本发明涉及医药领域，特别是水栀子中两个具有肾细胞保护活性的一种水栀子单萜类化合物crocusatinn和jasminosideb制备方法及应用。
背景技术：
水栀子为茜草科(rubiaceae)栀子属植物水栀子(gardeniajasminoidesvar.radicans)的干燥成熟果实。在我国民间，水栀子根、叶及果实可入药，历代本草学著作，如《雷公炮制论》，《八闽通志》等均有关于水栀子的相关记载，具有解热凉血、镇静止痛、疏风解湿的功效。水栀子分布广泛，在我国长江以南的多个省区均有自然分布或人工栽培，主要产区在湖北、湖南、四川、江西、福建、浙江等省。化学成分研究表明水栀子主要含有环烯醚萜类和单萜类化合物，其中单萜类化合物为水栀子中代表性的活性成分，具有重要而广泛的生物活性如抗炎、抗氧化、保肝及酪氨酸酶抑制作用等。本发明采用硅胶柱色谱法富集目标成分，再用硅胶、ods、凝胶等柱色谱法结合制备液相分离纯化，建立了水栀子中两个痕量的环香叶烷型单萜(crocusatinn和jasminosideb)的快速制备方法。该方法分离效率高、时间短，溶剂消耗量小，样品回收率高，得到的目标成分纯度高。化合物crocusatinn为未见文献报道的新化合物。
脓毒症是一种复杂的临床病症，其特征是刺激与感染引起的全身炎症反应，这常常导致广泛的组织损伤和多器官功能障碍。急性肾损伤(aki)作为脓毒症临床常见器官功能障碍，是导致患者死亡的重要原因。目前临床上广泛使用的肾细胞保护药物主要包括hmg-coa还原酶抑制剂、血管紧张素转换酶抑制剂(acei)和血管紧张素ⅱ受体拮抗剂(arb)等。由于多数合成药基于单靶点的作用，对于肾损伤的复杂的病因，很难取得理想的治疗效果。中草药在细胞保护方面的应用历史悠久，从中草药中寻找具有肾细胞保护的活性物质，研制特异性强、毒副作用小的新型药物具有重要的社会效益和经济效益。但至今未见有从水栀子中提取环香叶烷型单萜类化合物，并用于制备肾细胞保护性药物的公开报导。
技术实现要素：
针对上述情况，为克服现在技术缺陷，本发明之目的就是提供一种水栀子单萜类化合物crocusatinn和jasminosideb制备方法及应用，可有效解决快速从水栀子中制备具有肾细胞保护活性的环香叶烷型单萜类化合物，并制备保护肾细胞活性药物的问题。
本发明解决的技术方案是，水栀子单萜类化合物crocusatinn和jasminosideb制备方法，所述的单萜类化合物crocusatinn和jasminosideb分子结构式(化学结构式)为：
其制备方法包括如下步骤：
(1)、制备水栀子粗提取物，方法是，将水栀子粉碎，过40目筛，每次用水栀子重量体积6-9倍量的体积浓度为50％的丙酮提取3次，每次1-3min，合并丙酮提取液，减压浓缩至50℃相对密度1.1-1.5的浓缩物，加浓缩物体积3-5倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为水栀子粗提取物；所述的重量体积是指固体物以g计，液体物以ml计，以下同；
(2)、液相分离纯化，方法是：将乙酸乙酯萃取部位的浸膏经硅胶柱色谱初步分离，采用体积比为50:1、30:1、8:1的二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，流速为15ml·min-1，每200ml为1个流份，收集二氯甲烷-甲醇体积比为30:1和8:1洗脱流份；二氯甲烷-甲醇体积比为30:1的洗脱流份经ods柱色谱进一步分离，采用体积比为20：80、30：70的甲醇-水系统进行梯度洗脱，流速为17ml·min-1，每170ml为1个流份，收集甲醇-水体积比为30:70洗脱流份，甲醇-水体积比为30:70洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为5:95的乙腈-水进行洗脱，流速为3ml·min-1，收集洗脱液，浓缩干燥，得crocusatinn；
二氯甲烷-甲醇体积比为8:1洗脱流份经硅胶柱色谱进一步分离，采用体积比为10:1，5:1的二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，流速为5ml·min-1，每50ml为1个流份，收集二氯甲烷-甲醇体积比为10:1洗脱流份，二氯甲烷-甲醇体积比为10:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为35:65的甲醇-水进行洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得jasminosideb。
本发明方法稳定可靠，效率高，可快速从水栀子中分离得到两个环香叶烷型单萜类化合物crocusatinn和jasminosideb，并经活性试验表明对脂多糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞nrk52e凋亡具有明显的保护作用，有效用于制备治疗各种原因引起的肾损伤的药物，开拓了水栀子的药用价值和商业价值，经济和社会效益显著。
具体实施方式
以下结合实际情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明制备方法在具体实施中可由以下实施例给出。
实施例1
本发明在具体实施中，一种水栀子单萜类化合物crocusatinn和jasminosideb制备方法，包括以下步骤：
(1)制备水栀子粗提取物，方法是，水栀子5.12kg粉碎，过40目筛，每次用水栀子重量9倍量的体积浓度为50％的丙酮组织破碎提取3次，每次1min，合并丙酮提取液，减压浓缩至50℃相对密度1.2的浓缩物，加浓缩物重量体积3倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为水栀子粗提取物；
(2)、对水栀子粗提取物液相分离纯化，方法是：水栀子粗提取物80.06g，用100-200目硅胶80g拌样，加入含有100-200目硅胶800g的硅胶柱中，采用体积比为50:1，30:1，8:1的二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，流速为15ml·min-1，每200ml为1个流份，收集二氯甲烷-甲醇体积比为30:1和8:1洗脱流份；二氯甲烷-甲醇体积比为30:1洗脱流份经ods柱色谱进一步分离，采用体积比为20:80，30:70的甲醇-水系统进行梯度洗脱，流速为17ml·min-1，每170ml为1个流份，收集甲醇-水体积比为30:70洗脱流份；甲醇-水体积比为30:70洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为5:95的乙腈-水进行洗脱，流速为3ml·min-1，收集洗脱液，用旋转蒸发仪干燥，得无色蜡状固体crocusatinn(化合物1)；
二氯甲烷-甲醇体积比为8:1洗脱流份经硅胶柱色谱进一步分离，采用体积比为10:1，5:1的二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，流速为5ml·min-1，每50ml为1个流份，收集二氯甲烷-甲醇体积比为10:1洗脱流份，二氯甲烷-甲醇体积比为10:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为35:65的甲醇-水进行洗脱，收集洗脱液，用旋转蒸发仪干燥，得到无色蜡状固体jasminosideb(化合物2)。
化合物结构鉴定
上述两种固体，经过核磁共振光谱(1h-nmr、13c-nmr、hsqc、hmbc、1h-1hcosy、noesy)及高分辨质谱(hr-esi-ms)光谱技术鉴定了其化学结构：
化合物1，无色蜡状固体，易溶于甲醇。[α]2d0-103.281(c0.7434,ch3oh)，经hresims测定得到准分子离子峰[m+na]+m/z：223.0942(c10h16o4na计算值为223.0940)，得出其分子式为c10h16o4。1hnmr(500mhz,cd3od)中，δ3.83(1h,t,j＝3.9hz,h-4)和3.79(1h,ddd,j＝12.6,7.6,3.8hz,h-3)为连氧碳上氢信号；δ1.75(1h,t,j＝12.5hz,h-2a)和1.44(1h,dd,j＝12.5,2.8hz,h-2b)为亚甲基氢信号；δ1.82(3h,s,h-10)，1.20(3h,s,h-8)和1.09(3h,s,h-9)为甲基氢信号。13cnmr(125mhz,cd3od)中共出现10个碳信号，结合dept谱可知，结构中有3个甲基碳信号：δ29.7(c-9)，27.9(c-8)和19.4(c-10)；1个亚甲基碳信号：δ41.2(c-2)；2个次甲基碳信号：δ71.3(c-4)和67.6(c-3)；4个季碳信号：δ173.6(c-7)，140.2(c-6)，132.0(c-5)和36.4(c-1)。通过分析1h-1hcosy谱中交叉峰信号可知，c-2/c-3/c-4处于同一个自旋偶合体系中。在hmbc谱中，h-4与c-2，c-3，c-5，c-6和c-10有远程相关，h-8，h-9均与c-1，c-2和c-6有远程相关，h-10与c-4，c-5，c-6和c-7有远程相关，提示该化合物7位为羧基，c-5和c-6形成双键，c-1上有偕二甲基相连。由h-3和h-4的偶合常数可以确定c-3和c-4上所连羟基分别处于平伏键和竖直键上，noe谱中，h-4与h-3，h-3与h-2β分别有noe关系，也验证了这一结论。cd谱中，在232nm处出现一个负的cotton效应，提示c-4为s构型。综合以上分析，可以得出化合物结构为(3r,4s)-3,4-二羟基-1,1,5三甲基环己烯-5-烯酸，经文献检索发现为一新化合物，命名为crocusatinn。
化合物2，无色蜡状固体，易溶于甲醇。经hresims测定得到准分子离子峰[m+h]+m/z：347.1700(c16h27o8计算值为347.1710)，得出其分子式为c16h27o8。1hnmr(500mhz,cd3od)中，δ6.28(1h,s,h-4)为双键氢信号。高场区，δ4.35(1h,d,j＝7.8hz,h-1')为糖端基氢信号，结合13cnmr(125mhz,cd3od)中出现一组吡喃葡萄糖的特征信号(δ104.3，78.1，78.0，75.1，71.6和62.8)，推测分子中含有一个β-d-吡喃葡萄糖基；δ1.15(3h,s,h-8)和1.03(3h,s,h-9)为甲基氢信号。13cnmr(125mhz,cd3od)中共出现16个碳信号，除去一套葡萄糖碳信号外，还有10个碳信号，且多数为饱和碳信号，提示该化合物可能为一单萜苷类化合物；单萜片段为：δ202.8，164.2，125.2，71.6，62.1，50.6，50.0，36.3，29.3和27.4)。以上数据与文献中jasminosideb基本一致，鉴定该化合物为jasminosideb。
表1化合物1和2的核磁数据
anmrspectroscopicdatawererecordedincd3odat500mhz(1hnmr)and125mhz(13cnmr)
实施例2
本发明在具体实施中，一种水栀子单萜类化合物crocusatinn和jasminosideb制备方法，包括以下步骤：
(1)制备水栀子粗提取物，方法是，将栀子5.08kg粉碎，过40目筛，每次用水栀子重量7倍量的体积浓度为50％的丙酮组织破碎提取3次，每次3min，合并丙酮提取液，减压浓缩至50℃相对密度1.5的浓缩物，得浓缩物，加浓缩物体积5倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为水栀子粗提取物；
(2)水栀子粗提取物液相分离纯化，方法是：水栀子粗提取物78.15g，用100-200目硅胶80g拌样后，加入含有100-200目硅胶800g的硅胶柱中，采用体积比为50:1，30:1，8:1的二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，流速为15ml·min-1，每200ml为1个流份，收集二氯甲烷-甲醇体积比为30:1和8:1洗脱流份；二氯甲烷-甲醇体积比为30:1洗脱流份经ods柱色谱进一步分离，采用体积比为20：80，30：70的甲醇-水系统进行梯度洗脱，流速为17ml·min-1，每170ml为1个流份，收集甲醇-水体积比为30:70洗脱流份；甲醇-水体积比为30:70洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为5:95的乙腈-水进行洗脱，流速为3ml·min-1，收集洗脱液，用旋转蒸发仪干燥，得到无色蜡状固体crocusatinn(化合物1)；
二氯甲烷-甲醇体积比为8:1洗脱流份经硅胶柱色谱进一步分离，采用体积比为10:1，5:1的二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，流速为5ml·min-1，每50ml为1个流份，收集二氯甲烷-甲醇体积比为10:1洗脱流份，二氯甲烷-甲醇体积比为10:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为35:65的甲醇-水进行洗脱，收集洗脱液，用旋转蒸发仪干燥，得到无色蜡状固体jasminosideb(化合物2)。
化合物的结构鉴定
上述两种粉末经过核磁共振(1h-nmr、13c-nmr、hsqc、hmbc、1h-1hcosy、noesy)及高分辨率质谱(hr-esi-ms)等光谱学技术进行鉴定(鉴定过程同实施例1中的化合物的结构鉴定)，其分别为crocusatinn和jasminosideb。
实施例3
本发明在具体实施中，一种水栀子单萜类化合物crocusatinn和jasminosideb制备方法，包括以下步骤：
(1)制备水栀子粗提取物，方法是，将水栀子5.04kg粉碎，过40目筛，每次用水栀子重量6倍量的体积浓度为50％的丙酮组织破碎提取3次，每次2min，合并丙酮提取液，减压浓缩至50℃相对密度1.3的浓缩物，加浓缩物体积4倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为水栀子粗提取物；
(2)水栀子粗提取物液相分离纯化，方法是：水栀子粗提取物79.54g，用100-200目硅胶80g拌样后，加入含有100-200目硅胶800g的硅胶柱中，采用体积比为50:1，30:1，8:1的二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，流速为15ml·min-1，每200ml为1个流份，收集二氯甲烷-甲醇体积比为30:1和8:1洗脱流份；二氯甲烷-甲醇体积比为30:1洗脱流份经ods柱色谱进一步分离，采用体积比为20:80，30:70的甲醇-水系统进行梯度洗脱，流速为17ml·min-1，每170ml为1个流份，收集甲醇-水体积比为30:70洗脱流份；甲醇-水体积比为30:70洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为5:95的乙腈-水进行洗脱，流速为3ml·min-1，收集洗脱液，用旋转蒸发仪干燥，得无色蜡状固体crocusatinn(化合物1)；
二氯甲烷-甲醇体积比为8:1洗脱流份经硅胶柱色谱进一步分离，采用体积比为10:1，5:1的二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，流速为5ml·min-1，每50ml为1个流份，收集二氯甲烷-甲醇体积比为10:1洗脱流份；二氯甲烷-甲醇体积比为10:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为35:65的甲醇-水进行洗脱，收集洗脱液，用旋转蒸发仪干燥，得无色蜡状固体jasminosideb(化合物2)。
化合物的结构鉴定
上述两种粉末经过核磁共振(1h-nmr、13c-nmr、hsqc、hmbc、1h-1hcosy、noesy)及高分辨率质谱(hr-esi-ms)等光谱学技术进行鉴定(鉴定过程同实施例1中的化合物的结构鉴定)，其分别为crocusatinn和jasminosideb。
实施例4
本发明在具体实施中，一种水栀子单萜类化合物crocusatinn和jasminosideb制备方法，包括以下步骤：
(1)制备水栀子粗提取物，方法是，将水栀子5.07kg粉碎，过40目筛，每次用水栀子重量8倍量的体积浓度为50％的丙酮组织破碎提取3次，每次1.5min，合并丙酮提取液，减压浓缩至50℃相对密度1.4的浓缩物，，得浓缩物，加浓缩物体积4倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为水栀子粗提取物；
(2)水栀子粗提取物液相分离纯化，方法是：水栀子粗提取物79.12g，用100-200目硅胶80g拌样后，加入含有100-200目硅胶800g的硅胶柱中，采用体积比为50:1，30:1，8:1的二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，流速为15ml·min-1，每200ml为1个流份，收集二氯甲烷-甲醇体积比为30:1和8:1洗脱流份；二氯甲烷-甲醇体积比为30:1洗脱流份经ods柱色谱进一步分离，采用体积比为20：80，30：70的甲醇-水系统进行梯度洗脱，流速为17ml·min-1，每170ml为1个流份，收集甲醇-水体积比为30:70洗脱流份；甲醇-水体积比为30:70洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为5:95的乙腈-水进行洗脱，流速为3ml·min-1，收集洗脱液，用旋转蒸发仪干燥，得无色蜡状固体crocusatinn(化合物1)；
二氯甲烷-甲醇体积比为8:1洗脱流份经硅胶柱色谱进一步分离，采用体积比为10:1，5:1的二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，流速为5ml·min-1，每50ml为1个流份，收集二氯甲烷-甲醇体积比为10:1洗脱流份；二氯甲烷-甲醇体积比为10:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为35:65的甲醇-水进行洗脱，收集洗脱液，用旋转蒸发仪干燥，得无色蜡状固体jasminosideb(化合物2)。
化合物的结构鉴定
上述两种粉末经过核磁共振(1h-nmr、13c-nmr、hsqc、hmbc、1h-1hcosy、noesy)及高分辨率质谱(hr-esi-ms)等光谱学技术进行鉴定(鉴定过程同实施例1中的化合物的结构鉴定)，其分别为crocusatinn和jasminosideb。
本发明方法稳定可靠，原料丰富，易生产制备，所提取分离的crocusatinn和jasminosideb具有抑制脂多糖(lps)诱导的大鼠肾小管上皮细胞(nrk52e)的凋亡，用于在制备肾细胞保护活性药物中的应用，并经试验，取得了非常好的有益技术效果，有关实验资料如下：
1.大鼠肾小管上皮细胞nrk52e培养
nrk52e细胞培养于37℃、含5％co2的培养箱中培养，培养基为dmem高糖培养基(含10％胎牛血清，100u·ml-1青霉素和100μg·ml-1链霉素)，两天换液一次。当细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面时，用0.25％胰蛋白酶消化，传代。
2.mtt法检测化合物对脂多糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞的保护作用
以培养基将细胞分散，使成为密度为2×104cell·ml-1的单细胞悬液，并以每孔0.2ml接种于96孔板中，培养24h后，将细胞分为对照组、模型组及不同用药组，正常组加入等量溶剂，模型组加入浓度为1mg·ml-1的lps溶液(终浓度为1μg·ml-1)，不同用药组加入浓度为0.1,1,10,50,100μm的待测化合物和浓度为1μg·ml-1的脂多糖。培养24h后每孔加入mtt溶液(5mg·ml-1)20μl，37℃继续培养4小时，小心吸净培养液，每孔加入150μldmso，震荡10分钟，使结晶物完全溶解。以dmso调零，用酶标仪在490nm下测定各孔的吸光度值(a)，用下面公式计算药物对细胞的抑制率，根据计算得到的各浓度的抑制率通过spss18.0软件处理得到半数有效浓度(ec50)，重复测试3次，取平均值为最终结果。
3.结论
通过mtt法检测crocusatinn和jasminosideb对lps诱导的nrk52e细胞凋亡的影响，ec50值分别为145.7nm和1.2μm。
由上述实验表明，本发明制备出的crocusatinn和jasminosideb可以有效抑制lps诱导的nrk52e细胞凋亡，开辟了水栀子用于肾细胞保护作用药物的新用途，是肾细胞保护作用药物上的创新，有显著的经济和社会效益。