体且该癌症为黑色素瘤。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-1抗体且该癌症为肺癌。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-1抗体且该癌症为膀胱癌。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-1抗体且该癌症为血液系统癌症。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-l1抗体。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-l1抗体且该癌症为黑色素瘤。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-l1抗体且该癌症为肺癌。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-l1抗体且该癌症为膀胱癌。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-l1抗体且该癌症为乳癌。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-l1抗体且该癌症为血液系统癌症。
于一些实施方式中，治疗个体的癌症的方法包含组合施用该个体治疗有效量的本文所描述的cd40结合多肽或药剂与检查点抑制剂。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-1抗体。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-1抗体且该癌症为黑色素瘤。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-1抗体且该癌症为肺癌。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-1抗体且该癌症为膀胱癌。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-1抗体且该癌症为血液系统癌症。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-l1抗体。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-l1抗体且该癌症为黑色素瘤。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-l1抗体且该癌症为肺癌。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-l1抗体且该癌症为膀胱癌。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-l1抗体且该癌症为乳癌。于一些实施方式中，该检查点抑制剂为抗pd-l1抗体且该癌症为血液系统癌症。
于本文所描述的方法的某些实施方式中，该治疗涉及组合施用本发明的多肽或药剂与放射疗法。以多肽或药剂进行的治疗可在施用放射疗法之前、同时或随后发生。用于该等放射疗法的给药方案可由熟练的医生决定。
于本文所描述的方法的某些实施方式中，该治疗涉及组合施用本发明的多肽或药剂与抗病毒疗法。以多肽或药剂进行的治疗可在施用抗病毒疗法之前、同时或随后发生。用于组合疗法中的抗病毒药物将取决于该个体所感染的病毒。
组合施用可包括共同施用(在单一医药调合物中或使用分开的调合物)或连续施用(依序，或大致上在一段时间内施用，从而使所有活性剂可同时发挥其生物学活性)。
将可理解的是，本文所描述的多肽或药剂与至少一种另外的治疗剂的组合可以任何顺序或同时施用。于一些实施方式中，该多肽或药剂将施用那些先前已接受第二治疗剂治疗的患者。于某些其他实施方式中，将基本上同时或并行施用该多肽或药剂和第二治疗剂。例如，可给予个体多肽或药剂，但同时接受第二治疗剂(例如化疗法)的疗程。于某些实施方式中，该多肽或药剂将在以第二治疗剂进行治疗的第1年内施用。于某些替代的实施方式中，该多肽或药剂将在以第二治疗剂进行的任何治疗的10、8、6、4或2个月内施用。于某些其他实施方式中，该多肽或药剂将在以第二治疗剂进行的任何治疗的4、3、2或1周内施用。于一些实施方式中，该多肽或药剂将在以第二治疗剂进行的任何治疗的5、4、3、2或1天内施用。可进一步理解的是，该二(或更多)种药剂或治疗可在数小时或数分钟(即，基本上同时地)内施用个体。
在治疗疾病方面，本发明的多肽或药剂的适当剂量系取决于欲治疗的疾病的类型、该疾病的严重程度和病程、该疾病的反应，该多肽或药剂的施用目的是用于治疗或预防、先前疗法、该患者的临床病史，等，全部由治疗医师判断。该多肽或药剂可以一次施用或在持续数天至数月的整个治疗系列中施用，或直至治愈生效或该疾病状态达到缩减时(例如减少肿瘤大小)。最佳的给药方案可从测量患者体内积累的药物计算出且将根据个别药剂的相对效力而变化。给药医师可决定最佳剂量、给药方法和重复率。于某些实施方式中，该剂量为0.01μg至100mg/kg体重、0.1μg至100mg/kg体重、1μg至100mg/kg体重、1mg至100mg/kg体重、1mg至80mg/kg体重、10mg至100mg/kg体重、10mg至75mg/kg体重或10mg至50mg/kg体重。于某些实施方式中，该多肽或药剂的剂量为约0.1mg至约20mg/kg体重。于一些实施方式中，该多肽或药剂的剂量为约0.lmg/kg体重。于一些实施方式中，该多肽或药剂的剂量为约0.25mg/kg体重。于一些实施方式中，该多肽或药剂的剂量为约0.5mg/kg体重。于一些实施方式中，该多肽或药剂的剂量为约1mg/kg体重。于一些实施方式中，该多肽或药剂的剂量为约1.5mg/kg体重。于一些实施方式中，该多肽或药剂的剂量为约2mg/kg体重。于一些实施方式中，该多肽或药剂的剂量为约2.5mg/kg体重。于一些实施方式中，该多肽或药剂的剂量为约5mg/kg体重。于一些实施方式中，该多肽或药剂的剂量为约7.5mg/kg体重。于一些实施方式中，该多肽或药剂的剂量为约10mg/kg体重。于一些实施方式中，该多肽或药剂的剂量为约12.5mg/kg体重。于一些实施方式中，该多肽或药剂的剂量为约15mg/kg体重。于某些实施方式中，该剂量可每天、每周、每月或每年给予一或多次。于某些实施方式中，该多肽或药剂系每周给予一次、每二周一次、每三周给予一次或每四周给予一次。
于一些实施方式中，该多肽或药剂可施用初始的较高“加载”剂量，接着再施用一或多个较低的剂量。于一些实施方式中，施用频率亦可改变。于一些实施方式中，给药方案可包含施用初始剂量，随后每周施用一次、每二周施用一次、每三周施用一次或每月施用一次额外的剂量(或“维持”剂量)。例如，给药方案可包含施用初始加载剂量，随后每周施用维持剂量，例如初始剂量的一半。或者，给药方案可包含施用初始加载剂量，随后隔周施用维持剂量，例如初始剂量的一半。或者，给药方案可包含施用三个初始剂量共3周，随后隔周施用维持剂量，例如相同剂量。
如本技术领域的技术人员所已知名，任何治疗剂的施用可能导致副作用及/或毒性。在一些情况下，该副作用及/或毒性是如此严重，因而防碍施用特定药剂的治疗有效剂量。在一些情况下，必须停止药物疗法，并可能尝试其他药剂。然而，在相同治疗类别中的许多药剂通常显示出类似的副作用及/或毒性，此意指该患者或者必须停止治疗，或者，若可能的话，遭遇与该治疗剂相关的令人不快的副作用。
于一些实施方式中，该给药时间表可能局限在特定的施用或“周期”数。于一些实施方式中，该多肽或药剂被施用3、4、5、6、7、8或更多周期。例如每2周施用一次该多肽或药剂，共6个周期、每3周施用一次该多肽或药剂，共6个周期、每2周施用一次该多肽或药剂，共4个周期、每3周施用一次该多肽或药剂，共4个周期，等。给药时间表可由本技术领域的技术人员决定及随后进行修改。
因此，本发明提供施用个体本文所描述的多肽或药剂的方法，此方法包含使用用于施用一或多个药剂的间歇给药策略，其可减少与施用多肽或药剂、化疗剂，等相关的副作用及/或毒性。于一些实施方式中，用于治疗人个体的癌症的方法包含施用该个体治疗有效剂量的多肽或药剂与治疗有效剂量的化疗剂，其中系根据间歇给药策略施用一或两种该药剂。于一些实施方式中，该间歇给药策略包含施用该个体多肽或药剂的初始剂量并约每2周施用一次该多肽或药剂的后续剂量。于一些实施方式中，该间歇给药策略包含施用该个体多肽或药剂的初始剂量并约每3周施用一次该多肽或药剂的后续剂量。于一些实施方式中，该间歇给药策略包含施用该个体多肽或药剂的初始剂量并约每4周施用一次该多肽或药剂的后续剂量。于一些实施方式中，该多肽或药剂系使用间歇给药策略施用且该化疗剂是每周施用。
v.筛选
本发明提供筛选方法以鉴定调节免疫反应的药剂。于一些实施方式中，本发明提供用于筛选候选药剂的方法，该候选药剂包括，但不限于蛋白质、抗体、肽、肽模拟物、小分子、化合物或其他调节免疫反应的药物。
于一些实施方式中，筛选调节免疫反应的候选药剂的方法包含测定该多肽或药剂是否对免疫反应的细胞具有效果。于一些实施方式中，筛选调节免疫反应的候选药剂的方法包含测定该多肽或药剂是否能增加免疫细胞的活性。于一些实施方式中，筛选调节免疫反应的候选药剂的方法包含测定该多肽或药剂是否能增加溶细胞性细胞(诸如ctl及/或nk细胞)的活性。于一些实施方式中，筛选调节免疫反应的候选药剂的方法包含测定该多肽或药剂是否能抑制该抑制性细胞(诸如treg细胞及/或mdsc)的活性。
vi.包含本文所描述的药剂的试剂盒
本发明提供包含本文所描述的多肽或药剂且可用于执行本文所描述的方法的试剂盒。于某些实施方式中，该试剂盒包含至少一种在一或多个容器中的纯化药剂。于一些实施方式中，该试剂盒含有必要及/或足以进行检测分析的所有组分，包括所有对照组、进行测定的指示及用于分析和呈现结果所必要的任何软件。本技术领域的技术人员将可轻易地识别本发明所公开的药剂可容易地被并入本技术所熟知的既定试剂盒格式的一。
本发明进一步提供包含多肽或药剂以及至少一种另外的治疗剂的试剂盒。于某些实施方式中，该第二(或更多)治疗剂为化疗剂。于某些实施方式中，该第二(或更多)治疗剂为血管生成抑制剂。
本公开内容的实施方式可藉由参考下列非限制性实例进一步定义，该非限制性实例详细描述本发明的某些抗体的制备方法及使用本发明的抗体的方法。本技术领域的技术人员将清楚明白可在不悖离本发明的范围的情况下执行许多修改，包括材料和方法。
【实施方式】
实例1
单链三聚体gitrl构建体的产生
如本文所讨论者，hgitrl蛋白质在细胞表面组织成同型三聚体并与三个gitr分子交互作用及/或接合。细胞表面上的gitrl三聚体的代表图显示于第1a图中。本发明者检查人gitrl三聚体的晶体结构并观察到来自一个单体的n端氨基酸残基和来自第二单体的c端氨基酸残基彼此极为接近。这表明极短的氨基酸残基跨度(例如仅3至7个残基)可能足以桥接各单体之间的距离，从而可生产单链gitrl三聚体。当进一步分析gitrl的结构和序列时，观察到该gitrl蛋白质的跨膜结构域和tnf同源结构域之间存在数个氨基酸的跨度，此跨度称为“茎”区(见第1a和1b图)。本发明者假设利用此短茎区桥接gitrl单体的c端与相邻gitrl单体的n端间的距离将是可能的，并以此方式构建缺乏外源肽接头序列的单链gitrl三聚体。
利用跨膜区(信号锚定序列-seqidno：l的氨基酸51-70)和三个茎区拷贝及tnf族结构域(seqidno：l的氨基酸71-199；还有seqidno：3)来产生膜结合的单链hgitrl三聚体构建体。该包含茎区和tnf族结构域的序列在本文中亦称为gitrl胞外结构域。代表性图解显示于第1d图中。
亦产生可溶性单链hgitrl三聚体构建体(第ie图)。产生含有三个人gitrl胞外结构域的拷贝的另一构建体，该人gitrl的胞外结构域连接人igg1fc区(336b11；seqidno：6具有信号序列而seqidno：7不具有信号序列)。代表性图解显示于第1f图中。
可遵循本文所公开的用于产生gitrl三聚体构建体的一般大纲来产生其他tnfsf三聚体构建体。例如，本发明者已经产生数种ox40l三聚体(seqidno：43、seqidno：44、seqidno：71；和seqidno：72)、ox40l三聚体-fc蛋白(seqidno：45、seqidno：46、seqidno：47和seqidno：48)、cd40l三聚体(seqidno：85和seqidno：88)及cd40l三聚体-fc蛋白(seqidno：89、seqidno：90、seqidno：91和seqidno：92)。
实施例2
facs分析gitrl三聚体结合gitr
为了测试单链hgitrl三聚体结合人gitr的能力，进行结合研究。以编码(1)上述的膜结合的单链hgitrl三聚体构建体和(2)作为转染标记的绿色荧光蛋白(gfp)的表现载体瞬时共同转染人hek-293细胞。转染后二十四小时，将细胞与hgitr-fc或对照融合蛋白一起培育。以pe共轭结合的抗人fc二级抗体将细胞染色并藉由流式细胞术进行分析。
如第2图所示，hgitr-fc能够结合细胞表面上的单链hgitrl三聚体。这些结果证明该单链hgitrl构建体形成生物功能性三聚体结构，并能与hgitr交互作用。
实施例3
gitrl三聚体融合蛋白及结合
本发明者假设可溶性单链gitrl三聚体可使用免疫球蛋白fc区骨架产生且该gitrl三聚体可能连接fc区的n端或fc区的c端。这将产生含有两个gitrl三聚体的分子并可提供增加的活性。该fc区骨架的结构灵活性亦可允许产生双特异性同型二聚体药剂。例如，可设计其中该单链gitrl三聚体连接免疫球蛋白重链的抗体-gitrl融合蛋白。为了形成抗原结合位点，可将该免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链联结。抗体-gitrl融合蛋白可包含抗体重链和轻链作为单链免疫球蛋白的一部分。在不同的设计中，抗体-gitrl融合蛋白可包含重链可变区和轻链可变区，诸如fab或scfv。
或者，人们可设计双特异性异质二聚体药剂，其中一个臂包含含有单链gitrl三聚体的fc融合蛋白，而第二臂包含含有免疫球蛋白重链的第二fc融合蛋白。如上述，为了形成抗原结合位点，可将该免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链联结。第二臂可包含抗体重链和轻链作为单链免疫球蛋白的一部分，或包含连接重链可变区和轻链可变区(诸如fab或scfv)的fc区。一些这些格式的示意图显示于第3图中。
这些格式中有些是使用小鼠igg1或igg2fc区、人igg1或igg2fc区和小鼠igg1或igg2抗体制成重组蛋白形式。使用一对优先异质二聚体化的人igg2ch3结构域变体来生产双特异性异质二聚体药剂。336b3为连接小鼠igg2afc区的c端的单链小鼠gitrl三聚体。336b10为连接小鼠igg2afc区的n端的单链小鼠gitrl三聚体。336b11为连接人igg1区的n端的单链人gitrl三聚体。336b11包含由质粒“hgitrl-higg1”编码的融合蛋白，该质粒系在布达佩斯条约的条件下，在2015年4月21日保藏在atcc(美国维吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801号)且指定编号为pta-122112(其中保藏人参考号(depositorreference)：含合成hucdna的质粒，株系(strain)：h-gitrl-higg1)。336b1为连接小鼠igg1抗体的单链小鼠gitrl三聚体。336b2为连接小鼠igg2a抗体的单链小鼠gitrl三聚体。336b4为异质二聚体药剂，其中一个臂为连接人igg2fc区的小鼠gitrl三聚体，而该第二臂为连接人igg2fc区的小鼠抗体可变区。
为了测试这些融合蛋白与gitr交互作用的能力，进行结合研究。以编码(1)全长小鼠gitr(细胞表面表现)和(2)作为转染标记的gfp的表现载体瞬时共同转染人hek-293细胞。转染后二十四小时，将细胞与gitrl融合蛋白或对照蛋白一起培育。以pe共轭结合的抗人或抗小鼠fc二级抗体将细胞染色并藉由流式细胞术进行分析。
如第4图所示，包含gitrl三聚体的fc融合蛋白强烈结合表现在细胞表面的gitr。结果证明当连接fc蛋白的n端或c端时，该gitrl三聚体可结合gitr且当gitrl以单一三聚体表现或当存在多个三聚体时，该gitrl可结合gitr。此外，当融合至fc区或不同同种型的抗体时，该gitrl三聚体为功能性。重要的是，在双特异性同型二聚体或异质二聚体分子的背景下，该gitrl三聚体亦结合gitr。
进行单链mgitrl三聚体-fc(336b10)和单链hgitrl三聚体-fc(336b11)分别结合鼠gitr和人gitr的比较。以编码(1)全长小鼠或人gitr(细胞表面表现)和(2)作为转染标记的gfp的表现载体瞬时共同转染人hek-293细胞。转染后二十四小时，将细胞与在一个浓度范围内(2倍稀释，从20μg/ml至0.156μg/ml)的mgitrl三聚体-fc336b10或hgitrl三聚体-fc336b11一起培育。以pe共轭结合的抗人或抗小鼠fc二级抗体将细胞染色并藉由流式细胞术进行分析。
如第5图所示，单链mgitrl三聚体-fc和单链hgitrl三聚体-fc强烈结合其各自的gitr并显示出类似的结合剂量反应。
另外的研究已证明人gitrl三聚体-fc336b11结合食蟹猴gitr。
实施例4
藉由gitrl三聚体-fc活化gitr信号传导
为了测定该单链gitrl三聚体-fc蛋白是否透过gitr诱导信号传导，进行荧光素酶报告子分析。使用含有经稳定转染的nf-kb荧光素酶报告子基因和小鼠gitrcdna的hek-293细胞株。将细胞平皿接种在96孔盘中并与在一个浓度范围内(5倍稀释，从20μg/ml至0.01μg/ml)的单链mgitrl-fc融合蛋白336b3、单链mgitrl-fc融合蛋白336b6、抗gitr抗体dta-1或对照抗体一起培育。336b3为mgitrl三聚体-fc的同型二聚体，该三聚体是连接igg2afc区的c端(“二-三聚体”版)。336b6仅有一个连接gitrl三聚体的fc区，该三聚体系连接igg2afc区的n端(“单臂”或“单一三聚体”版)。dta-1为靶向gitr的激动剂抗体且被包括在内以作为阳性对照组。
如第6图所示，含有单一gitrl三聚体的fc融合蛋白(336b6)和含有二个gitrl三聚体的fc融合蛋白(336b3)能够强烈刺激荧光素酶。这些结果表明该gitrl三聚体能够以生物相关方式强烈诱导gitr信号传导。有趣的是，该单链gitrl三聚体格式能够诱导较该激动剂抗gitr抗体更强劲的gitr信号传导。此外，在此研究中含有二个单链gitrl三聚体拷贝的融合蛋白(336b3)能够较仅含有一个gitrl三聚体的融合蛋白(336b6)提供更高的最大刺激。这些结果与我们假设该单链gitrl三聚体格式可较激动剂抗体格式更有效地活化gitr相一致，且gitrl三聚体的多个拷贝可作为“超团簇”以更有效地活化gitr。
以人gitrl三聚体-fc融合蛋白(336b11)及经nf-kb-荧光素酶报告子基因和人gitrcdna稳定转染的hek-293细胞重复这些实验。将细胞平皿接种在96孔盘中并与在一个浓度范围内(3倍稀释，从20μg/ml至0.08μg/ml)的单链hgitrl-fc融合蛋白336b11一起培育。
如第7图所示，该单链人gitrl三聚体-fc蛋白336b11蛋白能够强劲刺激荧光素酶。这些结果与使用鼠gitrl三聚体所取得的结果相当并指示人gitrl三聚体能够刺激gitr信号传导。
实施例5
藉由单链gitrl三聚体-fc蛋白抑制体内肿瘤生长
将鼠结肠肿瘤细胞系ct26.wt经由皮下植入(25,000个细胞/小鼠)balb/c小鼠中。以0.25mg/小鼠的单链mgitrl三聚体-fc336b3、激动剂抗gitr抗体dta-1或对照抗体治疗小鼠(每组n＝10)。在第7、10、14和17天藉由腹膜内注射给予小鼠剂量。监测肿瘤生长并在指定的时间点以电子卡尺测量肿瘤体积。
如第8a图所示，以mgitrl三聚体-fc336b3进行治疗可强烈抑制及/或预防ct26.wt肿瘤生长。以激动剂抗gitr抗体dta-1治疗亦可抑制肿瘤生长。检视来自每个组内的个别小鼠的结果可以看到336b3和dta-1之间更细微的差异图。如第8b图所示，以336b3进行治疗可抑制所有10只小鼠中的肿瘤生长，而以dta-1进行治疗显示出抑制肿瘤生长的程度较低且未能阻断该10只小鼠其中一只的肿瘤生长。这些结果指出该单链gitrl三聚体具有作为免疫治疗剂的活性且可较激动剂gitr抗体更有效地抑制肿瘤生长。
实施例6
用于ifn-γ和dl-10的elispot分析
elispot为用于检测细胞因子分泌细胞的高度敏感性免疫分析。简单地说，elispot分析采用特异于所研究的细胞因子的捕捉抗体，将抗体预涂覆在微量盘的孔中。将细胞分装入孔中，在任一细胞因子分泌细胞附近的经固定的抗体会结合分泌出的细胞因子。进行标准清洗步骤，随后与适当的检测试剂一起培育。例如，使用生物素化的检测抗体，接着通常使用与碱性磷酸酶共轭结合的链亲和素和有色底物溶液。在细胞因子局域化的位点形成有色的沉淀物并以斑点形式显示，每一个别斑点代表个别的细胞因子分泌细胞。该斑点可以自动化读计系统或使用显微镜手动计算。
使用小鼠ifn-γelispot试剂盒(mabtech，俄亥俄州辛辛那提市)检测干扰素(ifn)-γ分泌细胞。从如上述实施例5中以mgitrl三聚体-fc336b、抗mgitr抗体dta-1或对照组处理的ct26.wt荷瘤小鼠的脾脏分离出细胞。将来自每只小鼠的脾细胞(2×105细胞/孔)分装在所提供的预先以特异于小鼠ifn-γ的捕捉抗体涂覆的盘中。在有或无肿瘤特异性cd8+t细胞肽(ah-1)的存在下培养细胞并在37℃下培育。该ah-1肽的序列(spsyvyhqf；seqidno：54)为ct26.wt细胞系内源性亲环境小鼠白血病前病毒(provirus)的gp70外套蛋白的h2-ld-限制性抗原决定部位(氨基酸6-14)。48小时后，按照制造商的说明检测分泌ifn-γ的细胞。使用6000f-zbioreader(biosys，佛罗里达州迈阿密市)计算斑点。数据是以平均值±s.e.m斑点/孔表示。
如第9a图所示，当将细胞与ah-1肽一起培育时，以mgitrl三聚体-fc336b3和以抗mgitr抗体dta-1治疗的小鼠体内的肿瘤特异性ifn-γ分泌cd8+t细胞增加。使用336b3的增加幅度较大，约增加2.5倍，而使用dta-1约增加1.9倍。此外，在以336b3治疗的小鼠中，即使没有肿瘤特异性肽存在时ifn-γ分泌t细胞的数量增加。以抗gitr抗体dta-1治疗时未见到此种增加。
ifn-γ一般系由nk细胞、th1cd4+t细胞、cd8+t细胞、抗原呈递细胞和b细胞生产。研究表明ifn-γ在肿瘤免疫中具有作用且其可为由其他细胞因子(尤其是il-12和il-2)介导的抗肿瘤活性的调节子。因此，导致ifn-γ增加的以gitrl三聚体fc进行的治疗应可增强抗肿瘤免疫力。
使用小鼠il-10elispot试剂盒(mabtech)检测il-10分泌细胞。从以mgitrl三聚体-fc336b、抗mgitr抗体dta-1或对照组治疗的ct26.wt荷瘤小鼠的脾脏中分离出细胞。将来自各治疗组的每只小鼠的脾细胞(5×105/孔)分装在涂覆特异于小鼠il-10的抗体的96孔盘中。在有或无肿瘤特异性cd8+t细胞肽(ah-1)的存在下培养细胞并在37℃下培育。48小时后按照制造商的说明检测分泌il-10的细胞。使用bioreader6000f-z仪器(biosys)捕捉图像并测定斑点数、斑点面积及/或总光密度。以平均值±s.e.m斑点/孔表示数据。
如第9b图所示，与以对照组治疗的小鼠相比较，无论该细胞是否在有或无肿瘤特异性肽的存在下培育，以抗mgitr抗体dta-1治疗的小鼠体内的il-10分泌细胞显著增加。有趣的是，来自以mgitrl三聚体-fc336b3治疗的小鼠的il-10分泌细胞数仅在无肿瘤特异性肽存在时显著增加，证明与以对照组治疗的小鼠相较下，当以肿瘤特异性肽ah-1刺激细胞时，il-10分泌细胞数只有增加少量。
il-10通常系由treg细胞和辅助t细胞生产。il-10最初被视为是调节先天免疫细胞的生长及/或分化并抑制t细胞(尤其是细胞毒性t细胞)的活化和效应子功能的th2细胞因子。最近，il-10已被证明具有一些免疫刺激效果，因此被视为具有多效功能。由于th1细胞因子(诸如ifn-γ)反调节th2细胞因子(包括il-10)的生产，336b3治疗可藉由诱导大量生产ifn-γ来抑制il-10生产。因此，联同增加ifn-γ的生产，336b3治疗可藉由抑制il-10生产来促进抗肿瘤免疫力。
这些数据表明gitrl三聚体-fc可藉由大量生产ifn-γ来促进肿瘤特异性cd8+t细胞活性。这些结果亦可能表明gitrl三聚体-fc可较激动剂抗gitr抗体更有效地诱导抗肿瘤免疫力。再者，这些结果可能表明该gitrl三聚体-fc影响免疫细胞及/或免疫反应所凭借的机制与抗gitr抗体的机制不同。
实施例7
细胞的细胞毒性分析
天然杀手细胞或nk细胞为先天免疫系统中具关键性的细胞毒性淋巴细胞类型。藉由测量细胞对肿瘤靶的细胞毒性活性来评估以mgitrl三聚体-fc336b3治疗的小鼠体内的nk细胞活性。从实施例5中所描述的ct26.wt荷瘤小鼠的脾脏收获细胞。将细胞平皿接种在96孔v形底盘的rpmi1640培养基(gibco/lifetechnologies公司，grandisland，ny)中，该rpmi1640培养基中系经补充以10％(v/v)胎牛血清(fbs)、2mml-谷氨酰胺、l00u/ml青霉素及100μg/ml链霉素(gibco)。在37℃下以10μm钙黄绿素am(lifetechnologies公司)标记ct26.wt靶细胞1小时，并以效应子：靶(e：t)＝25:1的比率与脾细胞混合。在37℃下培育4小时后，收获不含细胞的上清液并在荧光计上，在485nm的激发波和535nm的发射波处定量钙黄绿素释放。特异性细胞溶解百分比的测定方法为：％细胞溶解＝100x(er-sr)/(mr-sr)，其中er、sr和mr分别代表实验、自发和最大钙黄绿素释放。自发释放为由培育在单独的培养基(即，无效应子细胞存在)中的靶细胞发射的荧光，而最大释放系藉由以等体积的10％sds溶解靶细胞来测定。
如第10图所示，与以对照抗体治疗的小鼠相比较，当小鼠已接受mgitrl三聚体-fc336b3治疗时，来自该ct26.wt荷瘤小鼠的nk细胞表现出灭杀ct26.wt靶细胞的能力增加。此效果大于使用抗mgitr抗体dta-1所见到的任何效果。虽然溶解的量很少，这些结果表明以mgitrl三聚体-fc治疗可增加nk活性并增强抗肿瘤免疫反应。此外，使用三聚体mgitrl-fc的效果较使用抗gitr抗体所观察到者更强。
实施例8
调节性t细胞(treg)分析
调节性t细胞(treg)在维持体内恒定和预防自体免疫反应中发挥重要的作用。treg为t细胞的一小次组，其大部分为cd4+细胞并表现cd25(一种il-2受体α链)及其他treg细胞相关的分子标记。foxp3(一种转录因子)已被识别为用于treg细胞发展和功能的因子。foxp3亦被视为是定义和从其他t细胞亚群鉴别treg细胞的特定标记，虽然这已被质疑其在人treg细胞的特异性。除了cd4+treg细胞外，cd8+treg细胞代表另一细胞群且与cd4+treg细胞相比较，foxp3对其发育和功能可能不是那么关键。
藉由测定treg对初始cd4+或cd8+t细胞增殖的效果来评估treg在以mgitrl三聚体-fc336b3治疗的小鼠中的功能性。使用小鼠cd3+t细胞富集柱(r&d系统)从未经治疗的小鼠的脾脏纯化初始t细胞。以5μm紫色追踪染料(vtd；lifetechnologies公司)标记这些经纯化的t细胞。将2×105经vtd标记的t细胞与经抗cd3和抗cd28抗体涂层的小珠一起培育以刺激细胞增殖。使用鼠treg分离试剂盒(miltenyibiotec)从以mgitrl三聚体-fc336b3、抗mgitr抗体dta-1或对照组治疗的ct26.wt荷瘤小鼠(见实施例5)的脾脏分离出treg。为了测定treg对t细胞增殖的影响，将经刺激的经vtd标记的t细胞(效应子)与分离出的脾treg共同培养(效应子：treg比为1：0.5)。第4天，清洗细胞并与抗小鼠cd4或抗小鼠cd8抗体一起培育。使用bdfacscantoⅱ仪器和bdfacsdiva软件v6.1.3，藉由facs分析来评估细胞。当该经标记的细胞分裂时，vtd信号减半，因此该分析闸系设定在介于分析中无treg细胞存在时所取得的最大信号和无抗cd3/cd28刺激时所取得的最小信号之间。使用此区(减少vtd表现)内的细胞在cd4+t细胞和cd8+t细胞的百分比来计算cd4+t和cd8+t细胞增殖。抑制百分比的计算方法为[最大信号-(样本信号/最大信号)]×100。
如第11图所示，与在来自以抗mgitr抗体dta-1或对照组治疗的小鼠的treg所观察到的抑制效果相比较，以mgitrl三聚体-fc336b3治疗可强烈降低treg对初始cd4+t细胞增殖的抑制功能。同样地，与在来自以dta-1或对照组治疗的小鼠的treg所观察到的抑制效果相比较，以336b3治疗可降低treg对初始cd8+t细胞增殖的抑制功能。
这些结果表明以mgitrl三聚体-fc治疗可导致treg功能及/或抑制作用降低。此效果可被认为是“松开”免疫反应。因此，降低treg功能可增强总抗肿瘤免疫反应。
实施例9
髓源抑制细胞(mdsc)分析
研究已鉴别出为肿瘤免疫力的强抑制剂的髓源细胞，因此其为癌症免疫疗法的重大障碍(参见，例如ostrand-rosenbergetal.,2009,j.immunol.,182：4499-4506)。髓源抑制细胞(mdsc)积聚在血液、淋巴结、骨髓及大多数患有癌症的患者和实验动物的肿瘤部位。mdsc已证明能同时抑制后天和先天性免疫。
相信，mdsc藉由抑制抗肿瘤免疫反应、促进血管生成及创建预转移环境来促进癌症进展。mdsc抑制cd4+t细胞和cd8+t细胞的增殖和活化，从而抑制抗肿瘤免疫力。重要的是，mdsc促进treg的产生。
mdsc为骨髓细胞的异质家族。在小鼠中，mdsc系藉由细胞表面表现髓系分化抗原gr1和cd11b来表征。mdsc可分成二个亚群：粒细胞性mdsc(g-mdsc)和单核细胞性mdsc(m-mdsc)。g-mdsc通常具有多裂核及cd11b+ly6g+ly6clow表型，而m-mdsc具有单核细胞形态及cd11b+ly6g+/-ly6chigh表型。mdsc的两种群体已证明能藉由多种机制抑制t细胞反应，包括增加精氨酸酶、诱导型一氧化氮合成酶(inos)、一氧化氮和活性氧物种的生产。因此，mdsc有助于免疫抑制性肿瘤微环境且可能限制抗肿瘤免疫反应的效果。
藉由测定mdsc对初始cd4+或cd8+t细胞增殖的效果来评估以mgitrl三聚体-fc336b3治疗的小鼠中的mdsc的功能性。使用小鼠cd3+t细胞富集柱(r&d系统)从未经治疗过的小鼠的脾脏纯化初始t细胞。以5μm紫色追踪染料(vtd；lifetechnologies公司)标记这些经纯化的t细胞。将2×105经vtd标记的t细胞与经抗cd3和抗cd28抗体涂层的小珠一起培育以刺激细胞增殖。使用小鼠mdsc分离试剂盒(miltenyibiotec)从以mgitrl三聚体-fc336b3、抗mgitr抗体dta-1或对照组治疗的ct26.wt荷瘤小鼠(见实施例5)的脾脏中分离出mdsc。为了测定mdsc对t细胞增殖的影响，将经刺激的经vtd标记的t细胞(效应子)与分离出的脾mdsc共同培养(效应子：mdsc比为1：1)。第4天，清洗细胞并与抗小鼠cd4或抗小鼠cd8抗体一起培育。使用bdfacscantoⅱ仪器和bdfacsdiva软件v6.1.3，藉由facs分析来评估细胞。当该经vtd标记的细胞分裂时，vtd信号减半，因此该分析闸系设定在介于分析中无mdsc细胞存在时所取得的最大信号和无抗cd3/cd28刺激时所取得的最小信号之间。使用此区(减少vtd表现)内的细胞在cd4+t细胞和cd8+t细胞的百分比以计算cd4+t和cd8+t细胞增殖。抑制百分比的计算方法为[最大信号-(样本信号/最大信号)]×100。
如第12图所示，与在来自以对照组治疗的小鼠的mdsc所观察到的抑制效果相比较，以mgitrl三聚体-fc336b3治疗会强烈降低mdsc对初始cd4+t细胞增殖的抑制功能。此降低在来自以抗gitr抗体治疗的小鼠的细胞中较不明显。相反地，与在来自以对照组治疗的小鼠的mdsc所观察到的抑制效果相比较，以336b3进行的治疗对mdsc对初始cd8+t细胞增殖的抑制功能只有轻微的效果。
这些结果表明以mgitrl三聚体-fc治疗可对mdsc功能及/或抑制具有某些效果。mdsc功能降低可进一步增强总抗肿瘤免疫反应。
实施例10
藉由单链gitrl三聚体-fc蛋白抑制体内肿瘤生长
renca为自atcc取得的源自balb/c的肾腺癌细胞系。将renca细胞经由皮下植入(5×105个细胞/小鼠)balb/c小鼠中并使其生长七天以达到平均大小约78mm3。以0.25mg/小鼠的单链mgitrl三聚体-fc336b3、激动剂抗gitr抗体dta-1或对照抗体治疗小鼠(每组n＝10)。在第7、11和14天藉由腹膜内注射给予小鼠剂量。监测肿瘤生长并在指定的时间点以电子卡尺测量肿瘤体积。
如第13图所示，以三聚体mgitrl-fc336b3治疗会强烈抑制renca肿瘤生长。以激动剂抗gitr抗体dta-1治疗亦抑制肿瘤生长，但程度较336b3轻微。当在个别小鼠层级评估结果时，以336b3治疗的20只小鼠中有9只小鼠(45％)肿瘤消退至小于第一次治疗时的尺寸，至第25天时有三只小鼠检测不到肿瘤。相反地，以dta-1治疗的20只小鼠中仅有5只小鼠(25％)肿瘤消退至小于第一次治疗时的尺寸，至第25天时有四只小鼠检测不到肿瘤。
这些结果支持单链三聚体gitrl具有作为不同来源的肿瘤的免疫肿瘤学药剂的活性的想法，且其在达成抑制肿瘤生长方面较激动剂gitr抗体更有效。
实施例11
细胞的细胞毒性分析
在天然杀手细胞(nk)的细胞毒性分析方面，使用小鼠淋巴母细胞系yac-1。在37℃，5％co2的潮湿大气下，将细胞培养在补充有10％(v/v)胎牛血清(fbs)、2mml-谷氨酰胺、l00u/ml青霉素和100μg/ml链霉素(gibco)的rpmi中1640培养基(gibco/lifetechnologies，grandisland，ny)中。已知yac-1细胞对nk细胞活性敏感且为nk细胞分析的良好靶。
从上述实施例10的小鼠的脾脏收获细胞。将细胞平皿接种在96孔v形底盘的rpmi1640培养基(gibco/lifetechnologies，grandisland，ny)中，该rpmi1640培养基补充有10％(v/v)胎牛血清(fbs)、2mml-谷氨酰胺、l00u/ml青霉素和100μg/ml链霉素(gibco)。在37℃下，以10μm钙黄绿素am(lifetechnologies)标记yac-1靶细胞1小时，然后以效应子：靶＝25：1或50：1的比例与脾脏细胞组合。在37℃下培育4小时后，收获不含细胞的上清液和并在荧光计上，在485nm的激发波和535nm的发射波处定量钙黄绿素释放。特异性细胞溶解百分比的测定方法为：％细胞溶解＝100x(er-sr)/(mr-sr)，其中er、sr和mr代表分别实验、自发性和最大钙黄绿素释放。自发性释放为由培育在单独的培养基(即，无效应子细胞存在)中的靶细胞发射的荧光，而最大释放系藉由以等体积的10％sds溶解靶细胞来测定。
与来自以对照组治疗的小鼠相比较，当小鼠已接受mgitrl三聚体-fc336b3的治疗时，来自经注射renca细胞小鼠的nk细胞表现出杀死yac-1靶细胞的能力增强。以抗-mgitr抗体dta-1治疗亦可增加杀死靶细胞的能力，但程度较336b3轻微(第14a图)。
renca细胞系的cd8+t细胞特异性第i类mhc肿瘤肽序列目前未知，因此使用renca细胞作为刺激剂。在37℃下，以25μg/ml丝裂霉素c(sigma-aldrich公司)处理renca细胞30分钟，清洗并以107个细胞/ml的密度再悬浮于含有10％fcs、2mml-谷氨酰胺和抗生素的rpmi-1640培养基中。在il-2(2ng/ml)的存在下，将脾细胞与经丝裂霉素处理的renca细胞共同培养，在37℃下培育5天，收获、计算的并依上述用于细胞毒性分析中。使用经钙黄绿素am标记的renca细胞作为靶，效应子：靶＝25：1。4小时后测定钙黄绿素释放并依上述计算特异性细胞溶解。
如第14b图所示，与来自以抗gitr抗体或对照抗体治疗的小鼠的细胞相比较，当老鼠已接受mgitrl三聚体-fc336b3治疗时，来自经注射renca细胞的小鼠的cd8+细胞毒性细胞显示出杀死renca靶细胞的能力提高。
实施例12
具有和不具有外源肽接头的hgitrl三聚体-fc蛋白的表征
以由氨基酸序列gggsggg(seqidno：57)所组成的外源肽接头取代该茎区(lqletak；seqidno：32)来产生人gitrl三聚体-fc(igg1)融合蛋白。此“具有接头的hgitrl三聚体-fc”构建体称为336b13(seqidno：62具有信号序列，而seqidno：63不具有信号序列)，并与hgitrl三聚体-fc336b11用于稳定性研究中。在三种不同ph值(5.5、6.0及6.5)的由20mm组氨酸、40mm氯化钠、5％蔗糖和0.01％聚山梨醇酯20所组成的缓冲液中配制蛋白质。将样本储存在室温下，安排在0、2周和3个月的时间点进行分析。
使用尺寸排阻色层分析法-高效液相色层分析法(sec-hplc)分析样本。此分析性分析系经由将蛋白物种藉由其相对大小分开，再经由评估样本中完整，单体蛋白相对于较高分子量蛋白质聚集体及/或较小蛋白质片段的丰度来定量蛋白质的相对纯度。将50μg蛋白质注射在tosohbiosciencestskg3000sw-xl尺寸排阻色层分析柱(7.8毫米内径×30厘米)上并使用waters2695separationsmodulehplc仪器运行分析。
表1
如表1所示，虽然在2周的时间点的聚集体中的变化相当小，hgitrl三聚体-fc336b11(具有天然茎区)显示出较hgitrl三聚体-fc336b13(含肽接头)更稳定。在所有的ph值下，336b11在2周的时间点确实具有较其在0时间点更少的聚集体。相反地，336b13(具有外源接头)在2周的时间点具有增加的聚集体比例(在所有的ph值下)。
亦使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析样本。此分析性分析系用于根据蛋白质的尺寸，无其他物理特性将其分开。一旦将蛋白质分开，可评估样本中的完整，单体蛋白相对于较高分子量蛋白聚集体及/或较小蛋白片段的量。将各样本的4μg蛋白质在非还原条件下，在4至20％sds-page凝胶上运行。使用typhoontrio成像仪(gehealthcare)检测凝胶带并使用imagequanttl(gehealthcare)软件藉由光密度分析法定量。在这些page凝胶上，主要条带为单体gitrl三聚体-fc蛋白，而较该主要条带更大的任何条带为聚集体，较该主要条带更小的任何条带为蛋白质片段。
表2
非还原的sds-page分析显示出在所有三种ph下，hgitrl三聚体-fc336b11(具有天然茎区)的主要凝胶带的百分比在两周内的变化很小(表2)。相反地，在所有三种ph下，hgitrl三聚体-fc336b13的主凝胶带(具有肽接头)的百分比降低约20％，而较高和较低分子量的条带对应增加(见表2)。
这些结果支持具有连接个别gitrl结构域的天然茎区的gitrl三聚体-fc融合蛋白较在个别gitrl结构域之间具有外源肽接头且不具有天然茎区的gitrl三聚体-fc融合蛋白更稳定的想法。
实施例13
藉由单链gitrl三聚体-fc蛋白抑制体内肿瘤生长-剂量研究
由于该单链gitrl三聚体-fc已被证明可有效抑制肿瘤生长，进行剂量范围研究。将小鼠结肠肿瘤系ct26.wt经由皮下植入(25,000个细胞/小鼠)balb/c小鼠中并允许肿瘤生长至平均大小为约115mm3。以30、12.5、6.25、3或0.5mg/kg的mgitrl三聚体-fc336b3治疗小鼠或不治疗(每组n＝10)。藉由腹膜内注射给予小鼠剂量，每周给药二次，共6剂。监控肿瘤生长并在指定的时间点以电子卡尺测量肿瘤体积。
第15a-15f图显示在各治疗组内的个别小鼠的肿瘤体积，而第15g图显示各治疗组的平均肿瘤体积。以mgitrl三聚体-fc336b3治疗时在各剂量，包括最低剂量水平0.5mg/公斤下均强烈抑制ct26.wt肿瘤的生长。如表3中所示，以30、12.5、6.25及3mg/kg的336b3治疗的老鼠中至少50％在第18天肿瘤已消退至检测不到的尺寸。即使在0.5mg/kg的最低剂量下，10只小鼠中有3只可观察到全部肿瘤消退。
表3
进行另外的实验以评估给药频率对藉由gitrl三聚体抑制肿瘤生长的效果。如上述，将ct26.wt肿瘤细胞经由皮下植入(25,000个细胞/小鼠)balb/c小鼠中并允许肿瘤生长至平均大小为约104mm3。以2.5mg/kg的mgitrl三聚体-fc336b3、12.5mg/kg的mgitrl三聚体-fc治疗小鼠或不治疗(每组n＝10)。以单剂量的2.5mg/kg、以2.5mg/kg的剂量每2周治疗一次、以2.5mg/kg的剂量每周治疗一次、以2.5mg/kg的剂量每周治疗二次或以12.5mg/kg的剂量每周治疗二次(仅3个剂量)来治疗小鼠。
第16a-16f图显示各治疗组内的个别小鼠的肿瘤体积，第16g图显示出各治疗组的平均肿瘤体积。以mgitrl三聚体-fc336b3进行的治疗在每个剂量间隔均强烈抑制ct26.wt肿瘤生长。如表4所示，以2.5mg/kg的336b3治疗的小鼠中至少20％在所有给药间隔下在第20天肿瘤已消退至检测不到的大小。即使是2.5mg/kg的单一336b3剂量亦强烈抑制肿瘤生长且有2只小鼠检测不到肿瘤。
表4
*小鼠仅接受3个剂量
这些结果表明单链gitrl三聚体作为免疫治疗剂的效力。在一般情况下，关于看到显著的抗肿瘤作用仅需要少量的gitrl三聚体-fc的这些结果是令人惊讶的，此外，以有限的剂量可见到显著的效果。这些结果出人意料，尤其是鉴于该初步数据表明336b3具有非线性pk且2mg/kg的剂量的半衰期仅约12小时的事实。
实施例14
藉由单链gitrl三聚体-fc蛋白抑制免疫细胞耗尽的小鼠体内肿瘤生长
进行实验以评估何种免疫细胞群参与藉由gitrl三聚体抑制肿瘤生长。为了耗尽体内特定细胞群方面，在植入肿瘤细胞前2天和1天，经由腹膜内注射给予balb/c小鼠抗cd4抗体(500ug/剂量)、抗cd8抗体(500ug/剂量)、抗cd4和抗cd8抗体的组合(500ug/每一剂量)、抗脱唾液酸基gm-1抗体(25μl)或对照组igg2抗体(lft-2；500ug/剂量)，然后在植入后1天给予额外注射，在本实验期间每周注射二次。将小鼠结肠肿瘤系ct26.wt经由皮下植入(30,000个细胞/小鼠)细胞耗尽的小鼠中。在植入后第7天以0.25mg/小鼠的mgitrl三聚体-fc336b3或对照抗体治疗小鼠(每组n＝10)。在第7天，根据细胞耗尽的小鼠的组别，肿瘤的平均大小是在约20至50mm3的范围内。藉由腹膜内注射每周给予小鼠剂量二次。监控肿瘤生长并在指定的时间点以电子卡尺测量肿瘤体积。
使用抗脱唾液酸基gm-1抗体来耗尽经治疗的小鼠中的nk细胞，虽然已知此抗体除了nk细胞外亦结合其他细胞。来自以抗脱唾液酸基gm-1抗体处理的小鼠的结果未显示出，因为这些老鼠生病了且在第19天之前全部被安乐死。
第17f图显示出每组小鼠的平均肿瘤体积，第17a至17e图显示出各组中的个别小鼠的肿瘤体积。如先前实验中所见者，以gitrl三聚体-fc336b3治疗可显著抑制肿瘤生长(第17b图)。耗尽cd4+细胞仅最低限度地降低gitrl三聚体-fc336b3的有效性(第17c图)。相反地，耗尽cd8+细胞可显著影响gitrl三聚体-fc336b3的有效性，其中在个别小鼠中所观察到的肿瘤体积非常类似于在以对照组治疗的小鼠中所见到的肿瘤体积(分别为第17d图和17a图)。同时耗尽cd4+和cd8+细胞的小鼠中可见到较以对照组治疗的小鼠中所见者更高水平的肿瘤生长(第17e图，与第17a图相比较)。
这些结果证明功能性cd8+细胞在gitrl三聚体-fc336b3的抗肿瘤活性中具主导作用。同时耗尽cd4+和cd8+细胞的小鼠中可见到的较高水平的肿瘤生长表明cd4+t细胞增强及/或为cd8+t细胞减少以336b3治疗的小鼠体内的肿瘤生长的能力所必需的。此结果指出功能性cd4+辅助t细胞对由gitrl三聚体-fc所诱导的抗肿瘤ctl活性效力的重要性。
实施例15
藉由单链gitrl三聚体-fc蛋白和抗pd-1抗体抑制体内肿瘤生长
将鼠腺癌细胞系renca细胞经由皮下植入(5×105个细胞/小鼠)balb/c小鼠中，在治疗的第一天(植入后第7天)肿瘤的平均大小为约52mm3。以12.5mg/kg的单链mgitrl三聚体-fc336b3、抗pd-1抗体、336b3和抗pd-1抗体的组合或对照抗体治疗小鼠(每组n＝20)。藉由腹膜内注射每周施用小鼠336b3两次，仅3个剂量并每周施用抗pd-1抗体两次，持续3周。监控肿瘤生长并以电子卡尺测量肿瘤体积。
如第18b图所示，以mgitrl三聚体-fc336b3治疗可在高比例的小鼠中强烈抑制renca肿瘤生长。如稍早的实施例所示，以336b3治疗不仅能够抑制肿瘤生长，亦能够诱导肿瘤消退，常消退至检测不到的水平。以单一药剂形式的抗pd-1抗体治疗时对于肿瘤的抑制较不成功(第18c图)。以gitrl三聚体-fc336b3和抗pd-1抗体的组合进行治疗的结果类似于以单一药剂形式的336b3进行治疗的结果(第18d图)。
这些结果支持单链gitrl三聚体为非常有效的免疫治疗剂的想法，即使是以单一药剂形式施用且仅施用很短的时间。此外，gitrl三聚体-fc蛋白的效力可进一步藉由将其与其他免疫治疗剂组合来增强。
实施例16
藉由单链gitrl三聚体-fc蛋白和抗pd-l1抗体抑制体内肿瘤生长
将小鼠结肠肿瘤系ct26.wt经由皮下植入(30,000个细胞/小鼠)balb/c小鼠中，在治疗的第一天(植入后第10天)肿瘤的平均大小为约105mm3。以0.25mg/鼠的单链mgitrl三聚体-fc336b3、抗pd-l1抗体、336b3和抗pd-l1抗体的组合或对照抗体治疗小鼠(每组n＝10-20)。藉由腹膜内注射每周施用小鼠336b3两次，仅3个剂量并每周施用抗pd-l1抗体两次，共3周。监控肿瘤生长并以电子卡尺测量肿瘤体积。
如第19b图所示，以mgitrl三聚体-fc336b3治疗可在高比例的小鼠中强烈抑制ct26.wt肿瘤生长。如稍早的实施例所示，以336b3治疗不仅能够抑制肿瘤生长，亦能够诱导肿瘤消退，常消退至检测不到的水平。以单一药剂形式的抗pd-l1抗体进行治疗时对肿瘤的抑制较不成功(第19c图)。以gitrl三聚体-fc336b3和抗pd-l1抗体的组合进行治疗的结果类似于以单一药剂形式的336b3进行治疗的结果(第19d图)。合并治疗的结果可能优于以单独的gitrl三聚体治疗一段较长的时间。
一种评估抗肿瘤记忆细胞群的存在及/或功能的方法为以新鲜肿瘤细胞重新挑战先前经过治疗的小鼠。使用先前以gitrl-fc336b3、抗mpd-l1抗体或336b3和抗mpd-l1抗体的组合治疗的小鼠(来自上述研究)进行重新挑战研究。以ct26.wt肿瘤细胞(30,000个细胞)重新挑战在第一次肿瘤注射后至少128天肿瘤完全消退且检测不到的小鼠。接受肿瘤重新挑战的小鼠在重新挑战前100天已接受最后一个治疗剂量。为初始balb/c小鼠(n＝10)注射ct26.wt肿瘤细胞(30,000个细胞)来作为对照组。监控肿瘤生长并在指定的时间点以电子卡尺测量肿瘤体积。数据是以平均值±s.e.m表示。
在初始小鼠中的ct26.wt肿瘤的平均肿瘤体积稳定地增长至第28天，平均肿瘤体积为约1750mm3。从先前的实验，先前接受抗pd-l1抗体治疗的小鼠中只有二只的肿瘤完全消退，但这二只小鼠显示出对肿瘤重新挑战完全免疫。先前接受gitrl-fc治疗的小鼠中有13只的肿瘤完全消退，而这些小鼠在重新挑战后只有2只长出肿瘤。其他11只小鼠显示出对肿瘤重新挑战完全免疫。此外，先前接受336b3和抗pd-l1抗体的组合治疗的小鼠有7只的肿瘤完全消退，而这些小鼠显示出对肿瘤挑战完全免疫。这些结果(如第28天的结果)显示于第19e图。
以gitrl-fc336b3(无论为单一药剂形式或与抗pd-l1抗体组合)治疗的小鼠在以ct26.wt肿瘤细胞重新挑战时似乎受到强烈保护。这些结果表明以gitrl-fc336b3(无论为单一药剂形式或与检查点抑制剂组合)治疗后免疫原性记忆的存在。
实施例17
藉由单链gitrl三聚体-fc蛋白和抗pd-1抗体抑制体内肿瘤生长
小鼠黑色素瘤细胞系b16-f10为最初在c57bl/6小鼠中发展出的不良免疫原性肿瘤且被认为反映了转移性肿瘤在人体内的不良免疫原性。这些细胞已显示出对数种不同类型的抗癌疗法无反应，因此，该b16-f10肿瘤被认为是“高门坎”模型。将b16-f10细胞经由皮下植入(5000个细胞/小鼠)c57bl/6小鼠中且在治疗第一天(植入后第8天)肿瘤的平均大小约为51mm3。以5mg/kg的单链mgitrl三聚体-fc336b3、10mg/kg的抗mpd-1抗体、336b3和抗mpd-1抗体的组合或对照抗体治疗小鼠(每组n＝10)。藉由腹膜内注射施用小鼠336b3、抗mpd-1抗体或对照抗体，每周两次。监控肿瘤生长并在指定的时间点以电子卡尺测量肿瘤体积。
第20e图显示出每组小鼠中的平均肿瘤体积，而第20a至20d图显示出各组中个别小鼠的肿瘤体积。虽然在b16-f10模型中以抗pd-1抗体进行的治疗对肿瘤生长无作用，以三聚体gitrl-fc336b3进行的治疗在此模型中显示出具有显著效力。当以每一组的平均肿瘤体积来检视结果时，使用336b6和抗pd-1抗体的组合似乎仅略为增加抗肿瘤活性。然而，当检视个别小鼠的结果时，很清楚地，使用336b3和抗pd-1的组合进行治疗可在50％经治疗的小鼠中明显抑制肿瘤生长(第20d图)。
进行追踪研究以在b16-f10肿瘤模型中评估gitrl三聚体-fc336b3的有效剂量范围。将b16-f10细胞经由皮下植入c57bl/6小鼠中且在治疗第一天肿瘤的平均大小约为84mm3。以0.5mg/kg的抗mgitr抗体dta-1、30、10、2.5、0.5和0.05mg/kg的单链mgitrl三聚体-fc336b3、两种不同的对照抗体或盐水治疗小鼠(每组n＝10)。藉由腹膜内注射每周施用小鼠一次336b3、抗体或盐水。监控肿瘤生长并以电子卡尺测量肿瘤体积。
第22图显示在研究结束(第18天)时肿瘤小于300mm3的小鼠的百分比。以gitrl三聚体-fc336b3治疗时可观察到每一测试剂量均寄抑制个别肿瘤的肿瘤生长，包括在0.05mg/kg的最低剂量下。此外，以10mg/kg治疗的组别中有3只小鼠的肿瘤完全消退，而以2.5mg/kg治疗的组别中有1只小鼠的肿瘤已经完全消退。
这些结果为单链gitrl三聚体的有效活性的进一步证据，即使是在被视为弱免疫原性的“高门坎”小鼠模型中评估。
实施例18
藉由单链ox40l三聚体-fc蛋白抑制体内肿瘤生长
将小鼠结肠肿瘤系ct26.wt经由皮下植入(30,000个细胞/小鼠)balb/c小鼠中。允许肿瘤生长7天，使平均大小达到约77mm3。以0.25mg/鼠的单链mox40l三聚体-fc338f2、激动剂抗ox40抗体、单链mgitrl三聚体-fc、激动剂抗gitr抗体dta-1或对照抗体治疗小鼠(每组n＝10)。每周给予小鼠剂量二次，共3个剂量。监控肿瘤生长并在指定的时间点以电子卡尺测量肿瘤体积。
如第21d和21e图所示，以mox40l三聚体-fc治疗会强烈抑制及/或防止ct26.wt肿瘤生长。以激动剂抗ox40抗体治疗亦抑制肿瘤生长，但程度较ox40l三聚体-fc分子轻微。藉由观察来自各组内的个别小鼠的结果可见到以ox40l三聚体-fc和ox40抗体治疗的肿瘤生长差异的更细微差别情形。如第21b图所示，以ox40l三聚体-fc分子治疗时，6/10的小鼠检测不到肿瘤，而以抗ox40抗体治疗的组别中只有一只小鼠具有检测不到肿瘤。
类似于使用gitrl三聚体-fc336b3所见到的结果，这些结果指明该单链ox40l三聚体-fc在作为免疫治疗剂时非常活跃且在抑制肿瘤生长方面可能较激动剂ox40抗体更有效。
实施例19
细胞因子的生产
评估以gitrl三聚体-fc、ox40l三聚体-fc蛋白、抗gitr抗体或抗ox40抗体治疗后的细胞因子生产。在第26天从上述实施例18的小鼠的脾脏收获细胞。在有或无肿瘤特异性cd8+t细胞肽ah-1的存在下培养细胞。48小时后，按照制造商的说明使用用于
如第23a至23l图所示，相对于来自以对照抗体治疗的小鼠的细胞因子量，几乎所有测量的来自以激动剂抗gitr或抗ox40抗体治疗的小鼠的细胞因子(il-2、il-4、il-5、il-6、il-10、il-13、mip-1b、fasl、gm-csf、scd137、颗粒溶解酶b)均大量生产。此与那些由经gitrl三聚体-fc或ox40l三聚体-fc蛋白治疗的小鼠生产的细胞因子量形成鲜明对比。相对于对照组，由经gitrl-fc或ox40l-fc治疗的小鼠生产的细胞因子量并未增加且在大多数情况下，该细胞因子量低于对照组。此外，来自经治疗的小鼠的血浆样本的初步分析显示出与经gitrl-fc或ox40l-fc治疗的小鼠相比较，以激动剂抗gitr或抗ox40抗体治疗的小鼠有类似的细胞因子生产增加的趋势。
这些结果指出与靶向gitr和ox40的激动剂抗体相比较，gitrl三聚体-fc和ox40l三聚体-fc蛋白对免疫功能的影响具有显著差异。值得注意的是，虽然以gitrl-fc和ox40l-fc蛋白治疗并未导致脾细胞生产的细胞因子量提升，以激动剂gitr和ox40抗体治疗后观察到一系列广泛的细胞因子显著提升是意料之外的免疫学结果，其指示正常免疫功能被大量破坏。许多被观察到在以激动剂抗体治疗后上调的细胞因子，包括il-4、il-5、il-6、il-10和il-13具有一些生物功能将趋向降低免疫系统启动该发展持久的抗肿瘤免疫反应所需的适当的th1型免疫反应的能力。重要的是，这些强力的细胞因子提升的量可促进不利的毒性(即，细胞因子风暴)，此毒性可降低该激动剂抗体的治疗指数。由于使用抗gitr抗体和抗ox40抗体二者的结果类似，此发现表明影响gitr或ox-40及可能的其他tnfr族成员的所有激动剂抗体可能有共通的“类别效应”。
实施例20
藉由单链gitrl三聚体-fc蛋白抑制体内肿瘤生长
将小鼠结肠肿瘤系ct26.wt经由皮下植入(30,000个细胞/小鼠)balb/c小鼠中。为了研究gitrl三聚体-fc蛋白对较大的，已建立的肿瘤细胞块的效果，令肿瘤生长至平均大小为约300mm3。以0.25mg/鼠的单链mgitrl三聚体-fc336b3、激动剂抗gitr抗体dta-1或对照抗体治疗小鼠(每组n＝17)。藉由腹膜内注射每周给予小鼠剂量两次，共3个剂量。监控肿瘤生长并以电子卡尺测量肿瘤体积。如果可能的话，追踪小鼠超过80天以评估长期存活。
第24a至c图显示各组中的个别小鼠直到第40天的肿瘤生长情形，而第24d图显示存活百分比。以mgitrl三聚体-fc336b3治疗的小鼠体内ct26.wt肿瘤生长被强烈抑制及/或防止。在至少50％经治疗的小鼠中，肿瘤已消退至尺寸小于治疗前的肿瘤大小(第24b图)。激动剂抗gitr抗体dta-1仅抑制少数经治疗的小鼠体内的肿瘤生长(第24c图)。在未经治疗的小鼠体内的肿瘤生长进展非常快速，在第28天前有15只小鼠被安乐死。与激动剂抗gitr抗体相比较，第24d图中显示的生存曲线清楚地证明gitrl三聚体-fc336b3的有效性。
这些结果指出单链gitrl三聚体具有作为免疫治疗剂的活性，甚至可对抗大的，已建立的肿瘤且在抑制肿瘤生长、使已建立的肿瘤消退和增加存活方面较激动剂gitr抗体更有效。
实施例21
藉由人gitrl三聚体-fc蛋白抑制人化小鼠体内的肿瘤生长
使用人化小鼠模型来研究以人gitrl三聚体-fc蛋白治疗人肿瘤的效力。从jackson实验室取得人化小鼠。这些小鼠系经由将人造血干细胞(cd34+细胞)注射入经放射线照射的nsg小鼠中来创建。15周后，藉由流式细胞术确认存有成熟的人淋巴细胞。经由皮下注射为每只小鼠注射源自患者的黑色素瘤细胞(omp-m9，75,000个细胞/小鼠)。令肿瘤生长16天，直到其平均体积达到约60mm3。将荷瘤小鼠随机分成2组(每组n＝3只小鼠)。以对照蛋白或hgitrl三聚体-fcomp-336b11治疗荷瘤小鼠。每周给予小鼠二次10mg/kg的剂量。监控肿瘤生长并在指定的时间点以电子卡尺测量肿瘤体积。
如第25图所示，与对照组相比较，以人gitrl三聚体-fc治疗的小鼠中的肿瘤生长受抑制。这些结果显示出人gitrl三聚体-fcomp-336b11能有效扩增人淋巴细胞的抗肿瘤免疫反应并促进抑制人体内的肿瘤生长。因此，这些结果证明携带源自患者的异种移植物的人化小鼠模型可用于与以替代的小鼠gitrl三聚体-fc蛋白和小鼠肿瘤模型进行的临床前研究并行研究人gitrl三聚体-fc分子。
应理解的是，本文所描述的实施例和实施方式仅用于说明目的，鉴于其各种修改或变化将被建议给本技术领域的技术人员且将包含在本申请案的精神和范围内。
本发明所引用的所有出版物、专利、专利申请案、网站和登录编号/数据库序列(包括多核苷酸和多肽序列)的全部内容以引用方式并入本发明以用于所有目的，其程度如同个别出版物、专利、专利申请案、网站和登录编号/数据库序列系被具体且单独地指明以引用方式并入本发明中。
本申请案中所公开的序列为：
人gitrl(tnfsf18)氨基酸序列(seqidno：1)
人gitrl信号/锚定区及胞外结构域氨基酸序列(seqidno：2)
人gitrl胞外结构域氨基酸序列(seqidno：3)
具有信号序列(下方划线)的人单链gitrl三聚体氨基酸序列(seqidno：4)
不具有信号序列的人单链gitrl三聚体氨基酸序列(seqidno：5)
具有信号序列(下方划线)的336b11人单链gitrl三聚体-fc(igg1)氨基酸序列(seqidno：6)
不具有信号序列的336b11人单链gitrl三聚体-fc(igg1)氨基酸序列(seqidno：7)
具有信号序列(下方划线)的336b14人单链gitrl三聚体-fc(igg2)氨基酸序列(seqidno：8)
不具有信号序列的336b14人单链gitrl三聚体-fc(igg2)氨基酸序列(seqidno：9)
人igg1fc区(seqidno：10)
人igg1fc区(seqidno：11)
人igg1fc区(seqidno：12)
人igg2fc区(seqidno：13)
人igg2fc区(seqidno：14)
人igg1重链恒定区(seqidno：15)
人igg2重链恒定区(seqidno：16)
人igg3重链恒定区(seqidno：17)
人igg4重链恒定区(seqidno：18)
人gitrl核苷酸序列(seqidno：19)
人gitrl信号/锚定区和胞外结构域核苷酸序列(seqidno：20)
人gitrl胞外结构域核苷酸序列(seqidno：21)
不具有信号序列的人单链gitrl三聚体核苷酸序列(seqidno：22)
具有信号序列的人单链gitrl三聚体核苷酸序列(seqidno：23)
336b11人单链gitrl三聚体-fc(igg1)核苷酸序列(seqidno：24)
336b14人单链gitrl三聚体-fc(igg2)核苷酸序列(seqidno：25)
人igg2fc区(13a版)(seqidno：26)
人igg2fc区(13b版)(seqidno：27)
人igg2fc区(13a版)(seqidno：28)
人igg2fc区(13a版)(seqidno：29)
人igg2fc区(13b版)(seqidno：30)
人igg2fc区(13b版)(seqidno：31)
人gitrl茎区(seqidno：32)
lqletak
人gitrltnf同源结构域(seqidno：33)
接头(seqidno：34)
esggggvt
接头(seqidno：35)
lesggggvt
接头(seqidno：36)
graqvt
接头(seqidno：37)
wraqvt
接头(seqidno：38)
argraqvt
flag标签(seqidno：39)
dykddddk
人ox40l(tnfsf4)氨基酸序列(seqidno：40)
人ox40l跨膜及胞外结构域氨基酸序列(seqidno：41)
人ox40l胞外结构域氨基酸序列(seqidno：42)
具有信号序列(下方划线)的人单链ox40l三聚体氨基酸序列(seqidno：43)
不具有信号序列的人单链ox40l三聚体氨基酸序列(seqidno：44)
具有信号序列(下方划线)的338f3人单链ox40l三聚体-fc(igg1)氨基酸序列(seqidno：45)
不具有信号序列的338f3人单链ox40l三聚体-fc(igg1)氨基酸序列(seqidno：46)
具有信号序列(下方划线)的人单链ox40l三聚体-fc(igg2)氨基酸序列(seqidno：47)
不具有信号序列的人单链ox40l三聚体-fc(igg2)氨基酸序列(seqidno：48)
人ox40l核苷酸序列(seqidno：49)
人ox40l胞外结构域核苷酸序列(seqidno：50)
具有信号序列的人单链ox40l三聚体核苷酸序列(seqidno：51)
不具有信号序列的人单链ox40l三聚体核苷酸序列(seqidno：52)
人单链ox40l-fc(igg1)三聚体核苷酸序列(seqidno：53)
ah-1肽(seqidno：54)
spsyvyhqf
ox40l茎区(seqidno：55)
qvshryp
ox40ltnf同源结构域(seqidno：56)
接头(seqidno：57)
gggsggg
人igg1fc区(13a版)(seqidno：58)
人igg1fc区(13b版)(seqidno：59)
人igg1fc区(13a版)(seqidno：60)
人igg1fc区(13b版)(seqidno：61)
具有信号序列(下方划线)的具有接头的336b13人单链gitrl三聚体-fc(igg1)(seqidno：62)
不具有信号序列的具有接头的336b13人单链gitrl三聚体-fc(igg1)(seqidno：63)
不具有茎区的人gitrl胞外结构域氨基酸序列(seqidno：64)
具有信号序列(下方划线)的人单链gitrl三聚体(2个茎区)氨基酸序列(seqidno：65)
不具有信号序列的人单链gitrl三聚体(2个茎区)氨基酸序列(seqidno：66)
不具有茎区的人ox40l胞外结构域氨基酸序列(seqidno：67)
具有信号序列(下方划线)的人单链ox40l三聚体(2个茎区)氨基酸序列(seqidno：68)
不具有信号序列的人单链ox40l三聚体(2个茎区)氨基酸序列(seqidno：69)
不具有信号序列的338f4人单链ox40l三聚体氨基酸序列(seqidno：70)
不具有信号序列的338f5人单链ox40l三聚体氨基酸序列(seqidno：71)
不具有信号序列的338f6人单链ox40l三聚体氨基酸序列(seqidno：72)
不具有信号序列的338f5人单链ox40l三聚体核苷酸序列(seqidno：73)
ox40l茎区变体1(seqidno：74)
alqvshryp
ox40l茎区变体2(seqidno：75)
shryp
ox40l茎区变体3(序列号：76)
hryp
人ox40l胞外结构域氨基酸序列变体1(seqidno：77)
人ox40l胞外结构域氨基酸序列变体2(seqidno：78)
人ox40l胞外结构域氨基酸序列变体3(seqidno：79)
具有信号序列(下方划线)的338f5人单链ox40l三聚体-fc(igg1)氨基酸序列(seqidno：80)
不具有信号序列的338f5人单链ox40l三聚体-fc(igg1)氨基酸序列(seqidno：81)
人cd40l(tnfsf5)氨基酸序列(seqidno：82)
人cd40l胞外结构域氨基酸序列(seqidno：83)
具有茎片段1(aa113-261)的人cd40l胞外结构域(seqidno：84)
不具有信号序列的人单链cd40l三聚体氨基酸序列(seqidno：85)
不具有信号序列的人单链cd40l三聚体核苷酸序列(seqidno：86)
人cd40l锚定区和胞外结构域氨基酸序列(seqidno：87)
具有信号序列(下方划线)的人单链cd40l三聚体氨基酸序列(seqidno：88)
具有信号序列(下方划线)的人单链cd40l三聚体-fc(igg1)氨基酸序列(seqidno：89)
不具有信号序列的人单链cd40l三聚体-fc(igg1)氨基酸序列(seqidno：90)
具有信号序列(下方划线)的人单链cd40l-fc三聚体(igg2)氨基酸序列(seqidno：91)
不具有信号序列的人单链cd40l三聚体-fc(igg2)氨基酸序列(seqidno：92)
人cd40l茎区(seqidno：93)
人cd40ltnf同源结构域(seqidno：94)
不具有茎区的人cd40l胞外结构域氨基酸序列(seqidno：95)
具有信号序列(下方划线)的人单链cd40l三聚体(2个茎区)氨基酸序列(seqidno：96)
不具有信号序列的人单链cd40l三聚体(2个茎区)氨基酸序列(seqidno：97)
人cd40l茎区-片段1(seqidno：98)
mqkgdq
人cd40l茎区-片段2(seqidno：99)
femqkgdq
人cd40l茎区-片段3(seqidno：100)
emqkgdq
人cd40l茎区-片段4(seqidno：101)
qkgdq
人cd40l茎区-片段5(seqidno：102)
kgdq
具有茎片段2(aa111-261)的人cd40l胞外结构域(seqidno：103)
具有茎片段3(aa112-261)的人cd40l胞外结构域(seqidno：104)
具有茎片段4(aa114-261)的人cd40l胞外结构域(seqidno：105)
具有茎片段5(aa115-261)的人cd40l胞外结构域(seqidno：106)
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